Proprietà biochimiche e strutturali delleidrolasi acide, ceramide glicosidasi esfingomielinasi, il cui deficit funzionale èalla base rispettivamente della malattia diGaucher e di Niemann-Pick.Gaucher e di Niemann-Pick.

Prof.ssa Maria Teresa Rinaudo Facoltà di Medicina e Chirurgia - Università di Torino

Classificazione delle malattie da accumulo� La malattia di Gaucher (GD) e di Niemann Pick (NPD), il cui nome si riferisce ai

due medici che per primi ne hanno descritto la sintomatologia, fanno parte di ungruppo relativamente numeroso di malattie ereditarie prevalentementeautosomiche recessive note come malattie da accumulo.

� Infatti sono caratterizzate da accumulo di due lipidi complessi ceramide beta-glucosio (GlcCer) e sfingomielina o ceramide fosforilcolina o fosforiletanolamina(SM).

� In senso più ristretto, le due patologie sono definite malattie lisosomiali inquanto l’accumulo di GlcCer e SM ha luogo nei lisosomi.GD e NPD sono definite anche sfingolipidosi in quanto GlcCer e SM sono� GD e NPD sono definite anche sfingolipidosi in quanto GlcCer e SM sonodue sfingolipidi che hanno come componente comune la sfingosina.

� Quasi tutte le malattie da accumulo lisosomiale sono dovute a ridottadegradazione del composto accumulato.

� Poiché la degradazione solitamente coinvolge processi idrolitici, la patologia èspesso dovuta a ridotta attività di idrolasi specifiche attive sul composto oggettodi accumulo.

� Nella GD è tale GlcCerase (glucoceramidasi) acida.� Nella NPD è tale ASMase (sfingomielinasi) acida.� La definizione acida sta ad indicare che entrambe le idrolasi richiedono per

essere attive un pH acido (5,5-6,5) caratteristico dei lisosomi.

I lisosomi

Sono organelli subcellulari che all’interno hanno un pH fra 5,5-6,5 e quindi acido,mantenuto tale ad opera di pompe protoniche presenti sulla membrana dellisosoma che continuamente immettono protoni all’interno prelevandoli dalcitoplasma; questo trasporto è molto dispendioso e comporta un considerevole ecostante consumo di ATP. Ne consegue che con la morte della cellula questecostante consumo di ATP. Ne consegue che con la morte della cellula questepompe collassano, i lisosomi vanno incontro a lisi permettendo alle idrolasi, in essisegregate, di diffondere e indurre la necrosi della cellula.

Funzioni dei lisosomi :

Sono deputati alla degradazione di

composti vari derivati dal circolo(particelle estranee, ormoni, tossinebatteriche) e di frammenti di membranache necessitano di essere rinnovati osostituiti nei loro componenti, i quali tuttivengono veicolati al lisosoma per unvengono veicolati al lisosoma per unprocesso denominato endocitosi.Per un processo noto come esocitosiprovvedono a riportare in membrana orilasciare all’esterno i prodotti della loroattività o componenti ad essi veicolati enon degradati.

Struttura delle membraneSono formate da un doppio fogliettolipidico all’interno del quale siinseriscono glicoproteine cheattraversano la membrana da parte aparte (proteine integrali dimembrana ), e proteine adese sul latocitosolico della membrana (proteineesterne ). Le prime sono sia elementistrutturali sia concorrono allaformazione di canali ionici (trasporto di

ESTERNO

sterolo

glicolipide

Catene oligo-saccaridiche

Teste polari

Doppio stratolipidico

formazione di canali ionici (trasporto diioni sodio, potassio, calcio, cloro etc),funzionano come recettori (ormoni) etrasduttori o generatori di cascate disegnale.Il doppio foglietto lipidico è formato dalipidi complessi, molecole anfipatiche(affini sia a composti di naturaidrofobica che idrofilica) in quantocaratterizzate da una parte idrofobica,nello spessore della membrana, eun’altra idrofilica, sui lati citosolico edesterno. SM

GlcCer

Gruppo idrofilico Gruppo idrofobico

INTERNO

ProteineintegraliProteine

periferiche

Proteineintegrali

Proteineperiferiche

Lipidi complessi

1. Glicerofosfolipidi : l’alcol è il glicerolo, presente anche in tutti i trigliceridi,legato a due acidi grassi (parte idrofobica) e a un gruppo fosfato legato acolina, etanolamina o serina (parte idrofila);

