Corso di Laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedicosede di Rovereto

Metodologie Diagnostiche di Patologia clinica

Metodi e tecniche di Immunoematologia

Anno accademico 2012‐2013

Metodologie Diagnostiche di Patologia clinica

Metodologie Diagnostiche di Patologia clinica

Immunoematologia ed emostasiDott.ssa Gina Rossetti

3 CFU

Immunoematologia ed emostasiDott.ssa Gina Rossetti

3 CFU

Metodi e tecniche di ImmunoematologiaTLB Mauro Waldner

2 CFU

Metodi e tecniche di ImmunoematologiaTLB Mauro Waldner

2 CFU

Patologia ClinicaDott. Michele Schinella

1 CFU

Patologia ClinicaDott. Michele Schinella

1 CFU

Mauro Waldner

mauro.waldner@brennercom.net

Laboratorio di immunoematologia 

Servizio Trasfusionale Ospedale S.Chiara di Trento

Tel. Segreteria: 0461.903204

Ricevimento: dal LUN al VEN dalle 8:00 alle 16:00

mailto:mauro.waldner@brennercom.net

Timetable

Esame

• Esame scritto Domande a quiz

Interpretazione dei risultati di laboratorio

Cosa impareremo

Tecniche in uso nel Laboratorio di Immunoematologia e nei Servizi Trasfusionali

– Determinazione del gruppo ABO e Rh(D)– Ricerca di anticorpi irregolari antieritrocitari– Identificazione degli anticorpi irregolari– Esecuzione delle prove pretrasfusionali– Test per accertamenti in caso di M.E.A.– Test per accertamenti in caso di M.E.F.N.– Preparazione degli emocomponenti per uso clinico

Background

• Biologia

• Istologia

• Genetica

• Immunologia

• Laboratorio

Attività di laboratorio

• Laboratorio Pratico con TLB Marco Torboli

• Nel Laboratorio di Immunoematologia del SIT di Trento e del CT di Rovereto

Laboratoriopratico

Laboratoriopratico

LezioniteoricheLezioniteoriche

Esperienzanei ServiziEsperienzanei Servizi

Dove studiare

• Slides delle lezioni

• Technical Manual della AABB (15^ edizione)

• Internet

• Manuale delle Metodiche

Non dovete avere paura di…

• Chiedere, se non avete capito.

• Di farvi rispiegare un argomento (anche di un’altra materia) 

• Farmi approfondire una cosa che vi sembra interessante per la vostra professione

• Di fermarmi se parlo troppo veloce

Il buon tecnico di laboratorio

• Usa la testa• Sa quello che fa• Sa come lo deve fare• Sa con cosa lavora• Conosce i limiti della metodica

• Applica i protocolli per la sicurezza

Un Servizio… tanti utenti!

• Paziente politraumatizzato• Paziente chirurgico

– CCH, NCH, Chirurgia Generale Maggiore– Ortopedia, Urologia, ecc…

• Paziente ematologico• Paziente talassemico/drepanocitico• Paziente oncologico• Paziente anziano• Paziente prematuro• …

Chi siamo?Chi siamo?

Il Servizio TrasfusionaleIl Servizio Trasfusionale

URUR

URURURUR

URUR

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URUR UR UR  UR UR 

Servizio Trasfusionale e ImmunoematologiaTRENTO

Servizio Trasfusionale e ImmunoematologiaTRENTO

Centro TrasfusionaleROVERETO

Centro TrasfusionaleROVERETO

www.centronazionalesangue.it

Donatore periodicoMedico e I.P. di BdSScreening sierologiciProduzione EmcConservazioneMedico e I.P. repartoLaboratorio di ImmunoematologiaAssegnazione & DistribuzioneMedico e I.P. di repartoPaziente

Da vena.. a vena!

TracciabilitTracciabilitàà di di tutti i processitutti i processi

Incidenti trasfusionali (1)Tutti i punti della catena

sono a rischio

Possono essere fatali

Vanno monitorati

Dall’errore si deve imparare!

Le procedure devono essere

standardizzate e condivise

con TUTTI gli operatori

Incidenti trasfusionali (2)1 errore ogni 16.000 unità trasfuse in UK (Williamson, Cohen, Love, et al.), 2000

Risk of HIV transfusion-associated infection = 1 in 1.000.000

Eventi sentinella

Near-miss

Errori (non segnalati)

Gli emocomponenti disponibiliEmazie senza buffy coat

FiltrateIrradiateLavate

Plasma fresco congelatoda Aferesi (500/550 ml)da Frazionamento (200 ml)

Piastrineda Aferesi (Cito)da Pool di 5/6 donatori

La Banca del Sangue…

La produzione degli Emc

La procedura aferetica

La validazione degli EmcRicerca anticorpi:

Anti-HBVAnti-HCVAnti-HIV

Test sierologici per LUE

Test biologia molecolare (NAT):

HCVHIVHBV

Controllo del gruppo ABO/Rh di tutte le sacche

What is a blood group?

