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MESSA A PUNTO DI UN KIT DIAGNOSTICO MOLECOLARE UNIVERSALE PER LA RILEVAZIONE DI PATOGENI IN ALIMENTI E ACQUE

Regione del Veneto - POR FESR 2014-2020

BANDO PER IL SOSTEGNO A PROGETTI DI RICERCA CHE PREVEDONO L’IMPIEGO DI RICERCATORI

ASSE 1 “RICERCA, SVILUPPO TECNOLOGICO E INNOVAZIONE”

Obiettivo specifico “Incremento dell’attività di innovazione delle imprese”

Azione 1.1.1 “Sostegno a progetti di ricerca alle imprese che prevedono l’impiego di ricercatori (dottori di ricerca e laureati magistrali con profili tecnico-scientifici) presso le

imprese stesse”.

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via della Libertà 12 30175 Marghera-VE

tel.: 041 5093101 fax: 041 5093102

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Le malattie derivanti dal consumo di alimenti o acquacontaminata a causa di agenti patogeni e/o dalle lorotossine hanno una vasta gamma di conseguenze per lasalute pubblica ed economica in tutto il mondo

Si rende necessario sviluppare e validare un metodoper il rapido rilevamento dei contaminanti biologici

nel CIBO e nell’ ACQUA


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I metodi microbiologici convenzionali basati su test biochimici e test di coltura per la rivelazione dei patogeni alimentari normalmente sono:laboriosipoco sensibili

Con lo sviluppo di metodi molecolari la Reazione a catena della DNA Polimerasi

(PCR) è diventata un importante strumento per l’individuazione dei

microorganismi patogeni nei prodotti alimentari, migliorando:

SENSIBILITA’SPECIFICITA’ VELOCITA’ DI INDIVIDUAZIONE


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• Validare un kit in multiplex PCRche permetta con un’ unica analisi, l’identificazione contemporanea di m.o patogeni neglialimenti. Ottenendo, attraverso diversi set di primers, l’amplificazione delle sequenze di DNAe cDNA target, di più specie microbiche.

PCR CON DIVERSI SET DI PRIMERNELLA SINGOLA REAZIONE

SCOPI DEL PROGETTO:

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• Analisi dei frammenti amplificatirisultanti dalla multiplex PCR tramite elettroforesi capillare identificandoli tramitespettrofotometria a fluorescenza.

…SCOPI DEL PROGETTO:


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Tra i patogeni di origine alimentare attualmente osservati in una vasta gamma di prodotti, questi 10 sonofrequentemente riportati come agenti che causano intossicazioni alimentari:

• STAPHYLOCOCCUS AUREUS: è un batterio gram positivo di

forma rotonda che causa enteriti acute.

• SALMONELLA ENTERICA: è un batterio gram negativo di forma

bastoncellare e flagellato. Causa disordini nel tratto gastro

intestinale.

• LISTERIA MONOCYTOGENES: è un batterio gram positivo che

causa un’ infezione detta Listeriosi.

• ESCHERICHIA COLI O157:H7: E’ un batterio gram negativo.

Appartiene a un ceppo enteroemorragico e delle volte può

causare persino morte.

• SHIGELLA SPP.: è un batterio gram negativo che causa Shigellosi

che colpisce l’intestino tenue.

• CAMPYLOBACTER JEJUNI: è un batterio gram negative che causa

Campilobatteriosi.

• CLOSTRIDIUM PERFRIGENS: è un batterio gram positivo

sporigeno del genere Clostridium, di forma bastoncellare

anaerobico.

• NOROVIRUS : è un virus senza capside, con genoma a singolo

filamento di RNA.

• HAV: E’ un picornavirus causa dell’ epatite A.

• YERSINIA ENTEROCOLITICA: è un batterio gram negativo con forma

bastoncellare che causa Yersiniosi.EXPERTEAM srl


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In base alla frequenza dell’ intossicazione dapatogeni nei prodotti alimentari, la PCR in multiplexè stata testata a partire da matrici rappresentativeusando campioni di cibo e acqua

• Insalata imbustata• Pollo• Formaggio morbido• Gamberetti• Salse (mayonnaise)• Latte• Acqua

I patogeni elencati precedentemente si possono trovare in molti cibi contaminati:

DNA and RNA dei patogeni sono stati estrattiusando 3 kit che sono stati confrontati valutandola loro compatibilità con il nostro protocollo. Tuttie 3 hanno dimostrato paragonabile efficienza diestrazione a partire da tutte le matrici testate.AllPrep DNA/RNA

Mini KitDNeasy mericonFood Kit

DNeasy PowerFoodMicrobial Kit EXPERTEAM srl


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Le sequenze target di ciascun patogeno sono state scelte in base alla specificità di ciascuno di essi all’ internodella specie, del genere o della famiglia.

Tutte le sequenze scelte sono state ottenutetramite GenBank (NCBI)

Le analisi per la specificità e la potenziale erroneaindividuazione di altri patogeni è stata verificata con Blast


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Dopo aver selezionato le sequenze target, 10 coppie di primers specifici e compatibili sono stati disegnati:

• Amplificando regioni target specifiche delle proteine virali del capside con bassi tassi di mutazione

• Considerando le regioni conservate del gene batterico target

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Ogni coppia di primer è stata disegnata in modo da generare frammenti aventi lunghezza in paia di basidiversi, per ogni microorganismo presente. Proprio in funzione della diversa lunghezza e del fluoroforolegato all’estremità del primer sarà possibile individuare il patogeno.

