Metodiche molecolari di ricerca e di analisi delle ... di Biotecnologie... · This database is a...
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• GCGGCGGCGGGCGGGTACTGGCTTCTGGGGCCAGGGGCCAGGGGCGGTGGGCGCCGGGACCGCGGAGCTGAGGA
GCGGGGCCCGGCCAGGGCTGGAGACTTTGCGCCCGGGGGCACCGGGGCTGCGCGCGGTCGCACACATCCACCGGC
GCGGCTTCCCTCGGCGGCCCGGGCTCCGCTCATCCTGCGGCGGGCGGCGCCGCTCAGGGGCGGGAAGAGGAGGCG
GTAGACGCGACCACAGAAGATGTCGGGCCAAACGCTCACGGATCGGATCGCCGCCGCTCAGTACAGCGTTACAGGCT
CTGCTGTAGCAAGAGCGGTCTGCAAAGCCACTACTCATGAAGTAATGGGCCCCAAGAAAAAGCACCTGGACTATTTGAT
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GTGGTTGTGTTTAAGGCTTTAGTGACAACACATCATCTCATGGTGCATGGAAATGAGAGATTTATTCAATATTTGGCTTC
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CTGGCACGCAGCTTTCTCCAAGCCCTACACCTGCCAGTCAGAGTCCCAAGAAACCTCCAGCAAAGGACCCATTAGCGG
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ATGGCTTTCTTTGTATTTCAGTTTAAAAACCCAGTGCATGTACGCCCTCTGAGATGCAATAAACACCTTGAACAAAG
3*109 bp
150*106 bp 1-5*106 bp
Fenotipi Complessi
•Cancro
•Malattie degenerative
Mutazioni somatiche – mutazioni germinali – molti geni coinvolti
This database is a catalog of human genes and genetic disorders authored and
edited by Dr. Victor A. McKusick and his colleagues at Johns Hopkins and
elsewhere,
and developed for the World Wide Web by NCBI, the National Center for
Biotechnology Information.
The database contains textual information and references.
It also contains copious links to MEDLINE and sequence records in the Entrez
system, and links to additional related resources at NCBI and elsewhere.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM
11
Il cancro è una malattia genetica.
Differentemente da altre malattie genetiche, a trasmissione
mendeliana oppure ad eziologia multifattoriale,
esso è principalmente causato da mutazioni de novo che avvengono
nel genoma di cellule somatiche.
19
Fattori di crescita
Recettori per i fattori di
crescita
Proteine coinvolte
trasduzione del segnale
Fattori di trascrizione
Proteine pro- apoptotiche
oppure anti-apoptotiche
Proteine che controllano il
ciclo cellulare
Proteine coinvolte nella
riparazione del DNA
21
Geni coinvolti nell’insorgenza e nella progressione della neoplasia
Protooncogeni
Oncosoppressori
Geni codificanti proteine coinvolte nella
riparazione del DNA
22
What are the genes responsible for tumorigenic cell growth?
Normal
Cancer
Proto-oncogenes
Cell growth and proliferation
Tumor suppressor genes
+
-
Mutated or “activated”
oncogenesMalignant transformation
Loss or mutation of
Tumor suppressor genes
++
24
Le mutazioni dei protooncogèni (che diventano oncogèni) alterano la
struttura e le funzioni del gene, e della proteina codificata,
in modo tale da determinare un cambiamento del fenotipo anche in
condizione di eterozigosi (gain of function mutations):
si comportano, quindi, in maniera dominante.
25
D’altra parte, le mutazioni dei geni oncosoppressori (cioè, geni che
modulano negativamente la proliferazione cellulare),
causano perdita della funzione del gene e della proteina codificata,
si comportano in modo recessivo (loss of function mutations).
26
In alcuni tipi di tumori, gli individui affetti ereditano dai genitori
alcune delle mutazioni,
che possono contribuire all’insorgenza di un determinato fenotipo
neoplastico.