‘An inherited character of the red cellsurface, detected by a specificalloantibody’

“Essential Guide to Blood Groups”, G.Daniels & I.Bromilow

IN

OUT

COOH

NH2COOHNH2

NH2

HOOC

oligosaccaridioligosaccaridi

Proteine one‐pass

Proteine multi‐pass glicoproteine

Antigeni eritrocitari

“Essential Guide to Blood Groups”, G.Daniels & I.Bromilow

Quale linfocita? La selezione clonale

Da linfocita a plasmacellula

Isotipi anticorpali

Plasmacellula

Anticorpi

Photographed celebrating the announcement of the Nobel Prize in Physiology or Medicine Awarded to Jerne, Köhler and Milstein on 15 October 1984

Monoclonal antibodies: the story of a discovery that revolutionized science and medicineSefik S. Alkan Nature Reviews Immunology 4, 153‐156 (February 2004)

Antisieri TipizzantiPoliclonaliPoliclonali

MonoclonaliMonoclonali

Alto peso MolecolareAlbumina

Basso peso MolecolareLISS, PeG

AnticorpoAnticorpo

Mezzopotenziante

Mezzopotenziante

Mezzi conservanti

Mezzi conservanti

Molte cellule B Una cellula B

Tutti gli epitopi di un antigene

Un solo epitopo

Miscela di anticorpi (isotipi)

Singola classe

AnticorpopoliclonaleAnticorpoAnticorpopoliclonalepoliclonale

AnticorpomonoclonaleAnticorpoAnticorpo

monoclonalemonoclonale

SintesiSintesiSintesi

LegameLegameLegame

ClasseClasseClasse

A‐ anti‐D                                                B‐ anti‐E

‘60 ‐ Alexander Wiener nel suo Laboratorio di Brooklyn

Miscela di anticorpi a diversa affinità (alta e bassa)

Disponibilità limitata

Molteplici manipolazioni industriali (diluizioni, assorbimenti, purificazioni, ecc…)

Possibile contaminazione con anticorpi diretti verso antigeni a bassa frequenza

Svantaggi anticorpi policlonali

Specificità verso un singolo epitopo

Indisponibilità per tutti gli antigeni

Sensibilità al cambio di conformazione degli 

antigeni

Reattività dipendente da variabili tecniche (pH, 

temperatura, ecc…)

Impossibile utilizzo per adsorbimenti

Costi elevati

Svantaggi anticorpi monoclonali

Etichettatura dei reagenti

GMP e CQ

Accreditati CE

Accreditati FDA

Marchiati IVD

‐‐‐‐‐> “only for research”

Antisieri commercialiAntiAnti-- AA BB A,BA,B DD CDECDE CC cc EE ee CCww

Mono/Poly Mono Mono Mono Mono Mono Mono Mono Mono Mono Polyumano

Classe AbIgM

BlendIgM

BlendIgM

BlendIgM/IgG

IgM IgM IgM IgM IgM IgM

AntiAnti-- KK kk KpKpaa KpKpbb JsJsaa JsJsbb FyFyaa FyFybb JkJkaa JkJkbb

Mono/Poly Mono Polyumano

Polyumano

Polyumano

Polyumano

Polyumano

Polyumano

Polyumano

Mono Mono

Classe Ab IgM IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgM IgM

AntiAnti-- XgXgaa LeLeaa LeLebb SS ss MM NN PP11 LuLuaa LuLubb

Mono/Poly Polyumano

Mono Mono Polyumano

Polyumano

Polyconiglio

Polyconiglio

Polycapra

Polyumano

Polyumano

Classe Ab IgG IgM IgM IgG IgG IgM IgM IgM IgG IgG

La reazione La reazione aantigenentigene‐‐anticorpoanticorpo

L’agglutinazione

Variabili della reazione Ag‐Ab

Isotipo IgIsotipo Ig AbAb completi, completi, AbAb incompletiincompleti

[[AgAg] [] [AbAb]       ]        Effetto Effetto prozonaprozona, , postzonapostzona

TemperaturaTemperatura AbAb caldi, caldi, AbAb freddifreddi

TempoTempo Mezzi potenziantiMezzi potenzianti

pHpH PBS, PBS, AbAb acidi (antiacidi (anti‐‐M)M)

[Ag] e [Ab]: effetto prozona

4+

3+

2+

1+

0

Temp. °C

4+

3+

2+

1+

0

Score

L’optimum di temperatura

22     26     28     32     36     40     44   48   

Anti‐DAnti‐M

Il tempo: i mezzi potenzianti

Senza mezzipotenzianti

Albumina

LISS

PeG

60 min.

30 min.

10‐15 min.

10‐15 min.

‐‐

Aumento costante dielettrica del mezzo

Diminuzionepotenziale ζ

Allontanamento molecole H2O

Enzimi proteolitici 30 min.