2. Sfingolipidi : l’alcol è la sfingosina, che consiste di una catena C18 alla2. Sfingolipidi : l’alcol è la sfingosina, che consiste di una catena C18 allaquale sono uniti in posizione 1 e 3 due funzioni alcoliche ed in posizione 2 ungruppo aminico a cui si lega costantemente un acido grasso a lunga catena.Questo raggruppamento sfingosina/acido grasso detto ceramide costituiscela parte idrofobica dello sfingolipide. La componente idrofila è legata algruppo alcolico in posizione 1 della sfingosina;

Classificazione degli sfingolipidiSfingomieline in cui al C1 della ceramide è legata la fosforilcolina o lafosforiletanolamina. L’idrolisi della sfingomielina in ceramide e fosforilcolina oetanolamina è catalizzata dalla sfingomielinasi (Smase), in particolare nei lisosomi daASMase, la cui scarsa attività è causa di NPD.

Glicosfingolipidi suddivisi in:

1) cerebrosidi e sulfatidi: alla ceramide sono legati i monosaccaridi galattosio1) cerebrosidi e sulfatidi: alla ceramide sono legati i monosaccaridi galattosioo galattosio solfato;

2) Globosidi: alla ceramide sono uniti i monosaccaridi glucosio, galattosio,galattosio, N-acetilgalattosamina;

3) Gangliosidi: alla ceramide sono uniti 4 monosaccaridi quali glucoso,galattosio, N-acetilgalattosamina, galattosio e una o più molecole di acidosialico.

Pertanto dalla degradazione di globosidi e gangliosidi origina sempre GlcCersubstrato specifico nei lisosomi di GlcCerase, l’idrolasi la cui scarsa attività ècausa di GD.

Malattia di Gaucher (GD) deficit della idrolasi ββββ-glucosidasi acida o

glucoceramidasi (GlcCerase)

La causa primaria di GD è una ridotta attività nei lisosomi di GlcCerase, l’idrolasiche selettivamente risolve GlcCer in glucoso e ceramide, conseguente a mutazionidel gene codificante localizzato sul cromosoma 1q21.Fra le malattie da accumulo lisosomiale, GD è quella che ha l’incidenza più elevata.Anomalia tipica di GD consiste in accumulo di GlcCer nei lisosomi di celluleAnomalia tipica di GD consiste in accumulo di GlcCer nei lisosomi di cellulemacrofagiche che di conseguenza aumentano di volume assumendo aspettospumeggiante (cellule di Gaucher) particolarmente marcato nel Sistema ReticoloEndoteliale del fegato, milza e midollo osseo (epatosplenomegalia progressiva) e inmacrofagi di altri tessuti; questo fenotipo è proprio della forma meno grave di GDdefinita GD viscerale compatibile con una sopravvivenza fino all’età adulta.Se l’accumulo compare anche nel tessuto nervoso, in particolare nel cervello, lamalattia diventa neuronale (GD neuronopatica ) con danni neurologici così gravi dalimitare la sopravvivenza ai primi anni di vita. L’accumulo di GlcCer compare anchenelle membrane neuronali inclusa la mielina..

Malattia di Gaucher (GD)

GD è suddivisa in tre sottotipi:

1) GD1: forma viscerale, spesso asintomatica per molto tempo, contraddistinta da epatomegalia, osteopenia, deformazioni ossee, trombocitemia e anemia;trombocitemia e anemia;

2) GD2 e GD3: forme neuronopatiche caratterizzate da danni neuronali gravi (disturbi oculomotori, difficoltà di deambulazione, notevole compromissione del midollo allungato, necrosi neuronale) che si sommano a quelli della forma viscerale. Questi danni sono più severi in GD2 che è letale nei primi anni di vita.

Proprietà strutturali e biosintesiGlcCerase , come la maggior partedelle idrolasi coinvolte nellepatologie da accumulo lisosomiale,è una glicoproteina in cui la catenapolipeptidica è legata a cateneoligosaccaridiche ricche inmannoso.La sintesi della catenaoligosaccaridica ha luogo sulla Glicoproteinaoligosaccaridica ha luogo sullacatena peptidica, procede nelreticolo endoplasmico e si concludenell’apparato di Golgi, in cui alcuniresidui di mannoso vengonofosforilati sul C6 (catene ricche inmannoso fosfato), mentre altririmangono invariati (catene ricche inmannoso).Il gruppo mannoso-fosfato èindispensabile per la traslocazionedella proteina al lisosoma viarecettori specifici.

