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Lo sviluppo di nuovi farmaci costituisce una delle più importanti interfacce tra labiochimica e la medicina. Nella maggioranza dei casi i farmaci agiscono legando-si a specifici recettori o enzimi, inibendone oppure modulandone l’attività biolo-gica. Pertanto la conoscenza dei recettori, degli enzimi e delle vie metaboliche dicui fanno parte è essenziale per lo sviluppo di nuovi farmaci. Ma un farmaco effi-cace è molto di più che un potente modulatore della sua molecola bersaglio. I far-maci devono essere somministrati al paziente in modo semplice, possibilmente pervia orale, sotto forma di piccole compresse, e devono sopravvivere sufficientementea lungo nel corpo umano, in modo da poter raggiungere intatti i loro bersagli. Inol-tre, affinché non provochino effetti indesiderati, non devono modulare le proprietàdi biomolecole diverse da quelle bersaglio. Queste imprescindibili caratteristichelimitano fortemente il numero dei composti che potrebbero potenzialmente esse-re di uso clinico.

I farmaci sono stati fin qui scoperti attraverso due opposti approcci sperimen-tali (figura B1). Il primo approccio identifica la sostanza che determina l’effetto fi-siologico desiderato quando somministrata all’uomo, a un animale o a cellule iso-late. Queste sostanze possono essere scoperte per osservazione casuale (serendipità),attraverso il frazionamento di estratti di piante o di altro materiale biologico, dicui sono già note le proprietà terapeutiche, oppure attraverso lo screening di pro-dotti naturali o di collezioni («librerie») di composti. Tale approccio comporta chel’effetto biologico sia noto prima che il bersaglio molecolare sia stato identificato.

Capitolo supplementare B

Molti farmaci sono derivati di prodotti naturali.L’acido acetilsalicilico (formula in alto) è uncomposto chimico derivato da un componen-te isolato dalla corteccia del salice (parte de-stra della figura a lato). Le proprietà terapeuti-che della corteccia del salice erano note dalungo tempo. Il principio attivo è stato isolato,modificato chimicamente e, a partire dal1899, è stato messo in commercio (partesinistra della figura). [Fonti: (foto a sinistra) pergentile concessione della Bayer Corporation;(foto a destra) Image Ideas/Picture Quest.]

Sommario

B1 Lo sviluppo di nuovi farmacicomporta la risoluzione diproblemi assai complessi

B2 Si possono scoprire potenzialifarmaci per serendipità(osservazione fortuita), screening oprogettazione

B3 L’analisi del genoma prometteimportanti sviluppi verso lascoperta di nuovi farmaci

B4 Lo sviluppo di nuovi farmaciprocede attraverso diversi stadi

Lo sviluppo di nuovi farmaci

COOH

O

O

CH3

22 B. Lo sviluppo di nuovi farmaci © 88-08-07893-0

Una successiva sperimentazione servirà a chiari-re il meccanismo d’azione del composto. Il se-condo approccio trae inizio da un bersaglio mo-lecolare noto. I composti vengono scelti o me-diante uno screening, oppure attraverso la pro-gettazione di molecole che possiedano le proprietàdesiderate, cioè in grado di legarsi alla molecolabersaglio e modularne le proprietà. Una volta di-sponibili, se ne potranno studiare gli effetti sucolture cellulari appropriate o su organismi. Manmano che la complessità dei sistemi biologici au-menta, è prevedibile che ci si possa imbattere inrisultati inaspettati.

In questo capitolo ci occuperemo di argomentifarmacologici. Esamineremo un certo numero diesempi tipici, che aiutano a capire come si giun-ge alla scoperta dei farmaci, ivi inclusi aspetti con-cettuali e metodologici e i possibili sviluppi fu-turi. Vedremo anche come i concetti e le meto-diche propri della genomica stiano influenzandogli approcci sperimentali che conducono alla sco-perta dei farmaci. Concluderemo il capitolo rias-sumendo i diversi stadi attraverso i quali si giun-ge alla realizzazione di un farmaco.

B1 LO SVILUPPO DI NUOVI FARMACICOMPORTA LA RISOLUZIONE DIPROBLEMI ASSAI COMPLESSI

Molti composti producono effetti significativinell’uomo, ma solo pochi sono destinati a di-

ventare farmaci di largo uso. Ogni compostoestraneo, come spesso è un farmaco, che duran-te un lungo periodo evolutivo non ha trovato unsuo ruolo nella cellula, dovrà possedere tutta unaserie di proprietà peculiari, per poter svolgere lasua azione senza provocare alcun danno. Vedre-mo quali sono le difficoltà che si trovano ad af-frontare i ricercatori che si occupano della pro-duzione di nuovi farmaci.

I potenziali farmaci devono essere potentimodulatori dei loro bersagli molecolari

La maggior parte dei farmaci si lega a specificheproteine, in genere recettori o enzimi. Per risul-tare efficace, un farmaco deve legarsi a un nu-mero sufficiente delle sue proteine bersaglio, seassunto in una dose ragionevole. Un importantefattore, che determina l’efficacia del farmaco, èla forza di legame, spesso governata da principicinetici correlati al modello di Michaelis-Men-ten, introdotto nel capitolo 8.

