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Sperimenta*il*Biolab"

Sano*o*malato?*

Mala$e&gene)che&da&espansione&o&delezionedi&triple4e"

Università*degli*Studi*di*Milano"

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Indice*

Conoscenze*propedeu<che,*obie?vi*e*metodi*sperimentali**

1. *Le*mutazioni*geniche*********************************************************************pag.*3*

2.*Che*cosa*è*un*pedigree*****************************************************************pag.*4*

3.*Mutazioni*determinate*da*espansione*di*tripleGe******************pag.*9**

* * *

* ** 3.1*Meccanismo"molecolare"dell’espansione"di"triple2e"""pag.*9*" " 3.2"Patologie"causate"dall’"espansione"di"triple2e""""""""""""""pag.*9*"""""* 4.*Corea*di*Hun<ngton* * * * * * * pag.*11*

* 5.*Atassia*di*Friedreich* * * * * * * pag.*14*

* 6.*XOfragile* * * * * * * * * pag.*16*

* 7.*Distrofia*di*Duchenne** * * * * * pag.*20*

* 8.*Tecniche*u<lizzate* * * * * * * pag.*23

* " 8.1"PCR" " " " " " " " pag.*24

" " " " " """"""""""""""" " " 8.1.1"Termociclatori" " " " " pag.*24

" " " " " """""""""" " " 8.1.2"Taq"polimerasi" " " " " pag.*24

" " " " """""""""""""" " " 8.1.3"Scelta"dei"primer" " " " " pag.*24

" " " " """""""""""""" " 8.2"Ele2roforesi"su"gel"di"agarosio" " " " pag.*24

" " " " " "" * "9.*Norme*generali*di*sicurezza*in*laboratorio* * * * pag.*25*

10.*Protocollo*di*laboratorio* * * * * * * pag.*27

* * ************* "11.*Quiz*di*autovalutazione* * * * * * * pag.*29

* * * * * * * *

12.*Glossario* * * * * * * * * pag.*32

* * * * * * * * "13.*Bibliografia*e*Si<*web** * * * * * * pag.*34

*

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Conoscenze*propedeu<che,*obie?vi*e*metodi*sperimentali*

Per"poter" svolgere"questa"aCvità,"gli" studenF"devono"avere"precedentemente"acquisito" le"conoscenze"relaFve"a:*• Duplicazione"del"DNA"nelle"cellule"eucarioFche""• Stru2ura"e"funzione"del"gene" "• Sintesi"proteica"• Leggi"di"Mendel"• Sistema"nervoso"centrale"

Obie?vi*

Questo"laboratorio"perme2e"di"approfondire"alcuni"conceC"importanF"di"geneFca"e"biologia"molecolare:""•la"trasmissione"dei"cara2eri"ereditari"all’interno"di"una"famiglia"•la" costruzione"di" alberi" genealogici" per" individuare" i" soggeC"affeC"o"portatori" di"mutazioni"

•l’analisi" molecolare" delle"mutazioni" del" DNA" dovute" a" espansione" o" delezione" di"triple2e"

•l’importanza"dei"test"geneFci"e"della"medicina"prediCva"

Metodi*sperimentali*

• Amplificazione"di"una"regione"specifica"del"DNA"con"PCR"• Analisi"dei"prodoC"della"PCR"con"ele2roforesi"su"gel"di"agarosio"

1.*Le*mutazioni*geniche*

Le"mutazioni" geniche" sono" cambiamenF" della" sequenza" o" del" numero" di" nucleoFdi" di" un"individuo."Sono"errori"geneFci"che"risultano"parFcolarmente"gravi"se"avvengono"nella"fase"di"replicazione"del"DNA"e"possono"coinvolgere"sia"le"cellule"somaFche"sia"le"cellule"germinali."Quando" avvengono" nelle" cellule" somaFche" possono" essere" alla" base" dell’insorgenza" di"tumori," mentre," quando" coinvolgono" le" cellule" germinali," possono" determinare" anomalie"congenite"nei"figli."Le"mutazioni"possono"essere"di"Fpo"spontaneo,"come"errori"nell’inserimento"dei"nucleoFdi"durante"la"replicazione"del"DNA,"o"indo2e"da:"" agen<*fisici"• radiazioni"ad"alta"energia"che"danno"origine"a"ioni"e"radicali"liberi"ad"effe2o"mutageno"• raggi"UV,"che"causano"legami"anomali"fra"le"basi"azotate"come"i"dimeri"di"Fmina""• esposizione"ad"alte"temperature""" chimici*"• sostanze"chimiche"con"una"stru2ura"molecolare"simile"a"quella"delle"normali"basi"azotate"che"si"trovano"nel"DNA"e"che"vengono"incorporate"al"loro"posto"

• sostanze" chimiche" che" agiscono" da" mutageni" modificando" dire2amente" la" stru2ura"chimica"e"le"proprietà"delle"basi."

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Le"mutazioni"geniche"(fig."1)"si"classificano"in:"

● inserzione" (aggiunta" di" 1X2" basi)" o"delezione" (perdita" di" 1X2" basi):" shiY" di" tu2e" le"triple2e" a" valle" della" mutazione." QuesF" due" Fpi" di" mutazioni," de2e" FRAMESHIFT"(scorrimento" della" cornice" di" le2ura)" producono" un" prodo2o" genico" fortemente"alterato"o"non"funzionante."

● sos<tuzione* di* una* base:" può" produrre" una" triple2a" di" stop" (UAAXUGAXUAG)." In"questo"caso"la"mutazione"interromperà"la"sintesi"del"prodo2o"genico"generando"una"proteina" incompleta" (MUTAZIONE" NON" SENSO)." Alcune" mutazioni" dovute" alla"sosFtuzione" di" una" base" sono"MUTAZIONI" SILENTI" perchè" producono" una" triple2a"sinonimo"di"quella"originale"(degenerazione"del"codice"geneFco)"e,"di"conseguenza,"il"prodo2o"genico"non"cambia."Può"anche"accadere"che"la"triple2a"mutata"codifichi"per"un" aminoacido" diverso" da" quello" originale" (MUTAZIONE" MISSENSO)" e" quindi" la"stru2ura"della"proteina,"e"di"conseguenza"la"sua"funzione"specifica,"potrebbe"essere"amplificata," rido2a" oppure" non" modificata." Questo" aspe2o" è" alla" base" della"variabilità"geneFca"su"cui" lavora" la"selezione"naturale"e"risulta"quindi" fondamentale"per" il" processo" evoluFvo." Talvolta" invece," il" cambiamento" di" una" base" azotata"determina" la" sosFtuzione" di" un" aminoacido" fondamentale" per" la" stru2ura"tridimensionale"della"proteina"comprome2endone"la"funzione.""

● mutazioni*che*alterano*lo*splicing:"interessa"una"sequenza"nucleoFdica"cruciale"per"il"meccanismo"di"splicing" "di"un"trascri2o"primario"di"RNA;"come"conseguenza"si"avrà"il"blocco"o" la"modificazione"dello"schema"di"splicing"di"quel"trascri2o,"con" la"mancata"produzione"del"mRNA"corrispondente"o"la"produzione"di"un"mRNA"modificato"

● mutazioni*dinamiche:"dovute"alla"espansione"di"una"triple2a"di"DNA"

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Fig"1:"Fpi"diversi"di"mutazione."Le"mutazioni"punFformi"(fa2a"eccezione"per"le"mutazioni"sinonime)"causano"quasi"sempre"la"produzione"di"una"proteina"con"funzionalità"alterata.

2.*Che*cosa*e’*il*pedigree?**

Uno"degli"aspeC"della"geneFca"è"lo"studio"dei"meccanismi"con"cui"i"geni"sono"trasmessi"dai"genitori"ai"figli."A"tale"scopo"i"geneFsF"effe2uano"accoppiamenF"tra"organismi"della"stessa"specie,"per"analizzare"la"trasmissione"dei"cara2eri."Nella"geneFca"umana,"gli"accoppiamenF"

sperimentali" ovviamente" non" sono"possibili." Molte" delle" nostre" conoscenze"sull’ereditarietà" dei" cara2eri" umani"derivano" perciò" dalla" analisi" degli" alberi"genealogici"o"pedigree."I n" p r a F c a ," i l" p e d i g r e e" è" l a"rappresentazione" sistemaFca" della" storia"familiare" a2raverso" l’uso" di" simboli"standardizzaF" (Fig.2.1)." Il" pedigree" viene"sFlato" partendo" da" un’intervista" ai"componenF" di" una" famiglia," al" fine" di"ricostruirne" la" storia" (anamnesi);" in"questo" modo" è" possibile" seguire" la"

trasmissione" di" un" dato" cara2ere" a2raverso"parecchie" generazioni" in" una" famiglia" (Fig.2.2)." Le"generazioni" si" indicano"con" i" numeri"romani;" gli" individui" di" ciascuna" generazione"si"indicano"con"i"numeri"arabi."

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Analisi*dei*pedigree*

L’analisi"del"pedigree"perme2e"di"determinare"se"il"cara2ere"ha"una"modalità"di"trasmissione"recessiva" o" dominante," e" se" il" gene" in" quesFone" è" localizzato" su" un" autosoma" o" su" un"cromosoma"sessuale."Perme2e,"in"ulFma"analisi,"di"informare"i"membri"di"una"famiglia"sulla"probabilità"di"trasme2ere"queste"malaCe"ai"propri"figli."Dall’analisi"di"un"pedigree"si"può"determinare"(talvolta"non" in"modo"univoco," in"quanto"un"pedigree"può"essere"compaFbile" con"più"di"una"modalità"di" trasmissione"ereditaria)" come"viene" trasmesso" un" dato" cara2ere." Analizziamo" le" cara2erisFche" dei" pedigree" relaFvi" a"cara2eri:"● autosomici"recessivi"(AR)"● autosomici"dominanF"(AD)"● legaF"al"cromosoma"X"recessivi"(XR)"● legaF"al"cromosoma"X"dominanF"(XD)"

● legaF"al"cromosoma"Y"

CaraGeris<che:" possono" essere" affeC" sia" i" maschi" sia" le" femmine;" in" genere" gli" individui"affeC"hanno"genitori"sani"(portatori"asintomaFci)."I"genitori"entrambi"portatori"sani"hanno"il"25%"di"probabilità"di"avere"figli"malaF"ad"ogni"gravidanza;"l’incidenza"della"malaCa"aumenta"in"caso"di"consanguineità."TuC"i"figli"di"genitori"entrambi"affeC"(omozigoF)"sono"a"loro"volta"

affeC"(fig."2.3)."

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Fig.2.4" albero" genealogico" e"quadrato"di"Punne2"di"una"malaCa"autosomica"dominante.