La Predisposizione familiare
27
Sporadic and familial (Mendelian) forms of cancer
Knudson’s two-hit hypothesis
SporadicNormal
tumor
suppressor
gene
Single tumors,
unilateral,
later-onset
Somatic
mutation
in one allele
Somatic
mutation
in other allele
• two mutations (two hits) are required for loss of tumor suppressor function
28
Sporadic and familial (Mendelian) forms of cancer
Knudson’s two-hit hypothesis
Familial
Tumor suppressor gene
containing a germline
mutation in one allele -
heterozygous for the
mutation
Multiple tumors,
bilateral,
early-onset
Somatic
mutation
in other allele
• two mutations (two hits) are required for loss of tumor suppressor function
• the first “hit” is inherited and the second “hit” is somatic
32
Oncogenes in human tumors
Mechanisms of activation of proto-oncogenes
• point mutations
• chromosomal rearrangements or translocations
• gene amplifications
33
1. Point mutations in a proto-oncogene that result in a
constitutively acting protein product
2. Localized reduplication (gene amplification) of a DNA
segment that includes a proto-oncogene, leading to
overexpression of the encoded protein
3. Chromosomal translocation that brings a growth-
regulatory gene under the control of a different promoter
and that causes inappropriate expression of the gene
34
An oncogene formed by the first mechanism encodes an oncoprotein
that differs slightly from the normal protein encoded by the
corresponding proto-oncogene.
In contrast, the latter two mechanisms, usually, generate oncogenes
whose protein products are identical with the normal proteins;
their oncogenic effect is due to their being expressed at higher-than-
normal levels or in cells where they normally are not expressed.
37
Cell-cycle dependent phosphorylation of Rb
G1
S
G2
MG0
Quiescent cells
phase
phase
phase
phase
Rbp
p
p
pRb
p
p
p
p
Rbp
p
p
p
Rbp
p
p
p
Rbp
p
Restriction point
Rbp
p
Phosphorylation of Rb
allows cells to transit
the restriction point
and enter S phase
Hyperphosphorylated Rb
Hypophosphorylated Rb
38
Il passaggio attraverso il punto di restrizione G0 richiede l’attività
del fattore E2F, il quale promuove la trascrizione di geni codificanti
le proteine necessarie per la duplicazione del DNA cellulare.
Questo fattore è attivato da Cdk2, Ciclina E e Ciclina A.
L’attività di E2F è inibita dal legame con la proteina Rb
ipofosforilata, presente durante la fase M. Le Cdk 4/6, la Ciclina D, e
successivamente la Cdk2 e la ciclina E, fosforilano Rb provocando
il rilascio e la conseguente attivazione di E2F
43
I danni subiti dal DNA nucleare sono identificati da un sistema di
controllo, attivo durante G1 e G2, che si basa sulla attivazione di
p53, un fattore di trascrizione che stimola l’espressione di p21CIP.
Questo cyclin-kinase inhibitor (CKI) si lega ai complessi Cdk-Ciclina
e li inibisce, causando l’arresto del ciclo in G1 oppure in G2 finchè
il danno non sia stato riparato
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p53 is the “guardian of the genome”
• germline p53 mutations are found in Li-Fraumeni syndrome
• p53 is frequently found mutated in human tumors
• the p53 protein functions as a transcription factor that
regulates cell-cycle and DNA repair genes
• UV irradiation causes cell-cycle arrest in G1 that is dependent
on p53; cells that contain a mutated p53 cannot arrest
and go into S phase and replicate damaged DNA
• p53 loss-of-function mutations result in the replication of
cells with damaged DNA and to the further accumulation
of other mutations affecting oncogenes and tumor
suppressor genes, and to an increased
likelihood of cancer
45
Functions of selected proto-oncogenes
Proto-oncogene Biochemical property
1. Secreted growth factors
c-sis Platelet derived growth factor
2. Growth factor receptors
c-erbB Epidermal growth factor receptor
3. Signal transduction proteins
c-abl Protein kinase
c-src Protein kinase
H-ras Small G-protein
K-ras Small G-protein
4. Nuclear proteins
c-myc Transcription factor
c-fos Transcription factor
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Le mutazioni a carico delle proteine Ras costituiscono un tipico
esempio: infatti, una mutazione puntiforme nel gene, che codifica
per questa proteina, riduce la sua attività GTPasica rendendola
costitutivamente attiva.
Guadagno di funzione
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Ras family proteins
• the c-ras family contains three genes: H-ras, K-ras, and N-ras
• the Ras proteins encoded by these genes are small G-proteins
• the proteins transmit growth signals from cell surface receptors
• the Ras proteins are activated by binding GTP
• the proteins are inactivated by GTP to GDP hydrolysis
• mutations in the c-ras genes inactivate the Ras GTPase
• mutated Ras proteins are constitutively active
• constitutively active Ras proteins result in uncontrolled cell growth
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amino acid position
Ras gene 12 59 61 Tumor
c-ras (H, K, N) Gly Ala Gln normal cells
H-ras Gly Ala Leu lung carcinoma
Val Ala Gln bladder carcinoma
K-ras Cys Ala Gln lung carcinoma
Arg Ala Gln lung carcinoma
Val Ala Gln colon carcinoma
N-ras Gly Ala Lys neuroblastoma
Gly Ala Arg lung carcinoma
Murine sarcoma virus
H-ras Arg Thr Gln Harvey strain
K-ras Ser Thr Gln Kirsten strain
Amino acid substitutions in Ras family proteins
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Le ricerche sono state condotte sul cetuximab, un anticorpo monoclonale utilizzato
per il trattamento del cancro del colon-retto metastatico ed è stato individuato un
gene (KRAS) che predice l'efficacia di questa molecola sul paziente.