Una molecola che riconosce e si lega a unamolecola bersaglio viene spesso denominata li-gando. Una tipica curva di legame è riportata nel-la figura B2. Le molecole di ligando occupanovia via sempre più siti di legame, man mano chela concentrazione del ligando aumenta, fino a chetutti i siti disponibili sono occupati. La tenden-za di un ligando a legarsi al suo bersaglio mole-colare si misura per mezzo della costante di disso-ciazione, Kd, definita dall’espressione

Kd = [R][L]/[RL]

dove [R] è la concentrazione del recettore, [L] èla concentrazione del ligando, e [RL] è la con-centrazione del complesso recettore-ligando. Lacostante di dissociazione è una misura della for-za di interazione tra il potenziale farmaco e il ber-saglio molecolare; più basso è il suo valore, piùforte è l’interazione. La concentrazione del li-gando libero alla quale la metà dei siti di legamesono occupati è uguale alla costante di dissocia-zione, se la concentrazione dei siti di legame è so-stanzialmente inferiore alla costante di dissocia-zione.

In condizioni fisiologiche intervengono di-versi fattori che complicano la sperimentazione.Molti dei bersagli molecolari a cui i farmaci si le-gano, riconoscono anche altri ligandi normal-mente presenti nei tessuti: ne consegue che taliligandi e i potenziali farmaci competono per glistessi siti di legame presenti sul bersaglio mole-colare. Abbiamo già incontrato una situazione si-mile, quando abbiamo preso in considerazionel’inibizione enzimatica del tipo competitivo nel

Composto Effettofisiologico

Bersagliomolecolare

Composto Effettofisiologico

Bersagliomolecolare

(A)

(B)

Figura B1 I due approc-ci sperimentali per lascoperta dei farmaci(A) È già noto che un de-terminato composto produ-ce l’effetto terapeutico desi-derato. Il bersaglio moleco-lare viene scoperto solosuccessivamente, attraversouna sperimentazione ap-propriata. (B) Viene primaselezionato il bersagliomolecolare. I possibili far-maci che si legano al ber-saglio vengono identificatisuccessivamente e quindivengono esaminati gli effet-ti fisiologici.

farmacologiaLa scienza che si occu-pa della scoperta, dellachimica, della composi-zione, dell’identificazio-ne, degli effetti biologicie fisiologici, e dell’utiliz-zo e della fabbricazionedei farmaci.

[Ligando]

[Ligando] = Kd

0

Satu

razi

one

fraz

iona

ria,

[RL]

/([R

L] +

[R])

1,0

0,5

Figura B2 Curva di lega-meLa titolazione di un recetto-re, R, con un ligando, L,risulta nella formazione delcomplesso RL. Nei casisemplici la reazione descri-ve una semplice curva disaturazione. La metà deirecettori sono legati al ligan-do quando la concentrazio-ne del ligando è uguale allacostante di dissociazione,Kd, del complesso RL.

B. Lo sviluppo di nuovi farmaci 23© 88-08-07893-0

capitolo 8. Supponiamo che il bersaglio del far-maco sia un enzima, e che il potenziale farmacoagisca da inibitore competitivo. La concentra-zione che il potenziale farmaco deve raggiunge-re per inibire efficacemente l’enzima dipenderàdalla concentrazione fisiologica del substrato del-l’enzima (figura B3). Quanto più elevata è la con-centrazione del substrato endogeno, tanto mag-giore è la concentrazione che il potenziale far-maco deve raggiungere perché l’enzima possa es-sere efficacemente inibito. L’effetto della con-centrazione del substrato viene espresso dalla co-stante di dissociazione apparente, Kd

app, espressadall’equazione

Kdapp = Kd(1 + [S]/KM)

dove [S] è la concentrazione del substrato e KMè la costante di Michaelis per il substrato. Si notiche la Kd per l’inibitore di un enzima viene spes-so indicata come costante di inibizione, Ki.

In molti casi il saggio enzimatico diretto o latitolazione col ligando non bastano; bisogna ri-correre a saggi più complessi, al fine di determi-nare l’efficacia di un potenziale farmaco. Peresempio, la frazione di batteri uccisi potrebbe es-sere utilizzata come indice dell’efficacia di un an-tibiotico. In questi casi vengono utilizzati altriparametri, come l’EC50, che indica la concen-trazione del potenziale farmaco richiesta per rag-giungere il 50% della risposta biologica (figuraB4). Analogamente l’EC90 indica la concentra-zione del potenziale farmaco richiesta per rag-giungere il 90% della risposta biologica. Nell’e-sempio dell’antibiotico, l’EC90 indica la con-centrazione dell’antibiotico richiesta per uccide-re il 90% dei batteri. Nel caso degli inibitori ven-gono spesso utilizzati i termini IC50 e IC90 perindicare le concentrazioni dell’inibitore necessa-rie per ridurre la risposta rispettivamente del 50%o del 90%, rispetto ai valori misurati in assenzadi inibitore.

I valori di EC50, EC90, IC50 e IC90 sono unamisura della capacità di un potenziale farmacodi modulare l’attività del bersaglio molecolaredesiderato. Per prevenire effetti indesiderati, spes-so chiamati effetti collaterali, un potenziale far-maco ideale non dovrebbe legarsi in modo ap-prezzabile a molecole diverse dalla molecola ber-saglio. Realizzare un tale farmaco costituisce unavera e propria sfida, soprattutto se la molecolabersaglio fa parte di una famiglia di proteine cor-relate evoluzionisticamente tra loro. Il grado dispecificità può essere valutato misurando il rap-porto tra i valori di Kd per il legame del poten-ziale farmaco con qualsiasi altra molecola con-trollo e il valore di Kd per il legame del poten-

ziale farmaco con la molecola bersaglio deside-rata.