Yersinia enterocolitica

Salmonella enterica

Campylobacter jejuni

Shigella spp.

Escherichia coli O157:H7

329 bp

284bp

279bp

219bp

205bp

Listeria mono cytogenes

Clostridium perfrigens

Staphylococcus aureus

Norovirus

HAV

116bp

101bp

330bp

225bp

119bp


VALIDAZIONE DI UN KIT IN MULTIPLEX-PCR, CON SUCCESSIVA ANALISI DEI FRAMMENTI

AMPLIFICATI

MASTER MIX 1Mix contenente primers e reagenti peramplificare i patogeni batterici:

MASTER MIX 2Mix contenente primers e reagenti peramplificare i patogeni virali che prevede unostep precedente di retrotrascrizione da RNAvirale in cDNA:Yersinia enterocolitica

Salmonella enterica


Shigella spp.



Listeria mono cytogenes

Norovirus

HAV

Primer marcato HEX

Primer marcato 6-FAM

Primer marcato HEX


Primer marcato HEX





Clostridium perfrigens Primer marcato HEX

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Shigella spp.Staphylococcus aureus


Salmonella enterica


Listeria monocytogenes


I frammenti amplificati vengono separati con l’ elettroforesi capillare ad alta risoluzione. Essisi presentano come dei picchi separati sull’ elettroferogramma così da identificare ilpatogeno grazie alla dimensione e posizione del picco.

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RISULTATI MASTER MIX 1:


La sensibilità del protocollo standardizzato di PCRmultiplex è stata controllata utilizzando tre diversediluizioni di L. monocytogenes, Y. enterocolitica, S.aureus e S. enterica, Cl. Perfigens, Esch. Coli, C.jejuni, Shigella spp. 104, 103, 102. La sensibilità dellareazione è espressa in termini di copie di genomabatterico.


Salmonella enterica


Shigella spp.






Salmonella enterica


Shigella spp.






Salmonella enterica


Shigella spp.




Staphylococcus aureusEXPERTEAM srl


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104 copie

103 copie 102 copie


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HAV Norovirus

I frammenti amplificati vengono separati con l’ elettroforesi capillare ad alta risoluzione. Essisi presentano come dei picchi separati sull’ elettroferogramma così da identificare ilpatogeno grazie alla dimensione e posizione del picco.

RISULTATI MASTER MIX 2:


La sensibilità del protocollo standardizzato di PCRmultiplex è stata verificata utilizzando tre diversediluizioni di HAV E Norovirus 104, 103, 102. Lasensibilità è stata in termini di copie del genomavirale

HAV Norovirus

HAV NorovirusHAV Norovirus

104 copie

103 copie 102 copie

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Sistema di refertazione

universale, in grado di acquisire i dati provenienti dal sequenziatore

automatico rielaborandoli generando il

referto.

DATI IDENTIFICATIVI DEL LABORATORIO N° accettazione: Data accettazione:

Data analisi:

Alimento analizzato: Quantità (mg): Sistema di estrazione: Data estrazione: Indagine eseguita: Metodica utilizzata: m-PCR, corsa di frammenti in elettroforesi capillare Patogeni testati: vedere tabella sottostante

RISULTATI

PATOGENO RILEVATO : Norovirus Commento: Operatore Direttore della struttura

Patogeno testatoEscherichia

col i O157:H7

Salmonel la

enterica

Staphylococcus

aureus

Listeria

monocytogenes

Campylobacter

jejuni

Shigel la

spp.

Clostridium

perfrigens

Yers inia

enterocol i ticaHAV Norovirus

Patogeno rilevato X

DATI IDENTIFICATIVI DEL LABORATORIO N° accettazione: Data accettazione:

Data analisi:

Alimento analizzato: Quantità (mg): Sistema di estrazione: Data estrazione: Indagine eseguita: Metodica utilizzata: m-PCR, corsa di frammenti in elettroforesi capillare Patogeni testati: vedere tabella sottostante

RISULTATI

PATOGENO RILEVATO : Clostridium perfrigens Commento: Operatore Direttore della struttura

Patogeno testatoEscherichia

col i O157:H7

Salmonel la

enterica

Staphylococcus

aureus

Listeria

monocytogenes

Campylobacter

jejuni

Shigel la

spp.

Clostridium

perfrigens

Yers inia

enterocol i ticaHAV Norovirus

Patogeno rilevato X

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RISULTATI INTERMEDI:

CONCLUSIONI:

Il kit messo a punto per la ricerca di microrganismi patogeni in alimenti ed acque permette, tramite un protocollo basato sumetodologia multiplex PCR, di rilevare contemporaneamente e con il medesimo protocollo 10 m.o. diversi individuabili equindi da utilizzarsi indipendentemente dal tipo di alimento e lavorazione.

Il nostro kit ha la caratteristica di essere rapido e di semplice utilizzo, soprattutto non necessita di conoscerepreventivamente quale contaminante ricercare.

Grazie ai risultati ottenuti con il kit messo a punto si è in grado di rilevare la quasi totalità dei microrganismi e virusresponsabili di tossinfezioni alimentari con tempi e protocolli compatibili con le necessità sanitarie, preventive edell’industria alimentare, e soprattutto con un’elevata specificità e sensibilità rispetto ai protocolli presenti nel mercato.

I primers sono stati disegnati e le sequenze target sono state definite, però èancora in fase di sviluppo l’inserimento delle due coppie di primers per ipatogeni in questione all’interno della multiplex

Bacillus CereusVibrio spp.

Difficoltà nel reperire controlli positivi

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