Fig."2.3"

albero"genealogico"e"quadrato"di"Punne2"

di"una"malaCa"autosomica"recessiva.

CaraGeris<che:* possono" essere" affeC" sia" i" maschi" sia" le" femmine;" gli" individui" affeC"possono"essere"presenF"in"tu2e"le"generazioni"e"hanno"sempre"un"genitore"affe2o"(fig."2.4)."Poiché"i"geni"responsabili"di"malaCe"autosomiche"dominanF"sono"rari,"in"genere"gli"individui"affeC"sono"eterozigoF."Rarissimi" sono"gli"omozigoF,"che"possono"nascere"solo"da"genitori"entrambi"eterozigoF."Ogni"affe2o"(eterozigote)"ha"il"50%"di"probabilità"di"avere"figli"malaF;"individui" non" affeC"del" pedigree" che" sposano" individui" non" affeC"hanno"discendenF"non"affeC."Genitori"entrambi"affeC"(eterozigoF)"possono"avere"figli"sani"(25%),"mentre"genitori"di"un"bambino"malato"possono"essere" sani:" in"questo" caso" si"può"dedurre" che" la"malaCa"origina"da"una"nuova"mutazione"verificatasi"durante"la"formazione"di"un"gamete"(mutazione"

“de"novo”)"."

CaraGeris<che:" la" frequenza" della" malaCa" è" maggiore" nei" maschi" che" nelle" femmine," le"quali"possono"essere"portatrici"sane."Le"donne"portatrici"hanno"un"rischio"del"50%"di"avere"figli"maschi"malaF;"i"maschi"affeC"hanno"figlie"portatrici"sane"e"figli"maschi"sani,"mentre"la"madre"di"un"individuo"affe2o"è"portatrice"sana."Il"cara2ere"si"trasme2e"a"zigXzag"con"maschi"affeC"in"generazioni"diverse"(eredità"diaginica)."Madri"portatrici"di"una"mutazione"recessiva"

sul"cromosoma"X"hanno"il"50%"di"probabilità"di"avere"figlie"portatrici"(fig."2.5)."

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Fig." 2.5" albero" genealogico" e"quadrato" di" Punne2" di" una"malaCa"XXlinked"recessiva."

Fig.2.6"albero"genealogico"e"quadrato"di"Punne2"di"una"malaCa"XXlinked"dominante."

CaraGeris<che:*maschi" affeC" generano" solo" femmine" affe2e," mentre" i" figli" maschi" sono"sempre"sani."Femmine"eterozigoF"affe2e"trasme2ono"il"cara2ere"al"50%"dei"figli"siano"essi"maschi"o"femmine."La"frequenza"della"malaCa"nelle"femmine"è"solitamente"doppia"di"quella"nei"maschi"(fig."2.6)."

CaraGeris<che:"i"pochi"cara2eri"individuaF"si"manifestano"solo"nei"maschi"e"sono"trasmessi"dire2amente"da"padre"a"figlio"(eredità"olandrica,"fig."2.7)."

Le"malaCe" associate" ad" uno" o" più" geni" sono" elencate" nel" catalogo" online"OMIM" (Online"Mendelian" Inheritance" in" Man)," h2p://www.omim.org/," una" banca" daF" che" conFene"informazioni"sui"geni"umani"e"sulle"malaCe"geneFche"realizzata"e"mantenuta"dall’NCBI,"the"NaFonal"Center"for"Biotechnology" InformaFon."La"banca"conFene" la"descrizione"dei"geni"e"delle" malaCe" ad" essi" associate," i" quadri" clinici" e" i" riferimenF" bibliografici," oltre" a" link" a"sequenze" e" ad" altre" risorse" web." Si" tra2a" della" versione" onXline" del" testo" “Mendelian"Inheritance" in" Man”," a" cura" del" geneFsta" medico" Victor" A." McKusick" e" di" un" gruppo" di"colleghi" della" Johns" Hopkins" University" e" di" altre" isFtuzioni." La" banca" daF" è" aggiornata"quoFdianamente" e" si" raggiunge" tramite" un" link" dalla" homepage" dell’NCBI:" (h2p://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

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Fig.2.7" albero" genealogico" e"quadrato" di" Punne2" di" una"malaCa"YXlinked.

3.*Mutazioni**determinate*da*espansione*del*numero*di*tripleGe*

Nei" geni" esistono" porzioni" di" DNA" con" triple2e" ripetute" in" tandem" (testaXcoda)" che"normalmente" si" stabilizzano" tra" una" generazione" e" l’altra." Non" alterando" la" le2ura" e" la"traduzione" del" gene" stesso," la" proteina" che" viene" prodo2a" non" è" diversa" dalla" versione"originale.""E’" stato" osservato" che" regioni" con" un" alto" numero" di" ripeFzioni" in" tandem" di" alcune"

parFcolari" triple2e" (CAG," CCG," CGG,"GAA,"CTG)""risultano"essere"veri"punF"caldi"per"questo"genere"di"mutazione."Il" modello" proposto" per" spiegare"questa"amplificazione"(Fig."3.1)." "è" la"formazione" di" anse" (stru2ure" in" cui"ripeFzioni" in" tandem" si" appaiano"sullo" stesso" filamento)." Al" momento"della" replicazione," queste" stru2ure""causerebbero" instabilità" della" DNA"polimerasi" che" verrebbe" indo2a" a"ripetere" l'inserzione" di" triple2e,"aumentandone"il"numero."

* 3.1*Meccanismo*molecolare*dell’espansione*di*tripleGe*

Il" meccanismo" molecolare" alla" base" del" fenomeno" dell’aumento" del" numero" di" triple2e"idenFche"in"un"tra2o"del"DNA"è"de2o"“slippage""o"sli2amento"della"replicazione,"e"consiste"nell'aggiunta"di"più"triple2e"(Fig.3.2).""

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Fig.3.1' Tipiche' formazioni' a' uncino' presenti' in' tratti' di'DNA'con'ripetizioni'di'basi.

Fig.3.2"Meccanismo"dello"s l i p p a ge" c he" po r t a"a l l ’ i n s e r i m e n t o" d i"triple2e"aggiunFve

Il"meccanismo"è"simile"a"quello"che"genera"le"mutazioni"FRAMESHIFT,"solo"che"nel"caso"dello"“slippage"“"si"ha"lo"scivolamento"con"l’inserzione"di"gruppi"di"triple2e"idenFche."Come"mostrato" in" Fig." 3.2," lo" “slippage”" sul" filamento" di" DNA" in" fase" di" neosintesi" porta"all’espansione"di"una"o"più"triple2e."Lo"“slippage”"sul"filamento"di"DNA"stampo"porta"ad"una"delezione"di"triple2e"(più"raro,"non"mostrato"nella"figura)."

3.2*Patologie*causate*da*espansione*di*tripleGe*(TRED,"TrinucleoFde"Repeat"Disorders)**A"causa"delle"espansione"di"triple2e"si"genera"una"condizione"di"instabilità*mito<ca,"se"sono"coinvolte"linee"cellulari"somaFche,"o"meio<ca,"se"sono"coinvolte"linee"germinali"e"quindi"con"trasmissione"alle"generazioni"successive."L’instabilità*mito<ca" determina" la" presenza" di" espansioni" di" triple2e" differenF" all’interno"dello"stesso"tessuto"e"tra"tessuF"differenF."Produce"dunque"un"mosaicismo"Fssutale."L’instabilità* meio<ca" determina" la" trasmissione" alle" generazioni" successive" di" una"espansione" di" diversa" ampiezza." E’" anche" alla" base" del" meccanismo" dell’an<cipazione*ovvero"del"fa2o"che"la"gravità"della"malaCa"aumenta"da"una"generazione"alla"successiva"e"i"

sintomi"della"patologia"si"manifestano"prima.""L’instabilità*meio<ca"è"in"grado"anche"di"spiegare"il"fenomeno"della"preOmutazione*(in"giallo"nella" Fig" 3.3)" nei" portatori" sani," nei" quali" il" “valore" soglia”" delle" ripeFzioni" non" è" stato"superato"e"pertanto"non"si"manifesta"alcun"sintomo."Le" conseguenze" sono" ovviamente" differenF" a" seconda" della" regione" in" cui" si" trova"l’espansione"di"triple2e"(Fig."3.3):"

• " "Espansione* di* tripleGe* in* regioni* non* codifican<:*nella" regione" 5’"UTR" (Sindrome"dell’XXfragile),"nella"regione"3’"UTR"(Distrofia"miotonica)"o"in"un"introne"(Atassia"di"Friedrich).""

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Fig.3.3"Schema" riassunFvo"di" alcune"patologie"da"espansione"di" triple2e."Per" ciascuna," sono"evidenziate" la"posizione"all’interno"del"gene"e"il"numero"di"ripeFzioni"presenF"nei"soggeC"sani,"con"premutazione"e"malaF."N.B." Ovviamente" i" 4" geni" malaCa" non" sono" tuC" sullo" stesso" cromosoma!" Nella" figura" sono" indicaF" gli"elemenF"di"un"gene"eucarioFco"e,"per"ciascuna"patologia,"la"posizione"e"il"numero"di"ripeFzioni"all’interno"del"gene"interessato"dall’espansione"di"triple2e.

Cromosoma X Sindrome X fragile

Cromosoma 4 Corea di Huntington

Cromosoma 19 Distrofia Miotonica

Cromosoma 9 Atassia di Friedreich

• "" Espansione* di* tripleGe* in* regioni* codifican<:" la" mutazione" è" responsabile" della"sintesi" di" una" proteina"mutata" nella" sua" sequenza," con" lunghe" ripeFzioni" di" uno"stesso"amminoacido,"con"conseguente"perdita"della"funzionalità"o"manifestazione"di"tossicità"(Corea"di"HunFngton)."

4.*Corea*di*Hun<ngton*OMIM*143100*

La"malaCa" di" HunFngton" (HD:" HunFngton" Disease)," o" Corea" di" HunFngton," è" una"malaCa" geneFca" neurodegeneraFva" del" sistema" nervoso" centrale" che" colpisce" la"coordinazione"muscolare"e"porta"ad"un"declino"cogniFvo"e"a"problemi"psichiatrici."Le"zone"del"cervello"più"colpite"sono"quelle"correlate"ai"movimenF"e"quelle" legate"alla"memoria"a"breve"termine."La"prima"descrizione"completa"della"malaCa"fu"fa2a"dal"medico"George"HunFngton,"da"cui"il"nome,"nel"1872"(Fig."4.1).""