Localizzazione

A livello del lisosoma, le molecole dell’enzima in parte perdono il fosfato legato amannoso e in questa forma rimangono nel lisosoma dove svolgono il loro ruolo diidrolasi; altre invece conservano il mannoso-fosfato, vengono incluse all’interno divescicole (endosomi secondari), e veicolate alla membrana plasmatica doveconcorrono al turnover degli sfingoglicolipidi del doppio foglietto lipidico.

Nei pazienti con GD l’enzima poco attivo provocherà accumulo di GlcCer oltre cheNei pazienti con GD l’enzima poco attivo provocherà accumulo di GlcCer oltre chenei lisosomi anche in membrana, difetto che caratterizza in modo evidente soggetticon GD di tipo 2 e 3.

Questo riciclaggio di GlcCerase alla membrana plasmatica è comune anche ad altreidrolasi attive sugli sfingolipidi tra cui la sfingomielinasi acida di cui parleremosuccessivamente.

Fattori che intervengono nella regolazione della attività di GlcCerase

Circa 200 mutazioni sono state individuate sul gene (cromosoma 1), la maggiorparte riscontrate negli ebrei Ashkenazi.

L’accumulo di GlcCer è tipico di tutte le forme di GD in cui spesso si associa adaccumulo di glucosio-sfingosina (GlcSph), che deriva da GlcCer per distaccodell’acido grasso. GlcSph normalmente non compare nei tessuti ma la sua presenzaè elevata nel sistema nervoso di pazienti con GD2 e GD3 e pare concorrere apotenziare gli aspetti deleteri della malattia.

Per avere una attività ottimale GlcCerase deve essere associata a saposina C(SapC), proteina di piccola massa molecolare con funzione di attivatore, in quantofacilita l’interazione di GlcCerase con GlcCer facendo da ponte tra le due entità.

Mutazioni della SapC potrebbero essere causa di alcune forme di GD; in alternativamutazioni su GlcCerase potrebbero rendere difficile l’interazione con SapC.

Modalità di trattamento di GD

Per le malattie da accumulo, ed in particolare quelle con accumulo lisosomiale, nonesistono ad oggi delle terapie efficaci; trattamenti diversi sono in fase di progetto oaddirittura trovano applicazione seppure a costi esorbitanti e con vantaggi spessomolto limitati.Le terapie già in applicazione o in fase sperimentale sono le seguenti:

1) Enzyme Replacement Therapy (ERT) : l’enzima difettoso è sostituitodall’enzima fisiologico somministrato in circolo come tale o legato ad unsupporto di varia natura che ne facilita il trasporto, l’inserzione sullasupporto di varia natura che ne facilita il trasporto, l’inserzione sullamembrana cellulare e la successiva internalizzazione ai lisosomi.

• Ostacoli : a) applicabilià solo in pazienti affetti da GD1, in quanto la massamolecolare della idrolasi ne pregiudica il superamento della barriera emato-encefalica; b) instabilità della proteina in rapporto alla sua natura; c)possibile interazione con molecole con funzione inibitoria presenti in circoloe nei tessuti. Inoltre è richiesta una costante integrazione dell’enzima, stantela sua labilità, in quanto proteina, e questo comporta costi notevoli.

• ERT è il trattamento attualmente maggiormente utilizzato nella terapia diGD. L’enzima è in commercio con il nome di Cerezyme ed è utilizzato daoltre 15 anni; attualmente nel mondo sono circa 4000 i pazienti intrattamento.

Modalità di trattamento di GD

2) Substrate Reduction Therapy (SRT) Terapia basata sulla riduzione dellaquantità di substrato disponibile per l’idrolasi; si basa sulla somministrazionedi molecole che si comportano come inibitori competitivi o di tipo allostericonei riguardi dell’enzima che concorrono a formare GlcCer. Questa terapia siè rilevata di qualche vantaggio per GD1, minimo o nullo per GD2 e GD3.Inoltre spesso l’antagonista induce effetti aspecifici tossici e quindi la terapiasi presenta non scevra di rischio.si presenta non scevra di rischio.

3) Enzyme Enhancement Therapy (EET) Terapia basata sullasomministrazione di molecole che si comportano come chaperonine neiriguardi dell’idrolasi in quanto ne potenziano la stabilità o ne correggono unerrato ripiegamento.

Nel caso di GD alcune mutazioni sono causa di non corretto ripiegamentodella molecola dell’enzima, o alternativamente ne rendono difficile l’accessoai lisosomi, o ne precludono il rilascio dal Golgi o dal reticolo endoplasmico.Poiché nella malattia il deficit di funzione dell’enzima mutato non è maitotale, ne consegue che EET può avere un effetto positivo seppure moltolimitato.