Diminuzione caricheelettriche

Il potenziale ζ

‐‐‐‐‐‐ ‐ ‐ ‐

‐‐‐‐

‐ ‐ ‐ ‐‐‐

++++

++

+ + + ++

+ +

+

+

+

+

++

++

+

‐‐‐‐‐‐ ‐ ‐ ‐

‐‐‐‐

‐ ‐ ‐ ‐‐‐

++++

++

+ + + ++

+ +

+

+

+

+

++

++

+Piano di scivolamento

Na+ Cl‐

Potenziale ζ : ∑ d.d.p. (misurato in milliVolt)

ζ = f × τD× μ

f τ

D μ

costante

costante dielettricadel mezzo

Albumina, destrano, PVP

carica elettrica delleemazie

Enzimi proteoliticiL.I.S.S.

forza ionica del mezzo

L.I.S.S.

HOH

HOH

HOH

HOH

HOH

HOH

HOH

HOH

HOH

HOH

Come funziona il PeG: l’acqua

Il pH

pH ottimale: 7,0 ‐ 7,4 (PBS, Fisiologica 

tamponata)

Anti‐M: optimum a pH 6,5 (HCl)

Eluizione acida a pH 2 con glicina acida 

(Elu‐Kit II Immucor)

Le metodiche Le metodiche per la reazione per la reazione 

antigeneantigene‐‐anticorpoanticorpo

Slide test: il vetrino

Ratio sangue intero:anti‐siero = 1:2

Mescolare e aspettare 2‐5 minuti

Leggere e registrare la reazione

!! Le deboli reazioni non sono evidenziate Le deboli reazioni non sono evidenziate !! Si può usare solo con anticorpi completi Si può usare solo con anticorpi completi IgMIgM

Tube test: la provettaRatio RBC 3%:anti‐siero = 1:2

IS o Incubazione per 15‐30’ a T.A.

Centrifugazione: 15’’ alti giri60’’ bassi giri

Lettura e registrazione dei risultati

!! Leggere per emolisi e agglutinazioneLeggere per emolisi e agglutinazione!! Non scuotere troppo: tecnica Non scuotere troppo: tecnica ““tiptip & & rollroll””

!! Usare lente o microscopio per Usare lente o microscopio per reazioni reazioni debolideboli!! Si può usare solo con anticorpi Si può usare solo con anticorpi IgMIgM

Score di reazione in provetta

Microplate 96 pozzetti U

Meno reagenti e materiale biologico

Maggior produttività

Possibilità di automazione (semina e lettura)

Maggior risparmio di tempo ed economico

Sistema Sistema miniaturizzato di miniaturizzato di tante piccole tante piccole provetteprovette

Automatizzazione microplate

Olympus PK 7300

Biotest TANGO

La fase solida: Capture®

LISS(MEZZO POTENZIANTE)

PLASMAO

SIERO

La reazione tra plasma (o siero) e gli stromi La reazione tra plasma (o siero) e gli stromi adesiadesi in fase solida in fase solida èèevidenziata da evidenziata da antianti‐‐IgGIgG umane legate sulla superficie di umane legate sulla superficie di emazieemazie

indicatrici.indicatrici.

Da “Tecnologie e protocolli diagnostici” dott.ssa R.M. Lorenti

Campionepositivo

Campionenegativo

Lettura dei risultati

Da “Tecnologie e protocolli diagnostici” dott.ssa R.M. Lorenti

Automatizzazione Capture®

SIERO/ANTISIERO

Eritrosedimentazione su colonna

BLISS

EMAZIE

Matrice con gel (destrano, poliacrilamide, …) o microsfere di vetro

PeG, antisiero o AHG

Camera di reazione (q.tà ridotte)

Lasciare la bolla dLasciare la bolla d’’aria!!!aria!!!

Eritrosedimentazione su colonna

Le emazie agglutinate vengono intrappolate lungo la colonna, mentre quelle non agglutinate cadono sul fondo.

Non serve il lavaggio (non si perdono deboli anticorpi)

Score di reazione in CAT

Leggere  la  reazione da un  lato e dall’altroGraduare  il  lato  con  intensità

maggiore per ogni pozzetto

Automatizzazione CAT

E.M.T.: Erythrocyte‐MagnetizedTechnology

Non richiede lavaggi (non si perdono deboli anticorpi)

Non richiede centrifugazione delle piastre (risparmio di tempo)

NOVITA’

Automatizzazione EMT

Corso di Laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico�sede di RoveretoTimetableEsameCosa impareremoBackgroundAttività di laboratorioDove studiareNon dovete avere paura di…Il buon tecnico di laboratorioUn Servizio… tanti utenti!What is a blood group?Antigeni eritrocitariQuale linfocita? La selezione clonaleIsotipi anticorpaliSvantaggi anticorpi monoclonaliEtichettatura dei reagentiAntisieri commercialiL’agglutinazioneVariabili della reazione Ag-Ab[Ag] e [Ab]: effetto prozona