Frequenza"La"prevalenza"nella"popolazione"Caucasica"è"sFmata"in"1/10.000X1/20.000."Esordisce"Fpicamente"durante"la"mezza"età;"in"alcuni"casi"i"sintomi"si"manifestano"prima"dei"20"anni," con" disturbi" del" comportamento" e" difficoltà" di" apprendimento" (malaCa" di"HunFngton"giovanile,"JHD)."E’"la"malaCa"geneFca"che,"nei"quadri"clinici"neurologici,"si" manifesta" più" frequentemente" con" movimenF" involontari" anomali." QuesF""movimenF"ricordano"una"danza"da"cui"deriva"il"nome"della"malaCa:"in"greco"choreia,"significa"danza.""

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Fig.4.1"ArFcolo"originale"pubblicato"nel"1872"dal"do2."George"HunFngton.

È"molto"più"comune"nelle"persone"di"discendenza"europea"occidentale"rispe2o"a"chi"è" di" origine" asiaFca" o" africana," questo" perché," nella" popolazione" di" discendenza"europea,"l’allele"del"gene"dell’hunFngFna"con"ripeFzioni"di"CAG"tra"28"e"35"è"molto"più"frequente""

Cause"La"malaCa"è"causata"da"una"mutazione" in"una"delle"due"copie"(alleli)"del"gene"che"codifica"per"la"proteina"chiamata"hunFngFna,"presente"sul"cromosoma"4."Si"tra2a"di"una"mutazione"autosomica"dominante" (AD)."La"base"geneFca"della"malaCa"è"stata"scoperta" nel" 1993" grazie" ad" una" ricerca" internazionale" guidata" dalla" Hereditary"Disease"FoundaFon.""La" mutazione" consiste" in" un" aumento" eccessivo" di" ripeFzioni" della" triple2a"nucleoFdica"CAG,"che"codifica"per"l’amminoacido"glutammina"(Gln"o"Q)."L’individuo"è"sano"se"ha"meno"di"35"ripeFzioni,"è"malato"se"ne"ha"più"di"40."Tra"35"e"40"ripeFzioni"l’individuo"può"sviluppare"la"malaCa,"nel"caso"avvenga"un’espansione"del"numero"di"triple2e."L’espansione" avviene" in" vari" stadi" dello" sviluppo," in" diversi" Fpi" di" cellule," ed" è"sensibile" al" sesso" del" genitore" che" la" trasme2e." Si" è" osservato," ad" esempio," che"l’allele" HD" trasmesso" per" via" paterna" è" più" propenso" ad" espandere" il" numero" di"triple2e."Per"questo"moFvo,"un"individuo"con"padre"affe2o"da"HD"ha"più"probabilità"di"sviluppare"la"malaCa"di"uno"con"madre"affe2a"da"HD"(Fig."4.3).""

Quando*l’hun<ng<na*è*mutata"Il" gene" che" produce" la" proteina" chiamata" hunFngFna" (HG)" è" IT15" (InteresFng"Transcript" 15)." Viene" espresso" in" tu2e" le" cellule" di"mammifero" con" concentrazioni"maggiori"nel"cervello"(nucleo"striato)"e"nel"tesFcolo,"e"moderate"quanFtà"nel"fegato,"cuore"e"polmoni."""Le"ripeFzioni"eccessive"di"Gln"nell’hunFngFna"mutata"(mHG)"causano"la"formazione"di"aggregaF"di"hunFngFna"nel"cervello,"tossici"per"i"neuroni."

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Fig.4.3'Tabella'con'le'principali'informazioni'riguardanti'la'malattia'HD

Manifestazioni*cliniche"I"sintomi"fisici"della"malaCa"possono"iniziare"a"qualsiasi"età,"ma"più"frequentemente"tra" i" 35" e" i" 40" anni" (insorgenza" tardiva)." I" primi" sintomi" sono" collegaF" a" problemi"dell'umore"o"della"cognizione"a"cui"segue"una"generale"mancanza"di"coordinazione"e"una"andatura"instabile."La"distonia"(ad"es."il"torcicollo)"può"essere"il"primo"segno"della"malaCa" di" HunFngton." Il" linguaggio" e" la" degluFzione" diventano" gradualmente" più"problemaFci," con" il" rischio" di" soffocamento." TuC" i" pazienF" sviluppano" ipocinesia"(rallentamento"o"riduzione"dei"movimenF"spontanei)"e"rigidità."Con"l'avanzare"della"malaCa"i"movimenF"non"coordinaF"del"corpo"diventano"sempre"più"evidenF"e"sono"accompagnaF" da" un" calo" delle" capacità" mentali" e" dalla" insorgenza" di" problemi"comportamentali" e" psichiatrici." Le" complicanze," come" la" polmonite," le" malaCe"cardiache" e" i" danni" fisici" da" cadute," riducono" l'aspe2aFva" di" vita" a" circa" 20" anni" a"parFre"dall'esordio"dei"sintomi."

Terapia*e*prognosi*

Fino" ad" oggi" non" esiste" una" cura" per" questa" malaCa" e," nelle" fasi" più" avanzate,"diventa"necessaria"un’assistenza"a"tempo"pieno."I"tra2amenF"sono"solo"farmacologici"e"non"possono"alleviare"molF"dei"numerosi"sintomi."

Alcune terapie"in"via"di"sperimentazione"sono"descri2e"nell’allegato."

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5.*Atassia*di*Friedreich*OMIM*229300*

L’atassia" di" Friedreich" (FRDA)" è" una" malaCa" neurodegeneraFva" che" interessa" il" midollo"spinale"e"il"cervelle2o."Consiste"nella"progressiva"perdita"della"coordinazione"muscolare"che"quindi"rende"difficoltosa"l'esecuzione"di"alcuni"movimenF"volontari."Questa"forma"di"atassia,"descri2a" nel" 1863" dal" Dr." Friedreich" (Fig." 5.1)" in"famiglie" con" alF" livelli" di" consanguineità," ha" una"

modalità"di"trasmissione"autosomica"recessiva."

Frequenza

La" frequenza" della" patologia" nella" popolazione"caucasica" è" sFmata" in" 1:29000X50000." L'incidenza" è"molto" più" bassa" negli" asiaFci" e" nei" soggeC" di"discendenza" africana." La" frequenza" dei" portatori" è"sFmata"essere"1:60X120."

Cause"Nel" 97%" dei" casi" la" malaCa" è" dovuta" all’espansione"della"triple2a"GAA."Nel"primo"introne"del"gene"FXN"sul"cromosoma"9"(9q21.11)"gli"individui"sani"presentano"un"numero"di"ripeFzioni"da"5"fino"a"circa"33"volte"(la"maggior"parte"meno"di"12)"della"triple2a"GAA."Sono"portatori"di"premutazione"i"soggeC"con"ripeFzioni"che"vanno"da"34"a"65,"mentre"nelle"persone"malate,"la"triple2a"si"trova"ripetuta"da"66"fino"a"1700"volte"(la" maggior" parte" fra" 600" e" 1200)." Il" gene" FXN" codifica" una" proteina" della" famiglia" delle"frataxine."Si"tra2a"di"una"proteina"mitocondriale"che"lega"il"Ferro"e"ne"controlla"l'ingresso"nei"mitocondri"ed"è"coinvolta"nella"respirazione"cellulare."Le"ripeFzioni"eccessive"provocano"una"diminuzione"di"livello"sia"degli"mRNA"che"della"proteina,"che"viene"prodo2a"solo"in"minima"parte."Cause"della"malaCa"sembrano"essere"un"aumento"della"concentrazione"di"ferro"libero"all’interno"dei"mitocondri"con"gravi"danni"della"funzione"respiratoria"e"stress"ossidaFvo"(da"radicali" liberi" in" eccesso)" delle" cellule." Le" cellule"maggiormente" colpite" sono" i" neuroni" del"midollo"spinale,"della"corteccia"e"del"cervelle2o.""

Manifestazioni*cliniche

I"primi"sintomi"sono"la"difficoltà"nella"corsa"e"nelle"aCvità"sporFve"in"genere,"una"goffaggine"

generale"e"scarsa"coordinazione"(atassia)"durante"la"deambulazione."

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" Fig." 5.1" Dr." Nicolaus" Friedreich,"neurologo" e" patologo" tedesco" che" nel"1863" descrisse" per" la" prima" volta" la"sindrome"dell’atassia

La"malaCa"comporta"una"progressiva"perdita"della"coordinazione"motoria:"vengono"colpiF"generalmente" per" primi" gli" arF" inferiori," provocando" instabilità" nel" cammino."Successivamente" compaiono" disturbi" nella" coordinazione" delle" mani" e" nell’arFcolazione"della" parola." Frequentemente" si" manifestano" cardiopaFa" e" diabete."Mediamente" 15" anni"dopo" l'esordio" della" malaCa" si" ha" perdita" della" deambulazione" e" molF" sono" i" pazienF"costreC" all’uso" della" sedia" a" rotelle." L'intelligenza" non" appare" compromessa"ma" possono"essere" presenF" problemi" di" udito," di" vista" (fissazione" instabile" dello" sguardo)" e" di"degluFzione." Il"numero"di" ripeFzioni"della" triple2a"è" inversamente"proporzionale"all'età"di"esordio"della"patologia"e"al"tempo"che"intercorre"tra"l'esordio"e"la"dipendenza"dalla"sedia"a"rotelle"mentre"è"dire2amente"proporzionale"alla"prevalenza"della"cardiomiopaFa."

Terapia*e*prognosi

er"ridurre" la"sintomatologia"dovuta"allo"stress"ossidaFvo." I"pazienF"con"cardiopaFa"vengono"tra2aF"con"anFcoagulanF,"anFaritmici"e"pacemaker,"mentre"quelli"con" diabete" mellito" di" solito" necessitano" dell'insulina." Assume" parFcolare" importanza" il"tra2amento" terapeuFco"riabilitaFvo"con" l’uFlizzo"di"protesi"e" sedia"a" rotelle"che"aiutano"a"mantenere" uno" sFle" di" vita" aCvo." La" vita"media" è" di" circa" 40" anni," a" seconda" dell'età" di"esordio" e" della" comparsa" del" diabete" e" della" cardiomiopaFa." Il" decesso" è" essenzialmente"

dovuto"alla"cardiopaFa"e"alla"broncopolmonite.