I farmaci devono possedere proprietàadatte al raggiungimento dei loro bersagli

Finora ci siamo soffermati sulla capacità di alcu-ne molecole di agire su specifici bersagli moleco-lari. Però i farmaci devono possedere anche altrecaratteristiche. Per essere efficaci devono poteressere somministrati agevolmente, e inoltre de-vono raggiungere i loro bersagli in concentrazio-ni adeguate. Prima di raggiungere il suo bersaglioogni farmaco incontra diversi ostacoli dovuti alsuo assorbimento, alla sua distribuzione, al suometabolismo e alla sua escrezione. Questi pro-cessi, tutti correlati tra loro, vengono riportati informa schematica nella figura B5. Nel loro insie-me, le proprietà di assorbimento, distribuzione,metabolismo ed escrezione di un farmaco ven-gono collettivamente denominate proprietàADME.

Somministrazione e assorbimento Idealmente,i farmaci dovrebbero essere assunti per via orale,sotto forma di piccole compresse. Il composto at-tivo deve poter resistere alle condizioni acide del-lo stomaco, per essere poi assorbito attraverso l’e-pitelio intestinale. Ne consegue che il compostodeve attraversare le membrane cellulari a velocitàapprezzabile. Macromolecole come le proteine

[Ligando]

Substrato assente

Substrato a bassaconcentrazione

Substrato a più altaconcentrazione

[Ligando] = Kdapp

0

Satu

razi

one

fraz

iona

le

1,0

0,5

[Ligando]

[Ligando] = EC90

[Ligando] = EC50

0

Risp

osta

bio

logi

ca (

%)

10090

50

Figura B3 Gli inibitoricompetono col substra-to per i siti di legameLe curve di legame mostra-te qui descrivono l’anda-mento del legame di uninibitore col recettore inassenza del substrato e inpresenza di concentrazionicrescenti di substrato.

Figura B4 Concentra-zioni efficaciLa concentrazione di unligando che provoca larisposta biologica può es-sere quantificata in terminidi EC50, che corrispondealla concentrazione allaquale si raggiunge il 50%della risposta massima, ein termini di EC90, la con-centrazione alla quale siraggiunge il 90% dellarisposta massima.


non possono essere somministrate oralmente, per-ché vengono denaturate nell’ambiente acido del-lo stomaco, e comunque non potrebbero essereassorbite. La capacità di un composto di essereassorbito viene spesso quantificata come biodi-sponibilità orale. Questo termine definisce il rap-porto tra la massima concentrazione raggiuntada un composto somministrato oralmente e lamassima concentrazione raggiunta dallo stessocomposto somministrato per via endovenosa. Labiodisponibilità può variare notevolmente da spe-cie a specie, quindi è difficile estrapolare all’uo-mo i risultati ottenuti nell’animale. Tuttavia è sta-to possibile dedurre qualche regola generale. Atal proposito sono di grande utilità le regole diLipinski.

Le regole di Lipinski stabiliscono che si ha uncattivo assorbimento quando

1. il peso molecolare del composto in esame èsuperiore a 500;

2. il numero dei gruppi donatori per la forma-zione di legami a idrogeno è maggiore di 5;

3. il numero dei gruppi accettori per la forma-zione di legami a idrogeno è maggiore di 10;

4. il coefficiente di ripartizione [misurato comelog(P)] è maggiore di 5.

Il coefficiente di ripartizione è una misura dellatendenza di una molecola a «solubilizzarsi» neldoppio strato lipidico delle membrane, ed è cor-relato con la sua solubilità nei solventi organici.Si determina lasciando equilibrare il composto tral’acqua e una fase organica, costituita dall’n-otta-nolo. Il valore del log(P) viene definito come illog10 del rapporto della concentrazione di un com-posto in n-ottanolo e la concentrazione del com-posto in acqua. Per esempio, se la concentrazio-ne del composto in n-ottanolo è 100 volte supe-riore a quella nella fase acquosa, il log(P) è 2.

Per esempio, la morfina soddisfa le regole diLipinski e ha una discreta biodisponibilità (figu-ra B6). Tuttavia, anche se un farmaco non sod-disfa una o più di una delle regole su elencate,può ancora avere una soddisfacente biodisponi-bilità. Le regole di Lipinski vanno consideratecome principi guida ai fini di valutare nuovi pos-sibili farmaci.

La distribuzione I composti che attraversano lamembrana delle cellule epiteliali intestinali pas-sano nel torrente circolatorio. Però i compostiidrofobi, e molti altri ancora, hanno bassa solu-bilità. Essi si legano ad alcune proteine che, comel’albumina (figura B7), sono presenti nel siero aconcentrazioni elevate, e vengono trasportate inogni distretto corporeo raggiunto dalla circola-zione sanguigna.

Una volta che un composto ha raggiunto iltorrente circolatorio, si distribuisce nei differen-ti fluidi e tessuti, spesso denominati comparti-menti. Alcuni composti si concentrano soprat-tutto nei loro compartimenti bersaglio, o legan-dosi alle loro specifiche molecole bersaglio, o at-traverso altri meccanismi. Altri si distribuisconoin modo più uniforme (figura B8). Perché un far-maco risulti efficace, dovrà raggiungere il com-partimento bersaglio in quantità sufficiente; mala concentrazione del composto si riduce tutte levolte che si distribuisce anche in compartimentidiversi dal compartimento bersaglio.

