METODICHEMETODICHE NEL LABORATORIO NEL LABORATORIO CHIMICOCHIMICO--CLINICOCLINICOCHIMICOCHIMICO--CLINICOCLINICO

SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO

TURBIDIMETRIA/NEFELOMETRIA

FLUORIMETRIA

SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO

FOTOMETRIA DI EMISSIONE A FIAMMA

RIFLETTANZA

LUMINESCENZA

ELETTRODI A VETRO/IONOSELETTIVI

COULOMBOMETRIA

VOLTAMMETRIA ANODICA DI STRIPPING

Ecc ecc ecc

TECNICHE IMMUNOCHIMICHETECNICHE ELETTROFORETICHE

Non sono di per sé delle tecniche analitiche, ma sono spesso il

presupposto iniziale per l’applicazione di una successiva metodica

strumentale di determinazione

METODI DIRETTI

METODI DI SEPARAZIONE

Campione con composizione costante METODI DIRETTI

di determinazione specie analitiche

Se, però, c’è interferenza di altre sostanze, o il campione

non è adeguato al procedimento diretto

Metodi di separazione

Passaggio di molecole di piccole dimensioni attraverso una

membrana permeabile per queste sostanze, ma non per le

macromolecole

DIALISI

METODI METODI DIDI SEPARAZIONESEPARAZIONE

METODI METODI DIDI SEPARAZIONESEPARAZIONE

“PIERCE”

Utilizzo di membrane semipermeabili (o permeabili

selettivamente) che consentono il passaggio, durante

centrifugazione, solo ad acqua e soluti a basso peso

molecolare, trattenendo quelli di dimensioni maggiori (“CUT-

OFF”)

Utile metodo per CONCENTRARE liquidi biologici (urine, liquor, ecc), per poter

successivamente effettuare analisi elettroforetiche, dosaggi, ecc.

METODI METODI DIDI SEPARAZIONESEPARAZIONE

ULTRAFILTRAZIONE

successivamente effettuare analisi elettroforetiche, dosaggi, ecc.

Consente l’allontanamento di una sostanza insolubile da un mezzo liquido, per

procedere al recupero della fase solida o di quella liquida o di entrambe

• Uso di carta da filtro

• Filtrazione sotto vuoto (con filtro Buechner)

• Filtrazione a permeabilità selettiva (sia sotto vuoto o con leggera pressione sul filtro)

METODI METODI DIDI SEPARAZIONESEPARAZIONE

FILTRAZIONE

Con filtri a porosità variabile si possono selezionare i componenti di una sospensione in funzione delle

dimensioni (virus, batteri, cellule) o del peso molecolare.

CENTRIFUGAZIONE

In un campo centrifugo applicato (maggiore del campo gravitazionale terrestre!!), le

particelle possono essere separate poiché sedimentano con velocità diversa a

seconda delle diverse caratteristiche di densità, dimensione e forma.

METODI METODI DIDI SEPARAZIONESEPARAZIONE

In campo chimico-clinico, la centrifugazione è impiegata soprattutto per la

separazione di solidi da liquidi (es. parte corpuscolata del sangue dal plasma, cellule o

microcristalli delle urine, ecc.)

La velocità di sedimentazione dipende dal campo centrifugo applicato (G)

METODI METODI DIDI SEPARAZIONESEPARAZIONE

RCF = 1.118 x 10-5 (rpm)2 · r

ULTRACENTRIFUGAZIONE: la sedimentazione di molecole proteiche o di acidi nucleici

richiede l’applicazione di una forza centrifuga molto elevata (da 100.000 a 500.000 g!!!!!)

• PICCOLE CENTRIFUGHE DA BANCO (fino a 6-7000 g)(sedimentazione rapida

campioni di sangue)

• CENTRIFUGHE REFRIGERATE A GRANDE CAPACITA’ (fino a 6-7000 g, da

bilanciare accuratamente; per eritrociti, nuclei, cloroplasti ecc)

METODI METODI DIDI SEPARAZIONESEPARAZIONE

TIPI DI CENTRIFUGHE

bilanciare accuratamente; per eritrociti, nuclei, cloroplasti ecc)

• CENTRIFUGHE REFRIGERATE AD ALTA VELOCITA’ (fino a 60-70000 g, raccolta di

microorganismi, organuli cellulari e proteine dopo precipitazione con ammonio solfato)

• ULTRACENTRIFUGHE (ANALITICHE O PREPARATIVE) (fino a 600.000 g, per

deproteinizzazione dei fluidi, separazione lipoproteine dal plasma ecc.)