Diagnosi

La" conferma" diagnosFca" viene" effe2uata" mediante" l’analisi" molecolare" che" idenFfica" le"mutazioni"nel"gene"FXN."L’analisi" molecolare" è" effe2uata" sui" pazienF" e" loro" familiari" oppure" come" test" prenatale,"a2raverso" la" villocentesi" o" l’amniocentesi." Si" uFlizzano" due" metodiche" che" sono" fra" loro"complementari:"la"PCR,"rapida"ma"può"rivelarsi"problemaFca"per"gli"individui"eterozigoF,"e"il"southern"blot"che"perme2e"di"diagnosFcare"con"precisione"le"mutazioni."Il"southern"blot"prevede"che"il"DNA,"tagliato"con"enzimi"di"restrizione,"venga"so2oposto"ad"ele2roforesi" su" gel" di" agarosio" e" successivamente" trasferito" su"un"filtro"di" nitrocellulosa"o"nylon:" l’uso" di" sonde" radioaCve" o" fluorescenF" consente" di" idenFficare" una" sequenza"bersaglio"perchè"complementare"a"quella"delle"sonde.""

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6.*XOFragile*OMIM*300624*

La" sindrome"dell’X" fragile," o" sindrome"di"MarFnXBell," è" la" causa" più" frequente" del" ritardo"

mentale"ereditario"nei"maschi"dopo"la"sindrome"di"Down.Prende"nome"dal"sito""fragile""del"cromosoma"X"che"appare,"dagli"studi"di"laboratorio,"come""ro2o""(Fig."6.1).""

Al"contrario"della"sindrome"di"Down,"che"solitamente"colpisce"un"individuo"per"famiglia," la"sindrome"dell'X"Fragile"può"colpire"più"componenF"della"stessa"famiglia"ed"altri"parenF.""Per"esempio," è" abbastanza" comune" che" due" fratelli" siano" colpiF" oppure" anche" due" cugini,"oppure" nipote" e" zio." Perciò," diagnosFcare" un" bambino" affe2o" da" questa" patologia" ha"implicazioni"geneFche"di"primaria"importanza"anche"per"il"resto"della"famiglia,"sia"che"si"taC"di" parenF" vicini" che" di" parenF" lontani," che" potrebbero" essere" portatori" sani" del" gene" X"Fragile"(allele"premutato)"senza"saperlo,"e"pertanto"correre"il"rischio"di"generare"figli"affeC."

Frequenza

Questa"patologia"colpisce:"1"maschio"su"4000;""1"femmina"su"6000."

Cause*"Questa"sindrome"è"una"malaCa"geneFca"causata"dalla"mutazione"del"gene"FMR1"(Fragile/X/Mental/Retarda6on71),"situato"sul""braccio"lungo"del""cromosoma"X"(Xq27.3),"che"genera"una"strozzatura"nella"regione"terminale"dove"è"situato"il"gene.""L’X" fragile" è" causata" da" una"mutazione" dinamica" che" interessa" l’espansione" progressiva" di"triple2e" CGG" nella" regione" 5’UTR" del" gene" FMR1." Conseguenza" della" espansione" è" il"silenziamento" del" gene" e" l’assenza" della" proteina" FMRP" (Fragile/ X/ Mental/ Retarda6on/Protein)."Questa"proteina,"espressa"sopra2u2o"nel"tesFcolo"e"nel"cervello,"è"implicata"nello"

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Fig.6.1" Fpica" forma" del" cromosoma" X" di" una"persona" affe2a" da" sindrome" dell’X" fragile:" si"può" notare" la" Fpica" strozzatura" nel" braccio"lungo"del"cromosoma."

sviluppo"delle"connessioni"neuronali"del"cervello."Il"suo"ruolo"nel"tesFcolo"non"è"stato"ancora"chiarito.""Normalmente" il" numero"di" triple2e"CGG"contenute"nel"5’UTR"è" compreso" tra" le"6"e" le"54"copie;"un’espansione"tra"55"e"200"copie"definisce"un"sogge2o"premutato"portatore"sano"di"XXfragile," in" grado"di" produrre" la" proteina;" gli" affeC"hanno"più"di" 200" copie"della" triple2a"CGG"(Fig."6.2)."

La" trasmissione" può" avvenire" in" maniera" asintomaFca" oppure" può" innescare" un’ulteriore"espansione" fino" a" raggiungere" la" mutazione" completa;" la" sindrome" ha" una" trasmissione"dominante" legata" al" cromosoma" X" con" penetranza" rido2a" nelle" femmine." Può" essere"trasmessa"dalla"madre"ai"propri"figli"(maschi"o"femmine)"e"dal"padre"a"tu2e"le"figlie"femmine"(il" gene" FMR1" non" può" essere" trasmesso" dal" padre" ai" figli" maschi," a" cui" passano" solo" il"

cromosoma"Y).Il"gene"FMR1"può"esistere"nello"stadio"di"premutazione"in"una"famiglia"per"parecchie"generazioni" senza" che" causi" alcuni" problemi" di" sviluppo" ma" può" espandersi" nel"passaggio"da"una"generazione"all’altra"(Fig."6.3)."La"tendenza"all’espansione"si"verifica"maggiormente"quando"la"premutazione"è"trasmessa"per"via"materna."""

Manifestazioni*cliniche"Si" accompagna" comunemente" a" disturbi" del" comportamento" e" ad" altri" problemi" dello"sviluppo," come" disfunzioni" specifiche" dell'apprendimento," auFsmo" e" difficoltà"comportamentali" significaFve." I" sintomi"della"malaCa" sono" spesso"più" lievi"nelle" femmine"rispe2o"ai"maschi."

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Fig.6.2' localizzazione' e' numero' di' ripetizioni' della' tripletta' CGG'presenti'nella'persona'normale,'premutata'e'malata.

La"patologia"non"compare"alla"nascita,"si"manifesta"progressivamente,"dai"primi"mesi"di"vita"alla"pubertà."

Terapia*e*prognosi"Non"esiste"una"terapia"risoluFva."È"però"possibile" il" tra2amento"dei" sintomi"per"migliorare" la"qualità"della" vita"dei" pazienF,"combinando" l’impiego" di" varie" categorie" di" psicofarmaci" per" tra2are" autolesionismo,"comportamento"aggressivo"e"auFsmo."Per"disturbi"d'ansia"e"ossessivoXcompulsivi"vengono"usaF"gli"sFmolanF"e"inibitori"seleCvi"della"ricaptazione"della"serotonina"(SSRI).""

Data"la"plasFcità"del"cervello"dei"bambini","l’intervento"precoce"è"molto"importante"al"fine"di"favorire"l’integrazione"e"il"recupero."Oltre"ai"farmaci,"devono"quindi"essere"presi"in"considerazione"gli"intervenF"possibili"in"molF"se2ori," come" educazione," istruzione," riabilitazione," intervenF" logopedici," fisioterapici," e"occupazionali,"tuC"direC"a"migliorare"l’autonomia"dei"pazienF."

Diagnosi

Essendo"un"fenoFpo"con"manifestazioni" lievi"alla"nascita," la"diagnosi"clinica"della"sindrome"

dell’X"fragile"è"difficile"nei"bambini.Le" famiglie" all’interno"delle" quali" sia" presente"un" sogge2o"affe2o"dalla" sindrome"possono"avvalersi" di" una" consulenza" geneFca" che" possa" informarle" sul" rischio" di" incidenza" della"

malaCa.Sebbene" sempre" più" individui" e" famiglie" colpiF" da" sindrome" dell'XXfragile" vengano"

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Fig." 6.3" a" sinistra:" trasmissione" per" via" materna." La" tendenza" all’espansione" si" verifica"

maggiormente"quando" la"premutazione"è"trasmessa"per"via"materna;"durante" la"maturazione"

dell’ovulo"la"premutazione"può"espandersi"e"diventare"mutazione"completa."

a"destra:"trasmissione"per"via"paterna."Quando"la"premutazione"è"trasmessa"dal"padre"rimane"

stabile;" le" figlie" femmine" riceveranno" la" premutazione" senza" che" avvengano" variazioni" nel"

numero"delle"triple2e"CGG."I"figli"maschi"ricevono"dal"padre"il"cromosoma"Y,"pertanto"non"sono"

a"rischio"di"ereditare"la"premutazione.

idenFficaF,"essa"rimane"ancora"largamente"sconosciuta"e"so2ovalutata."Eppure"una"diagnosi"precoce" è" di" grande" importanza" per" le" famiglie," ai" fini" di" avere" una" consulenza" geneFca"appropriata"e"quindi"un"intervento"precoce,"che"migliora"le"possibilità"di"condurre"una"vita"

produCva"e"soddisfacente.La" diagnosi" (anche" prenatale" sui" villi" coriali" o" sul" liquido" amnioFco)" può" essere" effe2uata"mediante" l’analisi" del" carioFpo" che" evidenzia" la" forma"Fpica" che" il" cromosoma"X" ha" negli"affeC;"l’indagine"dell’espansione"della"triple2a"può"essere"eseguita"tramite"test"basaF"sulla"reazione"a"catena"della"polimerasi"(PCR)."

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7.*Distrofia*Muscolare*di*Duchenne*OMIM*310200"

Frequenza"La"Distrofia"Muscolare"di"Duchenne"(DMD)"è"una"malaCa"degeneraFva"della"muscolatura"con"trasmissione""XXlinked"recessiva,"che"colpisce"1"su"3.500X5.000"maschi"naF"vivi.""

Cause"La"distrofia"muscolare"è"dovuta"alla"mutazione"del"gene"DMD"localizzato"sul"cromosoma"X,"che"produce"una"grossa"proteina"chiamata"distrofina,"composta"di"3.685"aminoacidi.""La"Distrofina"è"una"proteina"citoplasmaFca"a"forma"di"bastoncino"che"conne2e,"a2raverso"la"membrana," il" citoscheletro" di" una" fibra"muscolare" con" la"matrice" extraXcellulare." In" realtà"forma"un"complesso"proteico"molto"arFcolato"di"cui"la"distrofina"è"solo"una"parte"(Fig."7.1)."La"mancanza"di"distrofina" induce"degenerazione"e"morte"delle"cellule"delle"fibre"muscolari"che"vengono"sosFtuite"da"tessuto"conneCvo"fibroFco."""Mutazioni"nel"gene"della"distrofina"causano"distrofie"di"diversa" severità,"dalla" forma"grave"

come" la" distrofia" muscolare" di" Duchenne" (DMD;" 310200)" a" quella" meno" severa" come" la"distrofia" muscolare" di" Becker" (BMD;" 300376)." Le" analisi" del" DNA" dei" pazienF" con" DMD"

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Fig." 7.1" La" Distrofina" ha" la" funzione" di" conne2ere" la" membrana" al" citoscheletro,"rappresentato"dai"filamenF"di"AcFna"(in"rosso)"delle"cellule"del"muscolo"scheletrico"e" del" muscolo" cardiaco." La" Distrofina" (in" giallo)" è" ancorata" alla" membrana"sarcoplasmaFca"mediante"un"complesso"glicoproteico"(βXdistroglicano,"Sarcoglicano,"Sintrofina,"Distrobrevina)"agganciato"alla"matrice"extracellulare.

evidenziano"delezioni"che"provocano"un"frameXshiY,"ovvero"uno"sli2amento"nella"le2ura"del"DNA," che" produce" un" mRNA" errato," per" cui" la" distrofina" non" viene" prodo2a" o" viene"rapidamente"degradata"(Fig"7.2).""