ESCREZIONEASSORBIMENTO

Compartimentobersaglio

Altricompartimenti

DISTRIBUZIONE

Flusso ematico

METABOLISMO

Trasformazione

Libero

Legato

Libero Legato

Libero

Legato

Metaboliti

Figura B5 Assorbimen-to, distribuzione, meta-bolismo ed escrezione(ADME)La concentrazione di uncomposto a livello del suosito bersaglio (in giallo) è ilrisultato delle velocità delsuo assorbimento, distribu-zione, metabolismo edescrezione.

Morfina (C17H19O3N)

O

HO

HO

H

NHH

CH3

Due possibilidonatori diidrogeno

Quattro possibiliaccettori diidrogeno

Peso molecolare = 285

log(P) = 1,27

Figura B6 Le regole di Lipinski applicate alla morfinaLa morfina soddisfa tutte e quattro le regole di Lipinski. La sua biodisponibilità orale per l’uo-mo è del 33%.


Talvolta risulta difficile per un farmaco rag-giungere il compartimento bersaglio. Molti com-posti non raggiungono il sistema nervoso cen-trale, perché vengono trattenuti dalla barrieraemato-encefalica, formata dalle strette giunzionitra le cellule endoteliali che rivestono il lato lu-minale dei vasi sanguigni nel cervello e nel mi-dollo spinale.

Metabolismo ed escrezione L’ultimo ostacoloche molti potenziali farmaci devono superare èquello di eludere le difese dell’organismo controle sostanze estranee. Tali composti (frequente-mente denominati composti xenobiotici o sempli-cemente xenobiotici) vengono spesso eliminaticon le urine o con le feci, dopo essere stati meta-bolizzati, cioè degradati o comunque modificatiper agevolarne l’escrezione. Questo processo, de-nominato metabolismo del farmaco, pone forti li-miti alla sua efficacia, perché ne diminuisce laconcentrazione, via via che il farmaco viene me-tabolizzato. Ne consegue che i composti che ven-gono metabolizzati rapidamente devono esseresomministrati con maggior frequenza e a dosi piùelevate.

Gli xenobiotici vengono metabolizzati attra-verso due vie metaboliche principali: l’ossidazio-ne e la coniugazione. Le reazioni di ossidazionepossono favorire l’escrezione in almeno due modi:aumentando la solubilità in acqua, e quindi faci-litando il trasporto, e introducendo un gruppofunzionale, che verrà coinvolto in successivi pas-saggi metabolici. Queste reazioni vengono spes-so promosse dagli enzimi del citocromo P450 delfegato (cap. 26, p. 673). Il genoma umano codi-fica più di 50 differenti citocromi P450, enzimicontenenti un gruppo eme, molti dei quali par-tecipano al metabolismo degli xenobiotici. Una

tipica reazione, catalizzata da una delle formeisoenzimatiche del P450 è l’ossidrilazione dell’i-buprofene (figura B9).

La coniugazione consiste nell’aggiunta di unparticolare gruppo al composto xenobiotico. Igruppi utilizzati più comunemente sono il glu-tatione (cap. 20, p. 520), l’acido glucuronico eil solfato (figura B10). L’adddizione spesso au-menta la solubilità in acqua e fornisce una sortadi marcatura che viene riconosciuta per favorireil processo di escrezione del farmaco. Esempi direazioni di coniugazione sono l’addizione del glu-tatione alla molecola antitumorale ciclofosfam-mide, l’addizione del glucuronidato all’analgesi-co morfina, e l’addizione di un gruppo solfato

Figura B7 Strutturadella sieralbuminaumana, una proteinache funge da trasporta-tore di farmaciSette molecole idrofobe(in rosso) sono legate allaproteina. [Fonte:1BKE.pdb.]

Cervello Cuore Fegato

Milza

MuscoloRene

�g/mL60

48

36

24

12

0,0

NOH

N NN

N

N

FFFluconazolo

Figura B8 Distribuzione del fluconazoloUna volta assorbiti, i composti attivi si distribuiscono nei vari organi.La figura mostra la distribuzione del fungicida fluconazolo, monitora-ta attraverso l’uso della tomografia a emissione di positroni (PET). Leimmagini sono state ottenute da un soggetto umano sano volonta-rio, 90 minuti dopo l’iniezione di una dose di 5 mg kg–1 di flucona-zolo, contenente tracce di fluconazolo marcato con l’isotopo 18Femittente positroni. [Fonte: A. J. Fischman et al., Antimicrob. AgentsChemother. 37(1993): 1270-1277.]


al minoxidil, uno stimolatore della crescita deicapelli.

È interessante notare che la solfatazione delminoxidil produce un composto che è più attivodello stesso minoxidil non modificato nel pro-muovere la crescita dei capelli. Anche se in ge-nere il farmaco modificato metabolicamente è

meno attivo di quello originario, qualche voltapuò accadere che sia invece più attivo.

La reazione di ossidazione spesso precede quel-la di coniugazione, perché può generare un ossi-drile o qualche altro gruppo cui possono legarsicomposti come l’acido glucuronico. Le reazionidi ossidazione dei composti xenobiotici vengono

NADPH + H+ + O2 + NADP+ + H2O +

Ibuprofene

H3C CH3

H

H3C CH3

H CH3

COOHHO

H CH3

COOH

Figura B9 Modificazione dell’ibuprofene catalizzata dal sistema del citocromo P450Le forme isoenzimatiche del sistema del citocromo P450, soprattutto nel fegato, catalizzano reazioni che interessano il metabolismo degli xenobiotici, ad esem-pio reazioni di ossidrilazione. Tali reazioni introducono un atomo di ossigeno che deriva dall’ossigeno molecolare.