Malattia di Niemann Pick (NPD)

NPD è una malattia ereditaria autosomica recessiva causata da deficit dell’idrolasisfingomielinasi acida (ASMase); si manifesta in due forme identificate come NPD di tipo A(NPD-A) e NPD di tipo B (NPD-B) con fenotipo solo in parte sovrapponibile. Entrambe le formesono caratterizzate da accumulo nei lisosomi di sfingomielina (SM) particolarmente evidente incellule macrofagiche presenti in circolo e accentrate nel sistema reticolo endoteliale di organiquali fegato, milza e midollo osseo; tuttavia l’accumulo lisosomiale è presente anche in altritessuti tra cui il sistema nervoso centrale (CNS) in particolare il cervello.

Se l’accumulo è limitato ai tessuti periferici la malattia è definita viscerale e classificata comeNPD-B; se si presenta anche in CNS (e soprattutto nel cervello), la malattia è definitaneuronopatica ed è classificata come NPD-A.

In entrambe le forme i segni clinici non sono evidenti alla nascita e si rendono tali solo dopoalcuni mesi di vita (NPD-A) o nell’infanzia e talvolta solo in età adulta (NPD-B).

Incidenza della malattia

NPD-A è altamente invasiva e comporta danni neurologici gravi (ipomielinizzazione,degenerazione dei neuroni, atrofia del cervelletto); la morte è stimata intorno ai treanni di vita.

NPD-B è invece meno aggressiva ed è compatibile con una durata di vita fino all’etàadulta.

NON c’è separazione netta fra le due forme in quanto nei pazienti il quadro clinicosfuma da quello tipico di NPD-B a quello di NPD-A. Il diverso grado di severità dellaNON c’è separazione netta fra le due forme in quanto nei pazienti il quadro clinicosfuma da quello tipico di NPD-B a quello di NPD-A. Il diverso grado di severità dellamalattia spesso si associa a un diverso grado di deficit funzionale di ASMase,notevolmente più elevato nei casi con NPD-A.

L’incidenza della malattia e la distribuzione demografica non sono note con esattezza:la frequenza maggiore è stata rilevata negli ebrei, in particolare nella comunità degliAshkenazi.

Su 1000 pazienti affetti da deficit di ASMase circa 200 sono colpiti da NPD-A e diquesti il 66% sono ebrei Ashkenazi; il rimanente 34% include soggetti del Nord-America, Europa Occidentale, Nord-Africa e Medio Oriente.

Isoforme della sfingomielinasi

Esistono differenti forme di SMase identificate, sulla base del pH ottimale per laattività:

1) SMase acida (ASMase ) attiva a pH 5,5-6,8 (coinvolta in NPD)2) SMase neutra (NSMase) attiva a pH 6.8-7,43) SMase alcalina o basica (BSMase ) attiva a pH oltre 7.

Ognuna di queste forme è codificata da geni differenti, il gene Smpd1(cromosoma 11) codifica ASMase; per NSMase sono state identificate differentiisoforme la cui espressione è regolata da almeno tre differenti geni, Smpd2,Smpd3, Smdp4, apparentemente indenni da mutazioni.

Vie di sintesi e distribuzione intracellulareLe diverse isoforme sono tutte glicoproteine e sono differentemente distribuite nellacellula. NSMase è presente nel citoplasma, sulla membrana del reticoloendoplasmico e dell’apparato di Golgi e sul lato citosolico della membranaplasmatica. ASMase prevale nei lisosomi (forma definita L-ASMase ); tuttavia dallisosoma essa può migrare via endosomi secondari di origine lisosomiale allamembrana plasmatica localizzandosi sul lato esterno.

Inoltre ASMase può migrare direttamente dall’apparato di Golgi, via vescicole disecrezione, alla membrana plasmatica e localizzarsi sul lato esterno; questa forma èdefinita secretoria o S-ASMase .

Ne consegue che il gene Smpd1 codifica per un solo trascritto che a seguito dimodificazione post-translazionali si esprime in almeno due proteine attive nellamodificazione post-translazionali si esprime in almeno due proteine attive nelladegradazione di SM. La differenziazione avviene nell’apparato di Golgi dove in alcunemolecole residui di mannoso vengono fosforilati, mentre in altre ciò non avviene.