Anche" le" mutazioni" che" causano" la" distrofia" muscolare" di" Becker" (BMD)" sono"prevalentemente"(80X85%"dei"casi)"grandi"delezioni."Le"delezioni"però"mantengono"il"modulo"di" le2ura" consentendo" la" produzione" di" una" proteina" più" corta," ma" semiXfunzionale" (Fig."7.3).""Circa"24%"delle"mutazioni"sono"evenF"de"novo.""

"""

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Fig."7.3"Delezione"di"un"grande" tra2o"di"DNA"che"porta"ad"una"proteina"più"piccola" ma" parzialmente" funzionante" che" causa" la" distrofia" muscolare" di"Becker.

Fig."7.2." "a:"DNA"codificante"la"proteina"funzionante." "b:"DNA"con"delezione"che"produce"una"proteina"troncata"all’estremità"CXterminale"e"non"funzionante

a

b

Manifestazioni*cliniche"Gli" individui" affeC" vanno" incontro" a" progressiva" degenerazione" della" muscolatura;"inizialmente" viene" interessata" la" muscolatura" scheletrica," successivamente" anche" la"muscolatura" cardiaca" e" respiratoria." Non" vengono" invece" interessaF" i" muscoli" oculari"estrinseci"(quelli"che"consentono"di"muovere"gli"occhi)"ed"è"poco"coinvolta"la"muscolatura"mimica" del" volto." L'esordio" avviene" nella" prima" infanzia" e" i" bambini" affeC" possono"presentare" ritardo" nelle" tappe" dello" sviluppo"motorio" o" ritardo" globale." I" bambini" affeC" da"DMD" non" sono" di" solito" capaci" di" correre" o"saltare."La"malaCa"ha"un'evoluzione"rapida"e"il"bambino" sviluppa" un'andatura" cara2erisFca" “a"papera”," e" un" cara2erisFco"modo" di" alzarsi" da"terra"“arrampicandosi"" su"se"stesso" (Fig."7.4)." I"bambini" con" DMD" hanno" difficoltà" a" salire" le"scale" e" cadono" frequentemente." La" perdita"della"deambulazione"autonoma"avviene"tra"i"6"e"i"13"anni;"dopo"la"perdita"della"deambulazione,"si" sviluppano" rapidamente" le" contra2ure"arFcolari" e" la" scoliosi." La" cardiomiopaFa" e"l'insufficienza" respiratoria" rappresentano" la"causa" di" morte" dei" pazienF" all'inizio" della" vita"adulta.""""" " " " " " " " " "Trasmissione"A"parte" "rare"eccezioni,"soltanto"i"maschi"ne"sono"affeC,"mentre"le"femmine"portatrici"sono"in"genere"asintomaFche."Solo"il"5%"presentano"sintomi"che"insorgono"fra"i"16"e"i"48"anni"e"possono" variare" da" una" modesta" generalizzata" debolezza" all’incapacità" di" movimento"(inaCvazione"sbilanciata"del"cromosoma"X)."Le"femmine"malate"sono"rare"e"manifestano"la"patologia"di"Becker."Vi"sono"anche"casi"nei"quali"le"madri"non"sono"portatrici"e"la"malaCa"è"dovuta"a"una"“nuova"mutazione”"avvenuta"nella"gametogenesi.""

Diagnosi"La" diagnosi" prenatale" (tra" la" IX" e" l'XI" seCmana)" è" possibile" nelle" famiglie" nelle" quali" la"diagnosi" sia" stata" confermata" con" le" analisi"molecolari." È"molto" importante" la" consulenza"geneFca:"il"rischio"di"ricorrenza"è"del"50%"nei"feF"maschi"di"una"madre"portatrice."Le"sorelle"dei" pazienF" possono" avere" una" probabilità" del" 50%" di" essere" portatrici." La" patologia" è"associata" anche" ad" un’elevata" concentrazione" di" creaFnaXfosfoXchinasi" (CPK)" nel" siero."L’enzima"muscolare"citoplasmaFco"esce"dal"muscolo"perchè"la"sua"membrana"è"degenerata."Il" dosaggio" elevato"della"CPK"nel" plasma"può" indicare" femmine"portatrici" della"malaCa" (il"valore"della"CPK"in"femmine"portatrici"è"100/200"volte"superiore"alla"media)."

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Fig.'7.4'Tipici'movimenti'di'un'paziente'affetto'da'DMD'per'sollevarsi'da'terra.

Terapia*e*prognosi"Per" la"gesFone"della"DMD"è"essenziale"un"approccio"mulFdisciplinare," in"genere"basato"su"fisioterapia" associata" a" tra2amento" farmacologico" con" corFcosteroidi" che" servono" a"mantenere" la" massa" e" la" forza" muscolare." È" necessario" un" regolare" monitoraggio" della"funzionalità" cardiaca." La" chirurgia" può" essere" uFle" per" la" correzione" della" scoliosi" e" la"venFlazione"no2urna"è"efficace"per"il"tra2amento"dell'insufficienza"respiratoria"restriCva.""La" DMD" ha" una" prognosi" sfavorevole" e" l'aspe2aFva" di" vita" è" significaFvamente" rido2a." Il"decesso"si"verifica"di"solito"all'inizio"della"vita"adulta."

Sebbene" per" entrambe" le" nuove" modalità" di" studio" le" ricadute" sui" pazienF" siano" ancora"lontane" e" ci" sia" necessità" di" a2enta" verifica" sulla" riproducibilità" e" sicurezza" dei" nuovi" usi"terapeuFci"offerF"da"queste"metodologie,"le"recenF"ricerche"aprono"nuovi"orizzonF"e"nuove"opportunità"per"la"terapia"della"DMD."

8.*Tecniche*u<lizzate*""

" 8.1**PCR*(Polymerase*Chain*Reac<on)

Si" tra2a" di" una" tecnica" innovaFva" che" consiste" nell’amplificazione" specifica" di" segmenF"di"

DNA"mediante"reazioni"a"catena"della"DNA"polimerasi"(fig.").Il" principio" è"molto" semplice." Data" una" sequenza" di" DNA" a" doppio" filamento" e" due" corte"sequenze"oligonucleoFdiche"(primer),"di"cui"una"complementare"ad"un"tra2o"di"filamento"a"una"estremità"del"DNA"da"amplificare"(forward"primer)"e"l’altra"complementare"ad"un"altro"tra2o" posto" all’altra" estremità" (reverse" primer)," in" presenza" di" una" DNA" polimerasi"termostabile" e" di" una" miscela" di" desossinucleoFdi" trifosfaF" in" appropriate" condizioni" di"reazione," è" possibile" copiare" numerosissime" volte" il" tra2o" compreso" tra" i" due" primers,"semplicemente"facendo"variare"ciclicamente"la"temperatura"di"reazione."InfaC,"raggiunta"la"temperatura"di"denaturazione"(circa"95°C),"la"doppia"elica"si"apre"(fase*di*denaturazione)," rendendo" disponibile" lo" stampo" per" una" eventuale" sintesi" delle" catene"complementari."Quando" la" temperatura" si" abbassa," in"virtù"delle" loro"minori"dimensioni"e"della"loro"concentrazione,"i"primer"si"legheranno"(fase*di*appaiamento"o"annealing)"al"DNA"stampo" prima" che" si" rinaturi" e," in" presenza" di" una" DNA" polimerasi" con" un" opFmum" di"temperatura"elevato"(circa"72°C),"inizierà"la"sintesi"di"DNA"a"parFre"dai"primer"(fase*di*sintesi&del*DNA"o"extension),"procedendo"lungo"i"filamenF"singoli.Al" termine" del" primo" ciclo" di" PCR" da" una" doppia" elica" di" DNA" se" ne" o2engono" due."Ripetendo"il"ciclo""denaturazione"–"annealing"–"extension""numerose"volte"(in"genere"da"20"a" 30)," si" oCene" una"massiccia" amplificazione" specifica" di" un" dato" tra2o" di" DNA" che" può"quindi"essere"analizzato"e"studiato" in"de2aglio." Il"metodo"di"analisi"del"DNA"mediante"PCR"presenta"vantaggi"molto"evidenF:"

• è"molto"rapido"(da"60"a"90"minuF),"

• la"manualità"è"semplicissima,"

• è"automaFzzato,"

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• i"risultaF"sono"visualizzabili"con"facilità"mediante"ele2roforesi"del"DNA""

" 8.1.1*Termociclatori

Il"successo"della"PCR"è"dovuto"in"gran"parte"alla"possibilità"di" far" avvenire" l’intero" processo" in" modo" automaFco"all’interno" di" strumenF" deC" termociclatori/ (thermal"cyclers)," in" grado" di" variare" ciclicamente" la" temperatura"

tra"le"varie"fasi"di"ogni"ciclo"di"PCR."Un" esempio" di" profilo" di" amplificazione" standard"impostato"mediante"un"termociclatore"(fig.")"è"il"seguente:"

1. denaturazione"del"DNA:"30"sec"a"94°C"

2. appaiamento" (annealing)" dei" primers:" 30" sec" a"50°X60°C"" ""

3. sintesi"(extension)"di"DNA:"30"secX"5"minuF"a"72°C"

Le" fasi" 1," 2" e" 3" possono" ripetersi" per" 30X35" cicli," dipende" dal" frammento" che" si" deve"amplificare."

""

" 8.1.2*Taq*polimerasi

Il" successo" della" PCR" è" stato" possibile" grazie" anche" all’uso" di" una" DNA" polimerasi"termostabile" estra2a" da" ba2eri" termofili" (che" vivono" ad" elevate" temperature)." Una" DNA"polimerasi" uFlizzata" nelle" reazioni" della" PCR" è" la" Taq" polimerasi," estra2a" dal" ba2erio"Thermus/ aqua6cus." L’isolamento" di" DNA" polimerasi" termostabili" ha" sollevato" gli" operatori"

dall’ingrato"compito"di"aggiungere"enzima"fresco"ad"ogni"ciclo"di"reazione!Quando" bisogna" amplificare" frammenF" di" DNA" molto" lunghi" (5kbX20kb)," è" necessario"uFlizzare"Taq"polimerasi"parFcolari."