Figura B10 Reazioni di coniugazioneComposti che possiedono gruppi appropriati vengono spesso modificati attraverso reazioni di coniugazione. Tali reazioni includono l’addizione del glutatione (inalto), dell’acido glucuronico (al centro), o del solfato (in basso). I prodotti coniugati sono mostrati nel riquadri.

�OOC

O

NH

O

HN COO�

H NH3+

H

SH

�OOC

O

NH

O

HN COO�

H NH3+

H

SR

+ RX + HX

Glutatione

O

COOH

OH

OH

HO

HOP

O

O O

OHOH

HN

O

O

�

PO

O O�

+ ROH

Acido UDP-�-D-glucuronico

OR+

+ ROH

3�-Fosfoadenosina-5�-fosfosolfato (PAPS)

+

O

O

COOH

OH

OH

HOP

O

O OO

OHOH

HN

O

O

�

PO

O O�

NO

N

ROS

O�

O O

N

N

N

H2N

O2�O3P

�OS

O

O O

OH

PO

O O�

ON

N

N

N

H2N

O2�O3P

HO

OH

PO

O O�

ON


spesso denominate trasformazioni di fase I, e lereazioni di coniugazione trasformazioni di fase II.Queste reazioni hanno luogo principalmente nelfegato. Poiché il sangue fluisce dall’intestino di-rettamente nel fegato attraverso la vena porta, ilmetabolismo degli xenobiotici modifica i farma-ci prima che questi raggiungano la circolazionevera e propria. Questa trasformazione metabolicaprimaria può limitare in modo sostanziale la di-sponibilità dei composti assunti oralmente.

Una volta entrati nel torrente circolatorio, icomposti possono essere rimossi dal circolo, edescreti attraverso due meccanismi principali. Pri-mo, possono attraversare il filtro renale ed essereescreti con le urine. In questo processo il sanguepassa attraverso i glomeruli, costituiti da una fit-ta rete di capillari che nei reni agiscono appuntocome filtri. Composti di peso molecolare infe-riore a 60 000 possono passare attraversi i glo-meruli renali. Molte molecole idrosolubili, comeil glucosio, i nucleotidi e altri composti a bassopeso molecolare, passano attraverso i glomeruli evengono riassorbiti nel torrente circolatorio, oper mezzo di trasportatori ad ampio spettro dispecificità, o tramite il trasferimento passivo dimolecole idrofobe attraverso le membrane. Far-maci e metaboliti che vanno incontro alla primatappa di filtrazione, e non subiscono il processodi riassorbimento, vengono invece escreti.

Tramite il secondo meccanismo i compostivengono attivamente trasportati nella bile, unprocesso che ha luogo nel fegato. Dopo aver su-bito una fase di concentrazione, la bile fluisce nel-l’intestino. Nell’intestino i farmaci e i metaboli-ti possono essere escreti attraverso le feci, oppu-re riassorbiti nel torrente circolatorio e ulterior-mente degradati dagli enzimi digestivi. Talvoltai composti vengono riciclati dal sangue nell’inte-stino, e di qui di nuovo nel sangue, un processospesso denominato circolo entero-epatico (figuraB11). Questo processo può diminuire in modo

significativo la velocità di escrezione di alcunicomposti, in quanto questi eludono il processodi escrezione e rientrano in circolo.

La cinetica di escrezione è spesso complessa.In alcuni casi una percentuale fissa del compo-sto viene escreta in un dato periodo di tempo (fi-gura B12). Questa via di escrezione risulta nellaperdita esponenziale del composto dal torrentecircolatorio, che può essere caratterizzata dal tem-

�OOC

O

NH O

HN

COO�

HNH3

H

S

NP

ONH

OCl

�

Coniugato ciclofosfammide-glutatione

O

HO

O

N

H

H

CH3

O

COOH

OH

OH

HO

Morfina glucuronidato

N

N

N

HN

H2N

O

S

OO

�O

Minoxidil solfato

Fegato

Intestino

DottobiliareVena

porta

Circolazione

[Far

mac

o]

100%

Tempot1/2

Figura B11 Circolo en-tero-epaticoAlcuni farmaci possonopassare dal torrente circo-latorio nel fegato, quindinella bile, nell’intestino, nelfegato e di nuovo nel tor-rente circolatorio. Tale for-ma di riciclo rallenta lavelocità di escrezione.

Figura B12 Tempo diemivita dell’escrezionedi un farmacoNel caso mostrato, la con-centrazione del farmaconel torrente circolatoriodiminuisce della metà delsuo valore durante unperiodo di tempo, t1/2,denominato tempo diemivita.


po di emivita (o tempo di dimezzamento, t1/2),cioè il periodo di tempo richiesto per eliminareil 50% del composto che via via viene escreto.Esso è una misura di quanto a lungo una con-centrazione efficace del composto rimane nel si-stema dopo la somministrazione. Pertanto il tem-po di emivita costituisce il fattore più importanteper determinare la frequenza con cui si deve as-sumere un farmaco. Un farmaco con un tempodi emivita sufficientemente lungo può essere as-sunto solo una volta al giorno, mentre un far-maco con un tempo di emivita breve dovrà es-sere assunto 3 o 4 volte al giorno.