I risultati mostrano che il cetuximab funziona meglio nei pazienti che non
presentano mutazioni in questo marcatore.
Questa scoperta è un altro decisivo passo avanti verso la messa a punto di terapie
sempre più mirate e su misura per il paziente.
51
Una mutazione puntiforme nel gene, che codifica per la
proteina Ras, riduce la sua attività GTPasica rendendola
costitutivamente attiva.
52
Cetuximab è un anticorpo
monoclonale che blocca il
recettore dell’EGF.
La proteina Ras si trova a valle
di EGFR, quindi anche bloccando
il recettore non si ottiene la
risposta desiderata (blocco della
proliferazione cellulare)
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Metodologia
Preparazione del DNA dalla biopsia
Amplificazione (PCR) della regione genomicadi interesse
Sequenziamento dei frammenti ottenuti
Saggi di discriminazione allelica medianteReal-Time PCR
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Chromosomal rearrangements or translocations
Neoplasm Translocation Proto-oncogene
Burkitt lymphoma t(8;14) 80% of cases c-myc1
t(8;22) 15% of cases
t(2;8) 5% of cases
Chronic myelogenous t(9;22) 90-95% of cases bcr-abl2
leukemia
Acute lymphocytic t(9;22) 10-15% of cases bcr-abl2
leukemia
1c-myc is translocated to the IgG locus, which results in its activated expression2bcr-abl fusion protein is produced, which results in a constitutively active abl kinase
57
La proteina, codificata da c-myc attiva la trascrizione di geni che
controllano la progressione del ciclo cellulare
dalla fase G1 alla fase S.
Normalmente, sia l’ mRNA trascritto dal protooncogene, che la
proteina sono molto instabili.
Le cellule il cui genoma contiene le mutazioni sono costitutivamente
indotte a proliferare.
58
sono tipiche le traslocazioni che interessano il cromosoma 8, dove è
localizzato il gene c-myc, ed uno dei tre cromosomi in cui sono
localizzati i geni che codificano per le catene pesanti e leggere delle
immunoglobuline.
La traslocazione più frequente è la [t (8:14)], che si riscontra nel
90% dei BL:
la traslocazione, spostando cMyc in prossimità dell’enhancer del
gene che codifica per una delle catene delle immunoglobuline, causa
la sua continua espressione e di conseguenza le cellule sono
costitutivamente stimolate a proliferare.
59
c-myc is translocated to the IgG locus,
which results in its activated expression
bcr-abl fusion protein is produced,
which results in a constitutively active abl kinase
bcr-abl
bcr
abl
c-myc IgGIgG enhancer
c-myc is activated by
the IgG enhancer in
lymphocytes
60
A chromosome translocation that forms
Bcr-Abl in a hematopoietic stem cell
forms the diagnostic “Philadelphia”
chromosome and results in the initial
chronic phase of human chronic
myelogenous leukemia (CML),
characterized by an expansion in the
number of well-differentiated
granulocytes, a type of white blood cell.
A second mutation in one such cell (e.g.,
in p53) leads to acute leukemia.
62
The chromosomal translocation results in fusion of a portion of the
bcr gene (whose function is unknown but whose N-terminal segment
forms a coiled-coil domain that links several bcr polypeptides
together) with part of the c-abl gene, which encodes a protein-
tyrosine kinase whose normal substrates are not known.
The chimeric polypeptides expressed from the resulting Bcr-Abl
oncogene form a tetramer that exhibits constitutive Abl kinase
activity.
Although Abl is normally localized to the nucleus, addition of the
Bcr segment causes the Bcr-Abl oncoprotein to be localized to the
cytosol.
Bcr-Abl binds to many intracellular signal-transduction proteins
and then phosporylates them, proteins that Abl would not normally
activate.
As a consequence, these signaling proteins become activated in the
absence of growth factors.