""

" 8.1.3**Scelta*dei*primerPer"ogni"PCR,"è"necessario" "usare"due"primer/(forward"e"reverse)."La"scelta"della"coppia"di"primer/è"criFca"per"una"buona"riuscita"della"PCR,"ovvero"per"o2enere"l’amplificazione"di"un"tra2o" di" DNA" in"modo" specifico." I" primer" devono" essere" “disegnaF”" a" livello" di" sequenze"uniche" nel" genoma" (presenF" una" sola" volta)," in"modo" che" possano" appaiarsi" al" DNA" solo"nella"zona"di"interesse"e"non"in"altre"zone."

8.2.*EleGroforesi*su*gel*di*agarosioE’" una" tecnica" che" consente" di" separare" in" base" alle" loro" dimensioni" (peso" molecolare)"molecole"dotate"di"carica,"facendole"migrare"su"un"gel"in"presenza"di"un"campo"ele2rico."Il"gel"può"essere"immaginato"come"una"rete"tridimensionale"a2raverso"le"cui"maglie"migrano"le" molecole" so2o" l’azione" di" un" campo" ele2rico." Il" campo" ele2rico" è" generato" da" un"

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apparecchio,"de2o"alimentatore"e" la"migrazione"avviene"nel"gel" immerso" in"una"soluzione"

tampone,"all’interno"di"una"cella"ele2roforeFca"(fig.").

Per" separare"molecole" di" DNA" si" usano" gel" di" agarosio." Le"molecole" di" DNA" sono" cariche"negaFvamente"per" la"presenza"di" gruppi" fosfato"e"migrano"dal"polo"negaFvo"verso" il" polo"posiFvo."Per"un"certo" intervallo"di"pesi"molecolari," la"velocità"di"migrazione"è"funzione"del"loro"peso"molecolare:"tanto"più"grande"è" la"molecola"di"DNA,"tanto"minore"è" la"velocità"di"migrazione," tanto" più" piccola" è" la" molecola" di" DNA," tanto" più" velocemente" migra." Le"molecole" di" DNA" di" diversa" lunghezza" vengono" pertanto" separate" in" base" alla" diversa"

velocità"di"migrazione.Per" poter" determinare" la" lunghezza" delle" molecole" di" DNA" in" esame" separate" mediante"ele2roforesi,"viene"“caricato”"sul"gel"anche"il"cosidde2o"marcatore/di/peso/molecolare,"ossia"una"miscela"di"frammenF"di"DNA"di"cui"è"noto"il"peso"molecolare."Confrontando"la"posizione"dei"frammenF"a"peso"molecolare"noto"con"quella"dei"frammenF"di"DNA"in"esame,"è"possibile"

calcolarne"il"peso"molecolare,"ossia"la"lunghezza.Dato" che" il" peso"molecolare" di" un" frammento" di" DNA" è"proporzionale" al" numero" di" coppie" di" " nucleoFdi" (basi)"che"lo"cosFtuiscono,"di"solito"esso"viene"espresso"in"paia"

di"basi"(bp).Al"termine"della"corsa"ele2roforeFca,"i"vari"frammenF"di"DNA," essendo" incolori," possono" essere" visualizzaF,"immergendo"il"gel"in"un"colorante."Per"poter"visualizzare"il" DNA," durante" la" preparazione" del" gel," all’agarosio" si"aggiunge" Eurosafe," una" sostanza" che" ha" la" proprietà" di"legarsi" al" DNA" e" di" eme2ere" fluorescenza" se" esposta" a"luce" UV." Alla" fine" della" corsa," le" bande" si" visualizzano"esponendo"il"gel"alla"luce"ultraviole2a"(fig.")."*"

9.*Norme*generali*di*sicurezza*in*laboratorio"Qui" di" seguito" sono" elencate" alcune" norme" elementari" di" sicurezza," che" devono" essere"tassaFvamente"rispe2ate."

○ Entrando"in"laboratorio,"individuare"le"vie"di"fuga,"indicate"dalla"segnaleFca"verde."○ In" laboratorio" indossare"sempre" il"camice." Il"camice"deve"essere"chiuso"sul"davanF,"con"maniche" lunghe"e"polsini" ad" elasFco."Al" termine"delle" aCvità," prima"di" lasciare" il"

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laboratorio," togliersi" il" camice." In" ogni" caso," non" uscire" dal" laboratorio," per" recarsi" in"altre"aree"(biblioteca,"uffici,"bar,"ecc.),"senza"aver"prima"tolto"il"camice."○ Non"introdurre"in"laboratorio"borse,"zaini"o"altro"materiale"non"necessario."○ Gli" studenF" che" presentano" dermaFF" o" altre" lesioni" sulle"mani," devono" indossare"guanF"proteCvi"in"tu2e"le"fasi"di"lavoro."○ I"guanF"vanno"tolF,"quando"si"usino"strumenF"di"qualsiasi"natura"(telefono,"tasFera,"strumenF"scienFfici,"maniglie,"ecc.)."I"guanF"usaF"non"vanno"riuFlizzaF."○ In" laboratorio" è" vietato" mangiare," bere," fumare," portare" oggeC" alla" bocca" ed"applicare"cosmeFci."○ Pulire" sempre," al" termine" del" loro" uFlizzo," le" apparecchiature" scienFfiche" e," al"termine"della"aCvità,"i"piani"di"lavoro."○ Seguire" scrupolosamente" le" indicazioni" di" sicurezza" riportate" nei" protocolli" di"esperimento."○ Segnalare"immediatamente"al"personale"docente"qualsiasi"incidente"o"la"mancanza"di"materiale"di"protezione"

U<lizzazione*del*forno*a*microonde"

● non"accendere"il"forno"se"è"vuoto"● non"uFlizzare"il"forno"con"materiali"infiammabili"● non" uFlizzare" il" forno" con" recipienF" sigillaF" (potrebbero" esplodere):" svitare" i" tappi"

delle"boCglie,"rimuovere"i"coperchi"● non" uFlizzare" il" forno" con" oggeC"metallici" o" metallizzaF:" (es." boCglie" coperte" di"

stagnola)"e"con"carta"d’argento"● non"riempire"eccessivamente"i"recipienF:"il"liquido"bollendo,"potrebbe"traboccare"● proporzionare"la"potenza"e"il"tempo"di"riscaldamento"al"contenuto"in"acqua"di"quanto"

viene" riscaldato." In" parFcolare," nel" caso" di" soluzioni" acquose," il" liquido" potrebbe"surriscaldarsi" oltre" il" punto" di" ebollizione," senza" che" appaiano" bollicine." Ciò" può"portare" al" traboccamento" improvviso" di" liquido" bollente." Per" prevenire" questo"pericolo," mescolare" il" liquido" prima" di" scaldarlo" e" lasciarlo" riposare" per" qualche"minuto"prima"di"togliere"il"recipiente"dal"forno"

● uFlizzare"i"guanF"imboCF"per"togliere"i"recipienF"dal"forno"● dopo"l’uso"pulire"il"forno"con"carta"spruzzata"con"detersivo"per"vetri"● in"caso"di"incendio"del"contenuto"del"forno,"tenere"chiusa"la"porta,"spegnere"il"forno,"

staccare" la" spina" dalla" presa" di" corrente" lasciando" che" il" fuoco" si" esFngua" per"soffocamento"

U<lizzazione*della*centrifuga"● chiudere"accuratamente"il"tappo"delle"prove2e,"per"evitare"la"fuoriuscita"di"liquido"e"

la"formazione"di"aerosol"● assicurarsi"che"il"rotore"sia"bilanciato:"prove2e"di"ugual"peso"devono"essere"inserite"

negli"alloggiamenF"diametralmente"opposF"● chiudere"il"coperchio"della"centrifuga"prima"di"avviarla"

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● non"cercare"di"aprire"il"coperchio"prima"del"completo"arresto"del"rotore"● in"caso"di"fuoriuscita"di"liquido"dalle"prove2e,"avverFre"il"personale"docente"

U<lizzazione*dell’apparecchiatura*per*eleGroforesi"● assicurarsi"che"l’alimentatore"sia"spento,"prima"di"collegare"i"morseC"● assicurarsi" che" il" coperchio" della" vasche2a" sia" corre2amente" posizionato," prima" di"

collegare"i"morseC"● alla" fine" della" corsa," prima" di" rimuovere" il" coperchio" della" cella" ele2roforeFca,"

spegnere"l’alimentatore"e"staccare"i"morseC"

Smal<mento*dei*rifiu<"● tu2o" il" materiale" disposable" (puntali," prove2e," pipe2e" ecc.)" va" messo" in" apposiF"

contenitori"per"rifiuF"● cercare" di" ridurre" al"minimo" il"materiale" da" eliminare," visto" i" cosF" elevaF" del" loro"

smalFmento."" " "

10.*Protocollo*di*laboratorio*

Soluzioni*e*reagen<*usa<*nell’a?vità*di*laboratorio*

•" tampone" TBE" (TrisXBoratoXEDTA," composizione" Tris" 108" gr" (0,89"M)," acido" borico" 55" gr"(0,89" M)," EDTA" 9.3" gr" (0,02" M)" pH" 8,3," H2O" fino" a" 1" litro." Il" pH" 8,3" viene" raggiunto"automaFcamente.)."Questo"tampone"si"prepara"facendo"una"diluizione"1:10"della"soluzione"“madre”"TBE"10x."

•"DNA"prodoC"con"la"PCR,"già"pronF"• marcatore"di"peso"molecolare"• agarosio"in"polvere"(0.6"gr)"•"soluzione"EuroSafe""(1"""µg/ml)""•"loading"dye"6x,"già"pronto"in"eppendorf"e"contenente:"•"H2O"disFllata"

Nota"di"laboratorio:"la"concentrazione"di"agarosio"del"gel"viene"scelta"dal"ricercatore"in"base"alle" dimensioni" dei" frammenF" di" DNA" da" separare." Nel" nostro" caso," dovendo" separare"frammenF"lineari"di"DNA"compresi"tra"100"e"2.000"bp"(base"pairs,"coppie"di"basi),"si"uFlizza"un"gel"di"agarosio"al"2%."