La tossicità può limitare l’efficacia di unfarmaco

La tossicità di un farmaco non deve essere tale dadanneggiare l’organismo che lo assume. Un far-maco può essere tossico per molte ragioni. Puòprovocare un eccesso di modulazione della mole-cola bersaglio. Per esempio, un eccesso del far-maco anticoagulante coumadin può provocareuna emorragia pericolosa e incontrollata, che puòrisultare mortale. Oppure il farmaco può modu-lare le proprietà di proteine diverse, ma correla-te alla molecola bersaglio. Composti diretti a in-teragire con un membro di una famiglia di enzi-mi o di recettori, spesso si legano ad altri mem-bri della famiglia. Per esempio, un farmaco anti-virale diretto contro le proteasi virali può diven-tare tossico se inibisce anche proteasi normal-mente presenti nei tessuti, come quelle che re-golano la pressione sanguigna.

Un composto può risultare tossico anche tra-mite la modulazione dell’attività di proteine noncorrelate con il suo bersaglio molecolare. Per esem-pio, molti composti bloccano i canali ionici, come

il canale per il potassio HERG (l’omologo uma-no di un canale della Drosophila trovato in unmutante chiamato «ether-a-go-go»), e causano al-terazione della frequenza cardiaca. Per evitare glieffetti collaterali sul cuore, la capacità di blocca-re tali canali viene provata su molti potenziali far-maci.

Infine, anche se il composto non è di per sétossico, lo possono essere i prodotti del suo me-tabolismo. Anche i processi metabolici della faseI possono generare dei prodotti con gruppi chi-mici dannosi. Un esempio importante è quellodella tossicità epatica che si osserva assumendoforti dosi di acetaminofene (figura B13). Una par-ticolare isoforma del complesso del citocromoP450 ossida l’acetaminofene in N-acetil-p-ben-zochinone imina. Questo composto si coniugacol glutatione. Però, quando si usano forti dosidi acetaminofene, la concentrazione di glutatio-ne nel fegato diminuisce drammaticamente, e ilfegato non è più in grado di proteggersi sia dal-l’N-acetil-p-benzochinone imina, sia da altri com-posti. La nausea e il vomito sono i primi sintomiconseguenti a un’assunzione eccessiva di aceta-minofene. Nel giro di 24-48 ore possono insor-gere sintomi di insufficienza epatica. Il 35% deicasi di insufficienza epatica negli Stati Uniti è do-vuto all’avvelenamento da acetaminofene. Il tra-pianto di fegato costituisce spesso il solo tratta-mento possibile.

La tossicità di un farmaco può essere studia-ta determinando il suo indice terapeutico. Tale mi-sura di tossicità si effettua su animali da esperi-mento, in genere topi o ratti. L’indice terapeuti-co viene definito come il rapporto tra la dose delcomposto che risulta letale per la metà degli ani-mali da esperimento utilizzati per il test (riferitacome LD50) e la dose terapeutica efficace, in ge-

HN

O

CH3

OH

N

O

CH3

O

O

NH O

HN

COO�

HNH3

H

S

HN

O

CH3

OH

Citocromo P450 GlutationeS-trasferasi

Glutatione

+

Acetaminofene N-Acetil-p-benzochinone imina

�OOC

Figura B13 Tossicitàdell’acetaminofeneUn prodotto secondariodel metabolismo dell’ace-taminofene è la N-acetil-p-benzochinone imina, chesi coniuga col glutatione.Forti dosi di acetaminofenepossono quindi diminuirele riserve di glutatione.


nere l’EC50. Pertanto un indice terapeutico di1000 sta a indicare che la letalità risulta signifi-cativa solo quando si somministrano dosi 1000volte maggiori rispetto alla dose terapeutica.

Molti composti mostrano proprietà favore-voli in vitro, ma falliscono quando vengono som-ministrati a un organismo vivente, a causa delleloro proprietà ADME sfavorevoli e della loro tos-sicità. Sono necessari lunghi e costosi esperimentisugli animali per verificare se un composto è onon è tossico, ma le differenti risposte che si ot-tengono da specie animali diverse spesso rendo-no problematico decidere se proseguire gli studisull’uomo. Tuttavia si spera che, con l’approfon-dimento e l’ampliamento delle conoscenze bio-chimiche, si potranno un giorno progettare mo-delli computerizzati in grado di sostituire o di su-perare la sperimentazione animale. Tali modellidovrebbero accuratamente predire il destino me-tabolico di un composto all’interno di un orga-nismo, sulla base della sua struttura molecolare,o di altre proprietà facilmente misurabili in la-boratorio, senza far uso di animali.

B2 SI POSSONO SCOPRIREPOTENZIALI FARMACI PERSERENDIPITÀ (OSSERVAZIONEFORTUITA), SCREENING OPROGETTAZIONE

Per lungo tempo molti farmaci sono stati sco-perti per osservazione casuale o serendipità. Oggiinvece, si ricorre allo screening di raccolte (libre-rie) di prodotti naturali o di altri composti, al finedi individuare quelli che presentano le proprietàterapeutiche desiderate. Alternativamente, si pos-sono progettare farmaci specifici, utilizzando idati disponibili sulla struttura del bersaglio mo-lecolare preselezionato. Esamineremo qui di se-guito alcuni esempi di ciascuna delle suddettemodalità, al fine di trarne principi generali.