METODI METODI DIDI SEPARAZIONESEPARAZIONE

METODI METODI DIDI SEPARAZIONESEPARAZIONE

Passaggio della miscela attraverso un materiale poroso, capace di

trattenere molecole a basso peso: ottimo metodo per il desalting o

per separare molecole con grande differenza di peso molecolare (lo

ritroveremo nella cromatografia)

METODI METODI DIDI SEPARAZIONESEPARAZIONE

GEL FILTRAZIONE

Passaggio della miscela attraverso un materiale poroso, capace di

trattenere molecole a basso peso: ottimo metodo per il desalting o

per separare molecole con grande differenza di peso molecolare (lo

ritroveremo nella cromatografia)

Il limite di esclusione è il peso molecolare della molecola incapace di penetrare nei pori del gel, per cui ne viene esclusa.

METODI METODI DIDI SEPARAZIONESEPARAZIONE

GEL FILTRAZIONE

L’intervallo di frazionamento è l’intervallo dei pesi molecolari delle molecole frazionate. Il limite superiore è costituito proprio dal limite

di esclusione.

Metodica che permette di separare i costituenti di un miscuglio omogeneo in base alla

loro differente ripartizione tra FASE FISSA, o stazionaria, e FASE MOBILE

A seconda dei principi chimico-fisici che determinano la ripartizione tra le due fasi, si

può avere cromatografia:

di adsorbimento

METODI CROMATOGRAFICI

di adsorbimento

di ripartizione

a scambio ionico

per esclusione o gel filtrazione

di affinità

In tutti i casi, sono presenti una fase fissa, che può essere solida o liquida, ed una fase

mobile, che può essere liquida o gassosa.

→HPLC, per separazioni e misure quantitative sia di miscele di sostanze naturali

(aminoacidi, porfirine) che di farmaci e droghe

CROMATOGRAFIA

PLANARE

TLC Carta Elettroforesi

COLONNA

GC SFC

METODI CROMATOGRAFICIMETODI CROMATOGRAFICI

TLC Carta Elettroforesi

AdsorbimentoRipartizione

GC

LC

SFC

Scambioionico

Gel filtrazione

Fase Normale

(fase stazionaria polare

fase mobile non-polare)

Fase inversa

(fase stazionaria non-polare

fase mobile polare)

CCE

Ripartizione

METODI CROMATOGRAFICIMETODI CROMATOGRAFICI

Applicazioni in chimica clinica

Le tecniche cromatografiche di HPLC e su carta hanno consentito a tutti i laboratori di

rendere agevole lo studio di aminoacidurie e dei conseguenti errori metabolici

riguardanti gli aminoacidi; la tecnica su strato sottile ha reso, poi, ancora più agevole

la ricerca qualitativa e semiquantitativa degli aminoacidi liberi nei liquidi biologici

(siero e urine)

METODI CROMATOGRAFICIMETODI CROMATOGRAFICI

Con l’HPLC si possono ottenere in tempi brevi (meno di un’ora), ed in maniera del tutto

riproducibile, separazioni quantitative degli aminoacidi su siero e urine:

Diventa così agevole la diagnosi di importanti malattie metaboliche come:

• omocistinuria

• leucinosi

• argininemia

• tirosinemia

• iperprolinemia

• ipervalinemia

Di interesse è l’analisi cromatografica (su carta o su strato sottile) dei polipeptidi

• fenilchetonuria

• alcaptonuria

• cistinuria

• iperlisinemia

• citrullinemia

METODI CROMATOGRAFICIMETODI CROMATOGRAFICI

Di interesse è l’analisi cromatografica (su carta o su strato sottile) dei polipeptidi

ottenuti per idrolisi enzimatica delle emoglobine dopo la separazione

elettroforetica: si riescono a caratterizzare, così, varie emoglobine patologiche.

La cromatografia su strato sottile, da sola o accoppiata alla gascromatografia, si è

rivelata preziosa nello studio degli ormoni steroidei del sangue o delle urine, di molti

farmaci e di loro metaboliti (alcaloidi cardioattivi, antibiotici, ecc), di droghe

(barbiturici, oppiacei, amfetamine, ecc), di lipidi e fosfolipidi (ad es. nel liquido

amniotico, per valutare la maturità respiratoria del feto)

METODI CROMATOGRAFICIMETODI CROMATOGRAFICI