Operazioni"preliminari"• per"chi"ha"i"capelli"lunghi:"legarsi"i"capelli"con"un"elasFco"• prima"di"cominciare"a"lavorare,"lavarsi"le"mani"• pulire"il"banco"di"lavoro"con"alcol"eFlico"denaturato"• prima"di"cominciare"l’esperimento,"lo"studente"verrà"familiarizzato"con"la"strumentazione"

che"dovrà"uFlizzare,"in"modo"parFcolare"con"le"micropipe2e"

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Preparazione*del*gel*di*agarosio*

Preparare" la"vasche2a"per"ele2roforesi"con"bordi"di"“nastro"adesivo"di"carta”"verificare"che"il"piano"su"cui"si"appoggia"la"vasche2a"per"ele2roforesi"sia"a"bolla""misurare"30"ml"di"tampone"TBE"1x"in"un"cilindro"e"versarli"nella"beuta"di"vetro"pirex"che"conFene"già"0,6"gr"di"agarosio."A2enzione"a"non"rovesciare"la"beuta.""pesare" la" beuta" contenente" la" soluzione" di" agarosio" e" segnare" il" peso" sul" protocollo:"_______"leggere"a2entemente"la"“Nota"di"sicurezza"sulla"uFlizzazione"del"forno"a"microonde”"sciogliere"l’agarosio"nel"forno"a"microonde"impostato"sulla"potenza"indicata"da"una"figura"con" tre" fiammelle" (circa" 500V)" per" 1"minuto." Aprire" poi" il" forno" a"microonde," agitare"delicatamente" la" soluzione" con" una" presina," facendo" a2enzione" a" non" sco2arsi."Richiudere" il" forno" a"microonde" e" sciogliere" la" soluzione" per" un" ulteriore"minuto" alla"stessa"potenza"pesare"la"soluzione"di"agarosio"(l’acqua"del"tampone,"bollendo,"è"evaporata!)"e"riportare"la" soluzione"di" agarosio"al"peso"originale,"uFlizzando"una" spruzze2a"con"H2O"disFllata."A2enzione:" far" cadere" l’acqua" delicatamente," facendola" scivolare" lungo" i" bordi" della"beuta,"altrimenF"si"formano"delle"bolle"aggiungere" 1µl" di" Eurosafe" e" aspe2are" 3X5" minuF." L’agarosio" deve" raggiungere" una"temperatura" intorno" ai" 60°C," altrimenF" rovina" il" supporto" di" plasFca" della" vasche2a"dell’ele2roforesi."Quindi"versare"la"soluzione"di"agarosio,"evitando"di"formare"bolle,"nella"vasche2a"per"ele2roforesi" dove"è" già" stato" inserito" il" peCne,"nella"quale" va" inserito" il"peCne."I"pozzeC"si"formano"quando,"una"volta"solidificato"il"gel,"viene"tolto"il"peCne""lasciare"solidificare"a"temperatura"ambiente"per"circa"15"min."Quando"è"solidificato,"il"gel""diventa"opaco""mentre"si"aspe2a"che"il"gel"solidifica,"fare"delle"prove"di"caricamento"dei"pozzeC"del"gel"su"altri"gel"già"pronF""togliere"il"nastro"di"carta"dalla"vasche2a"e"me2erla"nella"cella""versare"il"tampone"TBE"1x"nella"camera"di"corsa"(servono"circa"250"ml),"evitando"che"si"formino"bolle,"fino"a"coprire"completamente" il"gel."Se"si" formano"bolle," toglierle"con" la"punta"di"una"pipe2a"Pasteur""togliere"lentamente"il"peCne,"tenendosi"perpendicolare"rispe2o"al"gel"

Corsa*eleGrofore<ca*

aggiungere"2"µl"di"loading"dye"6x"e"risospendere"con"la"micropipe2a,"evitando"di"formare"bolle." Il" glicerolo"presente"nel" loading"dye" serve"per" rendere"più"densa" la" soluzione"di"DNA"da"caricare"nel"pozze2o"e"quindi"a"facilitarne"l’entrata"nel"pozze2o"se"si" formano"bolle,"centrifugare"brevemente"(1"sec)" in"una"microcentrifuga"eppendorf"(in"gergo"di"laboratorio,"si"dice"“spinnare”"da"spin,"centrifugare)"leggere"a2entemente"la"“Nota"di"sicurezza"sulla"uFlizzazione"della"centrifuga”"posizionare" la" vasche2a" per" l’ele2roforesi" su" un" foglio" nero," perchè" sia" più" facile"individuare"i"pozzeC"

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caricare" lentamente" ciascun" campione" (10"µl)" nei" singoli" pozzeC" (ogni" pozze2o"ha"un"volume" di" circa" 15" µl)," ponendosi" con" la" punta" della" micropipe2a" in" un" angolo" del"pozze2o"e"perpendicolare"rispe2o"al"gel," facendo"a2enzione"a"non"bucare" il" fondo"del"pozze2o"stesso"e"a"non"far"uscire"il"campione"fuori"dal"pozze2o"in"un"pozze2o"laterale,"caricare"il"marker"di"DNA"a"peso"molecolare"noto"chiudere"il"coperchio"della"cella"ele2roforeFca"leggere" a2entemente" la" “Nota" di" sicurezza" sulla" uFlizzazione" dell’apparato" per"ele2roforesi”"collegare"i"morseC"alla"camera"di"corsa"e"ai"poli"del"generatore"di"corrente,"de2o"anche"power"supply;"il"DNA"è"carico"negaFvamente"e"migra"verso"il"polo"posiFvo"fissare"il"voltaggio"al"valore"costante"di"100"V"e"lasciare"procedere"la"corsa"ele2roforeFca"per"circa"20"min"fare"a2enzione"che"la"banda"del"blu"di"bromofenolo"non"esca"dal"gel"(altrimenF"alcune"bande"di"DNA""possono"uscire"dal"gel)"osservare"la"migrazione"del"loading"dye"per"valutare"la"migrazione"del"DNA,"che,"essendo"incolore," non" si" può" vedere." Il" blu" di" bromofenolo" migra" alla" stessa" velocità" di" un"frammento" di" DNA" a" doppia" elica" di" circa" 300" bp," mentre" lo" xilen" cianolo" migra" alla"stessa" velocità" di" un" frammento" di" circa" 4.000" bp." A2enzione:" fermare" la" corsa"ele2roforeFca"quando"il"blu"di"bromofenolo"si"trova"a"circa"1X2"cm"dalla"fine"del"gel," in"modo" da" evitare" che" il" DNA" esca" dal" gel" stesso." Se" dovesse" succedere," si" perdono" i"campioni"di"DNA!"

Operazioni*da*svolgere*alla*fine*della**corsa*eleGrofore<ca*

al"termine"della"corsa,"indossare"i"guanF"monouso"“disposable”,"togliere"delicatamente"il"gel"dalla"cella"ele2roforeFca""osservare"il"gel"al"transilluminatore"documentare" il" risultato" del" gel," facendo" una" foto" al" gel" (ricordarsi" di" portare" una"macchina""fotografica"digitale!)"pulire"le"apparecchiature"ed"il"banco"di"lavoro"con"acqua"ed"etanolo"denaturato"dopo"aver"finito"di"lavorare,"lavarsi"le"mani"

11.*Quiz*di*autovalutazione"1. "Le"malaCe"da"mutazioni"dinamiche"non"sono"cara2erizzate"da:""

a) espansione"di"triple2e"b) anFcipazione"geneFca"c) instabilità"meioFca"d) irraggiamento"con"raggi"UV"

2. Tu2e"le"seguenF"patologie"sono"dovute"ad"espansione"di"triple2a,"tranne:"a)"atassie"spinoXcerebellari"b)"corea"di"HunFngton"c)"distrofia"miotonica"d)"distrofia"di"Duchenne"

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e)"sindrome"dell’XXfragile"

3."La"malaCa"di"HunFngton"è"legata"a"un"errore"geneFco"che"coinvolge"il"gene"che"""""codifica"per"l’hunFngFna."Su"quale/i"cromosoma/i""si"trova"questo"gene?"

a)"4"b)"21"c)"su"diversi"cromosomi"d)"sul"cromosoma"X"e)"14"""

4."Quale"mutazione"causa"la"Corea"di"HunFngton?"a)" mutazione"cromosomica"b)" mutazione"genica"autosomica"dominante"c)" mutazione"genica"autosomica"recessiva"d)" mutazione"genica"legata"al"cromosoma"X"e)" mutazione"genomica"

""5."La"Corea"di"HunFngton"è"una"malaCa"da"espansione"di"triple2e;"da"17"a"26"ripeFzioni"

l’allele"è"normale,"da"27"a"35"ripeFzioni"si"ha"la"condizione"di"premutazione"e"con">35"ripeFzioni"la"malaCa."Qual"è"la"triple2a"che"si"ripete?"

a)"CAG"X"glutammina"b)"AUG"X"glutammina"c)"UGA"X"lisina"d)"UGG"X"alanina"e)"CAG"X"lisina"""

6."In"quale"delle"seguenF"funzioni"NON"è"coinvolta"l’hunFngFna?"a)" inibizione"dell’apoptosi"durante"lo"sviluppo"embrionale"b)" regolazione"e"controllo"del"fa2ore"neurotrofico"cerebrale"c)" alterazione"dei"livelli"di"glucosio"a"livello"neuronale"d)" aCvazione"della"trasmissione"sinapFca"e)" intasamento"del"proteosoma"""

7."Un"individuo"con"atassia"di"Friederich"presenta"una"ripeFzione"della"triple2a"GAA"nel"primo"introne"di"FDA:"

a)"superiore"alle"67"volte"in"un"solo"cromosoma"9"b)"superiore"alle"67"volte"in"entrambi"i"cromosomi"9"c)"inferiore"a"12"volte"in"entrambi"i"cromosomi"9"d)"inferiore"a"12"volte"in"un"solo"cromosoma"9"

8."Lo"stress"ossidaFvo"che"provoca"l'atassia"di"Friederich"è"dovuto:"a) "alla"rido2a"produzione"di"una"proteina"mitocondriale"trasportatrice"di"Fe"b)"alla"produzione"di"radicali"liberi"nelle"cellule"nervose"

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c)"ad"un"eccesso"di"produzione"di"frataxina"d)"una"produzione"endogena"di"ozono"

9."Nell'atassia"di"Friederich"il"n°"delle"ripeFzioni"delle"triple2e:"a) è"inversamente"correlata"all'età"della"malaCa"b) è"casuale"ed"indipendente"dai"sintomi"dei"disturbi"cardiaci"c)""è"inversamente"proporzionale"alla"produzione"di"frataxina"d)"influisce"posiFvamente"sull'aumento"della"trascrizione"in"mRNA"

10."Per"ridurre"i"sintomi"della"atassia"di"Friederich"causata"dallo"stress"ossidaFvo"dei"mitocondri:"

a) vengono"uFlizzaFfarmaci"che"rilasciano"ferro"a"livello"emaFco"b) si"somministrano"farmaci"che"sequestrano"l'eccesso"di"ferro"c) non"si"può"ricorrere"ad"un"tra2amento"riabilitaFvo"d) esistono"specifici"farmaci"dietro"un"terapia"farmacologica"efficace"

11."Quale"patologia" rappresenta" la" seconda" causa"di" ritardo"metale"nei"maschi" dopo" la"sindrome"di"Down?"