Le osservazioni fortuite possonoindirizzare la ricerca sui farmaci

Forse l’osservazione fortuita più famosa nella sto-ria dello sviluppo dei farmaci è quella che Alexan-der Fleming fece nel 1928 sulle colonie di Staphy-lococcus aureus, un batterio patogeno. Flemingnotò che la crescita di alcune colonie batteriche,venute accidentalmente a contatto con spore delPenicillium notatum, veniva inibita. Subito Fle-ming ne dedusse che la muffa produceva una so-stanza in grado di uccidere i batteri patogeni.Questa scoperta portò a un approccio del tuttoinnovativo per il trattamento delle infezioni bat-

teriche. In seguito Howard Flory ed Ernest Chainottennero dal Penicillium una sostanza in formadi polvere, denominata penicillina, che entrò inuso nel 1940 come antibiotico.

La struttura della penicillina fu delucidata nel1945. La sua caratteristica più interessante è l’a-nello �-lattamico a 4 termini. Questa strutturanon comune è essenziale per la funzione della pe-nicillina (cap. 8, p. 195).

La vastissima applicazione della scoperta diFleming si basa su tre punti cruciali. Primo: ven-ne realizzato un processo industriale per la pro-duzione del fungo Penicillium su larga scala. Se-condo: la penicillina e molti suoi derivati venne-ro sintetizzati chimicamente. La disponibilità diderivati sintetici della penicillina aprì la stradaallo studio della relazione tra struttura e funzio-ne delle biomolecole. Molti derivati della peni-cillina hanno trovato ampia applicazione in me-dicina. Terzo: Jack Strominger e James Park, in-dipendentemente l’uno dall’altro, chiarirono ilmeccanismo d’azione della penicillina nel 1965(figura B14), come già riferito nel capitolo 8.

Molti altri farmaci sono stati scoperti per os-servazione casuale. Il farmaco antineuroletticoclorpromazina (Torazina®) è stato scoperto nelcorso di alcune ricerche sul trattamento delloshock chirurgico. Nel 1952 il chirurgo franceseHenri Laborit notò che, dopo aver assunto il far-maco, i pazienti diventavano più calmi. Questaosservazione suggerì che la clorpromazina potes-se essere utilizzata nella pratica psichiatrica. Inrealtà il farmaco è stato utilizzato per molti anniper il trattamento di pazienti schizofrenici o af-

Penicillina

N

SHN

Anello�-lattamico

O

R

O

H

CH3

CH3

COO�

Cl

N CH3

CH3

N

S

Clorpromazina


fetti da altri disturbi. Però la clorpromazina hamolti effetti collaterali, e oggi il suo uso è statolargamente superato da farmaci di più recenterealizzazione.

La clorpromazina agisce legandosi ai recetto-ri della dopamina, un neurotrasmattitore, bloc-candone la funzione (figura B15). I recettori D2della dopamina fungono da bersaglio di molti al-tri farmaci usati in psichiatria. Al fine di trovarefarmaci con effetti collaterali più limitati, sonostati effettuati studi intesi a correlare gli effettidel farmaco con parametri biochimici, quali lecostanti di dissociazione e le costanti di velocitàdi formazione e di demolizione.

L’esempio più recente di una scoperta avve-nuta per caso è il sildenafil (Viagra®). Inizialmentequesto composto è stato utilizzato come inibito-re della fosfodiesterasi 5, un enzima che cataliz-za l’idrolisi del cGMP a GMP (figura B16). Sipensava che il sildenafil potesse essere utilizzatoper il trattamento dell’ipertensione e dell’angina,essendo noto che il cGMP svolge un ruolo cen-

D-AlaSer

L-Ala

D-Glu

DAP

D-Ala

L-Ala

D-Glu

DAP

D-Ala

D-Ala

Transpeptidasi

L-Ala

D-Glu

DAP

D-Ala

L-Ala

D-Glu

DAP

D-Ala

D-Ala

Transpeptidase

L-Ala

D-Glu

DAP

D-Ala

D-AlaL-Ala

D-Glu

DAP

D-Ala

D-Ala

N -Acetilglucosammina

Acido N -acetilmuramico

Legame DAP–D-Ala

Acido diamminopimelico(DAP)

HN HN

OH

�OOC H O

NH

H3C H

D-Ala

Figura B14 Meccani-smo di biosintesi dellaparete cellulareL’enzima transpeptidasicatalizza la formazione diun legame crociato tragruppi peptidoglicanici.Nell’esempio mostrato, latranspeptidasi catalizza laformazione di un legamecovalente tra la D-alaninaterminale di una catenapeptidica e l’acido diammi-nopimelico (DAP), che faparte di un’altra catenapeptidica. Il legame tral’acido diamminopimelicoe l’alanina (in basso a sini-stra) si trova nei batterigram-negativi, come l’E.coli. Nei batteri gram-posi-tivi i legami crociati si for-mano tra peptidi ricchi inglicina. La penicillina inibi-sce l’azione della transpep-tidasi; in tal modo i batteriesposti al farmaco vengo-no a possedere pareti cel-lulari deboli, e quindi su-scettibili alla lisi.

Figura B15 Bersagli della clorpromazinaQesta immagine ottenuta per tomografia a emissione di posi-troni mostra la distribuzione dei recettori D2 della dopaminanel cervello. I siti recettoriali vengono bloccati a seguito deltrattamento con la clorpromazina. [Fonte: C. Trichard et al.,Am. J. Psychiatry 155 (1998): 505-508; riproduzione autoriz-zata dal Copyright Clearance Center, Inc.]