In alcune molecole della proteina residui di mannoso della catena oligosaccaridica invia di formazione vengono addizionati su C6 di radicali fosfato. Le molecole diASMase con mannoso-fosfato vengono veicolate al lisosoma a mezzo recettore,oppure portate alla membrana all’interno di endosomi, quelle con mannoso nonfosforilato vengono traslocate via vescicole secretorie direttamente alla membranaplasmatica. Ne consegue che in soggetti con NPD le membrane, in particolare quellaplasmatica, delle cellule neuronali inclusi gli oligodendrociti, e quindi la mielina ,accumulano SM in quanto il suo turnover sarà pregiudicato dalla presenza delle dueforme di ASMase con attività precaria.

Modello animale della malattia di Niemann Pick di tipo A (NPD-A)

Attualmente esistono due modelli animali di NPD-A rappresentati da topi in cui ilgene di ASMase, SMPD1, è stato inattivato; questi animali sono identificati cometopi knockout per il gene o topi ASMKO . Nei tessuti di questi animali l’attività diASMase è del tutto assente. Il fenotipo del topo ASMKO riflette da vicino quello disoggetti affetti da NPD-A; come nel caso umano il topo ASMKO alla nascitaapparentemente è indenne da alterazioni di qualsiasi tipo; i danni neurologicicompaiono intorno al terzo mese di vita post natale, aumentano rapidamente neimesi successivi in cui i danni neurologici si rendono sempre più manifesti e simesi successivi in cui i danni neurologici si rendono sempre più manifesti e siidentificano con accumulo di SM nel cervello, in toto e nello specifico nella mielina,alterazione dell’assetto degli glisfingolipidi, ipomielinizzazione, atrofia cerebellare emorte delle cellule di Purkinje.

Su questo modello il laboratorio in cui risiedo da anni ha svolto indagini approfonditedi recente pubblicate che hanno fornito una spiegazione circa la mancanza disintomi alla nascita osservata nel nostro studio sull’animale transgenico,documentata ampiamente in soggetti con NPD-A.

Alterazioni metabolicheLa ricerca, che si è focalizzata su 4 proteinetipiche della mielina, MBP,PLP, MAG, CNP,prodotti dell’attività metabolica deglioligodendrociti, ha messo in evidenza comealla nascita l’ammontare di queste proteinenella mielina e nel cervello del topo AMSKO èconfrontabile con quello del topo di controllo,mentre si riduce significativamente a partire dalprimo mese in avanti; questa riduzione siaccompagna con accumulo progressivamentepiù marcato di SM nella mielina e nel cervellopiù marcato di SM nella mielina e nel cervelloin toto; alterazioni evidenti riguardano anchealcuni glicosfingolipidi. Questo quadro non èriportabile ad una riduzione in termini numericidegli oligodendrociti, bensì ad una loro ridottaattività metabolica (Figura). E’ probabile quindiche la ipomielinizzazione osservata nelsoggetto affetto da NPD-A soltanto intorno alsesto mese rifletta anche anche in questo casouna ridotta attività metabolica deglioligodendrociti che si instaura solo dopo lanascita.

Possibili modalità di trattamento

Terapia

Una terapia specifica per NPD è in fase di progettazione per la forma B mentre èsolo ipotizzata come possibile per la forma A. Questa differenza è dovuta al fatto cheper essere efficace nel caso di NPD-A il principio attivo deve superare la barrieraemato-encefalica praticamente refrattaria a innumerevoli molecole in particolare aproteine.

La terapia ERT è stata sperimentata sull’animale transgenico con scarso successoLa terapia ERT è stata sperimentata sull’animale transgenico con scarso successoutilizzando una ASMase ricombinante sia immessa come tale in circolo, sia veicolatain combinazione con diversi supporti (liposomi, particelle di differente natura).L’ostacolo principale ancora una volta è stata la barriera emato-encefalica ed ilrecettore per l’enzima a livello della membrana scarsamente recettivo.

La terapia genica con introduzione del gene SMPD1 clonato e veicolato daparticelle virali inattivate è in fase di sperimentazione sul topo ASMKO. Del pari sonoin progetto terapie di tipo SRT utilizzando composti in grado di ridurre la sintesi diSM o potenziare l’attività residua di ASMase nelle forme NPD-B (EET); da ultimo unnuovo approccio concerne il tentativo di stabilizzare l’enzima difettoso prevenendonela demolizione mediante inibitori di proteasi specifiche quali ad esempio ilproteasoma, la proteasi specifica della via proteolitica ubiquitina dipendente (UBS).