a) distrofia"miotonica"b) corea"di"HunFngton"c) sindrome"dell’XXfragile"d) sindrome"di"Edwards"e)"nessuna"delle"precedenF"

12."L’XXfragile"ha"una"trasmissione:"a)"legata"al"cromosoma"X"recessiva"b)"autosomica"recessiva"c)"legata"al"cromosoma"X"dominante"d)"legata"al"cromosoma"Y"e)"autosomica"dominante"

13."L’espansione"CGG"coinvolta"nella"sindrome"dell’XXfragile"è"localizzata:"a)"nel"3’UTR"del"gene"FMR1"b)"nel"promotore"del"gene"FMR1"c)"nel"5’UTR"del"gene"FMR1"d)"nel"primo"esone"del"gene"FMR1"e)"nell’ulFmo"introne"del"gene"FMR1"

14."Nell’XXfragile" la" triple2a"CGG" tende"preferenzialmente"ad"espandersi"quando" l’allele"premutato"viene"trasmesso:""

a)"dal"padre"b)"dalla"madre"c)"non"vi"è"differenza"

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15."Quale"anomalia"stru2urale"non"è"responsabile"della"Distrofia"Muscolare"di"Duchenne?"a)"delezione"b)"traslocazione"c)"inserzione"d)"mutazioni"non"senso"

16."La"mutazione"del"gene"della"distrofina"provoca"la"mancanza"di:"a)"un"enzima"b)"un"cromosoma"X"c)"una"proteina"d)"un"polisaccaride"

17." Nella" prima" infanzia," la" sintomatologia" della" Distrofia" Muscolare" di" Duchenne" è"""cara2erizzata"da:"

a)"astenia"dei"muscoli"motori"e"cardiopaFe"b)"alterazione"della"conduzione"dell'impulso"nervoso"c)"eccessiva"produzione"di"mucosa"gastrica"d)"rido2o"sviluppo"scheletrico"

18.""L’XXfragile"ha"una"trasmissione:"a)"autosomica"dominante"b)"autosomica"recessiva"c)"legata"al"cromosoma"Y"d)"legata"al"cromosoma"X"dominante"e)"legata"al"cromosoma"X"recessiva""

12.*Glossario*

An<cipazione* gene<ca:" nel" passaggio" da" una" generazione" alla" successiva," si" osserva" un"esordio"piu’"precoce"della"malaCa,"accompagnato"spesso"da"aggravamento"dei"sintomi"negli"individui"affeC.""

Apoptosi:" forma" di"morte" cellulare" programmata." Dal" termine" greco" che" indica" la" caduta"delle"foglie"e"dei"petali"dei"fiori."

Còrea:" Fpici" movimenF" involontari," improvvisi," irregolari," sca2anF," presenF" a" riposo" e"nell'esecuzione"di"aC"volontari."Dal"greco"χορεία"àchoreia"laFno"="coro,"danza"corale."

Delezione*frameshif:"delezione"o"inserzione"di"un"nucleoFde"nella"regione"codificante"di"un"gene."

Dimorfismo:"presenza"di"forme"e"aspeC"differenF"in"due"individui"della"stessa"specie."

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FaGore*neurotrofico*cerebrale:/BDNF/(Brain7derived/Neurotrophic/Factor):"neurotrofina"che"agisce"su"determinaF"neuroni"del"sistema"nervoso"centrale"e"del"sistema"nervoso"periferico,"contribuendo"a"sostenere"la"sopravvivenza"dei"neuroni"già"esistenF,"e"favorendo"la"crescita"e"la"differenziazione"di"nuovi"neuroni"e"sinapsi."

Fibrille*amiloidi:"materiale"proteico"a"rido2o"peso"molecolare"ed"insolubile,"de2o"amiloide,"per" la" proprietà" simile" a" quella" dell'amido" di" reagire" con" lo" iodio." " Le" fibrille" hanno"composizione" chimica"molto" varia" in" quanto" il" pepFde" amiloidogenico" che" rappresenta" la"parte"più"esterna"di"esse"(pari"al"95%)"deriva"dalla"deposizione"di"una"proteina"precursore"differente"a"seconda"della"patologia"in"quesFone."

Macroorchidismo:"grossi"tesFcoli""""

Mutazione*completa:"si"basa"sulla"lunghezza"della"regione"che"viene"espansa"nelle"malaCe"da"espansione"di"triple2e.""Solitamente"si"possono"disFnguere"qua2ro"Fpi"di"alleli:"normale,"intermedio,"premutazione"e"mutazione"completa."

Mutazioni*dinamiche:" " coinvolge" sequenze"del"DNA"composte"da" tre"nucleoFdi" (triple2a)"che"si"susseguono" in"tandem."La"mutazione"consiste"nell’aumento"abnorme"nel"numero"di"triple2e" ripetute," associato" a" malaCe" geneFche." Quando" è" molto" elevato," il" numero" di"ripeFzioni"diviene" instabile:"può"variare"nei"componenF"della"stessa"famiglia"e"anche"nelle"cellule"dello"stesso"individuo.""

Premutazione:" numero" di" ripeFzioni" di" triple2e" molto" vicino" al" limite" necessario" per" la"manifestazione" della" malaCa." Col" fenomeno" della" anFcipazione" geneFca," il" numero" di"triple2e"può"aumentare"fino"a"raggiungere"la"mutazione"completa."

Principio*di*Lyon:*disaCvazione"o" inaCvazione"di"uno"dei"due"cromosomi"X"presenF"nelle"cellule"femminili."

Proteasoma:" complesso"mulFproteico" con" " il" compito" di" degradare" polipepFdi" all'interno"della" cellula." Sebbene" la" sua" funzione" sia" simile" a" quella" del" lisosoma," in" " parFcolare," il"proteosoma" è" un" complesso" proteico" a2o" a" degradare" i" pepFdi," il" lisosoma" è" un"comparFmento" cellulare" dotato" di" membrana" cellulare" deputato" alla" degradazione" di"proteine.*

Proteine*chaperone:"proteine"che"agevolano"il"ripiegamento"(folding)"corre2o"della"catena"nascente"di"aminoacidi."Questo"previene"associazioni"non"corre2e"e"l’aggregazione"di"catene"polipepFdiche"non"ripiegate."

Sarcolemma:"complesso"di"membrane"(membrana"plasmaFca"e"lamina"basale)"che"avvolge"le"fibre"muscolari."

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SNPs:" un" polimorfismo," cioè" una" variazione," del" materiale" genico" a" carico" di" un" unico"nucleoFde," tale" per" cui" l'allele" polimorfico" risulta" presente" nella" popolazione" in" una"proporzione"superiore"all'1%."Al"di"so2o"di"tale"soglia"si"è"soliF"parlare"di"variante"rara."

Trasmissione* materna* della* premutazione:" la" tendenza" all’espansione" della" triple2a" si"verifica" solo" quando" la" premutazione" è" trasmessa" dalla" madre." Durante" la" maturazione"dell’ovulo" materno" o" nelle" prime" fasi" della" crescita" embrionale," la" premutazione" può"espandersi"a"mutazione"completa.""

Trasmissione* paterna* della* premutazione:" la" tendenza" all’espansione" della" triple2a" si"verifica"solo"quando"la"premutazione"è"trasmessa"dal"padre."

TRED:/TrinucleoFde"Repeat"Expansion"Disorders,"ossia"malaCe"da"espansione"di"triple2e."

13.*Bibliografia*e*Si<*web*"AlXMahdawi"S,"Pinto"RM,"Varshney"D,"Lawrence"L,"Lowrie"MB,"Hughes"S,"Webster"Z,"Blake"J,"Cooper" JM,"King"R,"Pook"MA."GAA/repeat/expansion/muta6on/mouse/models/of/Friedreich/ataxia/ exhibit/ oxida6ve/ stress/ leading/ to/ progressive/ neuronal/ and/ cardiac/ pathology./Genomics."2006;88(5):580X90." Alper"G"and"Narayanan"V."Friedreich's/ataxia.Pediatr/Neurol./2003;28(5):335X41."Review. Campuzano"V,"Montermini"L,"Moltò"MD,"Pianese"L,"Cossée"M,"CavalcanF"F,"Monros"E,"Rodius"F,"Duclos"F,"MonFcelli"A,"Zara"F,"Cañizares"J,"Koutnikova"H,"Bidichandani"SI,"Gellera"C,"Brice"A,"Trouillas" P," De"Michele" G," Filla" A," De" Frutos" R," Palau" F," Patel" PI," Di" Donato" S,"Mandel" JL,"Cocozza"S,"Koenig"M,"Pandolfo"M."Friedreich's/ataxia:/autosomal/recessive/disease/caused/by/an/intronic/GAA/triplet/repeat/expansion."Science."1996;271(5254):1423X7. Delatycki" MB," Williamson" R," Forrest" SM." Friedreich/ ataxia:/ an/ overview./ J" Med" Genet."2000;37(1):1X8."Review. Saldarriaga"W,"Tassone"F,"GonzálezXTeshima"LY,"ForeroXForero"JV,"AyalaXZapata"S,"Hagerman"R."Fragile/X/syndrome."Colomb"Med.2014;30;45(4):190X8."Review. Schlö2erer" C," Tautz" D." Slippage/ synthesis/ of/ simple/ sequence/ DNA./ Nucleic" Acids" Res."1992;20(2):211X5."

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Supervisione"di:"Prof."P.Plevani,"prof.ssa"G."Viale,"prof.ssa"C."Grazioli"e"prof.ssa"L."Pirovano"A"cura"di:""

● prof.ssa"Bertocchi,"Liceo"ScienFfico"Lussana,"Bergamo"● prof.ssa"Bonanno,""Liceo"ScienFfico"Lussana,"Bergamo"● prof.ssa"Capelli,"Liceo"scienFfico"Donatelli"Pascal,"Milano"● Jacopo"Colombini,"studente"liceo"scienFfico"Leonardo"da"Vinci,"Milano"● prof.ssa"Erba,"ITIS""Einstein"indirizzo"biotecnologie"sanitarie,"Vimercate"● prof."Esposito,"ITIS"Einstein"indirizzo"biotecnologie"sanitarie,"Vimercate"● prof.ssa"MosciaC,"Liceo"linguisFco"Primo"Levi,"San"Donato"● prof.ssa"Rizzo,"IIS"Liceo"scienze"applicate,"Falcone"Righi"Corsico"● prof.ssa"Spiller,"Liceo"scienFfico"Leonardo"da"Vinci"Milano"● do2.ssa"Marisa"Oppizzi,"CusMiBio"● do2.ssa"Michela"Stroppi,"CusMiBio

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