2

1

0

NH2

OH

OH

Dopamina


trale nel processo di rilassamento delle cellule del-la muscolatura liscia dei vasi sanguigni (figuraB17). Ci si aspettava quindi che, inibendo la fo-sfodiesterasi 5 e quindi bloccando la degradazio-ne del cGMP, i suoi livelli aumentassero. Nel cor-so delle prime sperimentazioni cliniche effettua-te nel Galles, in alcuni soggetti di sesso maschilesi verificò una abnorme erezione del pene. Nonrisultò subito chiaro se questa osservazione ca-suale fatta su pochi soggetti fosse da ascriversi alcomposto o ad altri fattori. Però l’osservazioneaveva un certo fondamento biochimico, poichési sapeva che il rilassamento della muscolatura li-scia, dovuto all’aumento dei livelli del cGMP, gio-ca un ruolo nel processo di erezione del pene. Pro-ve cliniche successive, intese a valutare l’effettodel sildenafil nelle disfunzioni erettili, ebbero suc-cesso. Il caso del sildenafil dimostra quanto siaimportante osservare attentamente i pazienti sot-toposti ai test clinici. Un’osservazione accidenta-le ha condotto a un nuovo trattamento per le di-sfunzioni erettili, e ha aperto un mercato di mol-ti miliardi di euro all’anno.

Lo screening di collezioni di compostipuò condurre alla scoperta di nuovifarmaci

Nessun farmaco ha una diffusione così ampiacome l’acido acetilsalicilico. Fin dai tempi di Ip-pocrate (∼400 a.C.) era stato notato che l’uso diestratti della corteccia e delle foglie del salice ser-viva ad alleviare il dolore. Nel 1829 fu isolata dal-la corteccia di salice una miscela chiamata salici-na. Analisi successive permisero di identificarecome acido salicilico il componente attivo dellamiscela. In un primo momento l’acido salicilicovenne usato per il trattamento del dolore, maspesso provocava irritazioni allo stomaco. Alcu-ni ricercatori tentarono di trovare un modo perneutralizzare questo effetto collaterale dell’acido

salicilico. Felix Hoffmann, un chimico che lavo-rava in Germania presso la Bayer, sintetizzò underivato meno irritante, trattando l’acido salici-lico con una base e con acetil cloruro. Al com-posto che ne derivò, l’acido acetilsalicilico, fu at-tribuito il nome commerciale aspirina da «a» chesta per acetil cloruro, «spir», che sta per Spiraeaulmaria (una pianta che contiene acido salicili-co), e «ina» (un suffisso comune a molti farma-ci). Ogni anno si consumano 35 000 tonnellatedi aspirina in tutto il mondo, corrispondenti qua-si al peso del Titanic.

Come discusso nel capitolo 12, il gruppo ace-tilico dell’aspirina viene trasferito su un residuodi serina che fa parte del sito attivo della cicloos-sigenasi, un componente della prostaglandina H2sintasi (cap. 12, p. 301). In tal modo il gruppoacetilico blocca l’accesso del substrato al sito at-tivo. Pertanto, anche se l’aspirina e l’acido salici-lico si legano nello stesso sito dell’enzima, il grup-

Sildenafil cGMP

N

N

N

NH

O

O

O

PO

O

O

NH2

OH

HN

N

N

N

O CH3

O

SN

O

ON

H3C

Figura B16 Il sildenafil,un analogo del cGMPLa molecola del sildenafil èstata progettata come ana-logo del cGMP, il substratodella fosfodiesterasi 5.

Figura B17 Biochimica del rilassamento muscolareL’aumento dei livelli di NO stimola la guanilato ciclasi, che catalizza la sintesi del cGMP. L’au-mento della concentrazione del cGMP conduce a rilassamento muscolare. La fosfodiesterasi5 idrolizza il cGMP con conseguente diminuzione della concentrazione del nucleotide ciclico.L’inibizione della fosfodiesterasi 5 da parte del sildenafil mantiene elevati i livelli di cGMP.

cGMP

PPi

H2O

Rilassamentomuscolare

GMP

GTP

Sildenafil

Guanilato ciclasiNOAcido nitrico

Fosfodiesterasi 5−

+

COOH

OH

Acido salicilico

COOH

O

O

CH3

Aspirina(Acido acetilsalicilico)

Gruppoacetile


po acetilico dell’aspirina ne aumenta di moltol’efficacia terapeutica. Questo esempio illustral’importanza di effettuare screening di estratti dipiante o di altre fonti biologiche, che si pensapossano avere proprietà terapeutiche per la pre-senza di composti attivi. Il gran numero di fito-preparati e di rimedi usati nella medicina tradi-zionale popolare costituisce una vera fonte per lascoperta di nuovi farmaci.

Più di 100 anni fa venne scoperta nelle pare-ti arteriose di pazienti morti per malattie vasco-lari la presenza di un materiale grasso-giallastro,che fu chiamato ateroma, dalla parola greca cor-rispondente a «pappa». Tale materiale fu identi-ficato come colesterolo. Gli studi di Framinghamsull’apparato cardiaco, iniziati nel 1948, docu-mentarono una netta correlazione tra i livelli ele-vati del colesterolo ematico e l’alta mortalità permalattie cardiache. Questa osservazione condus-se al convincimento che, bloccando la sintesi delcolesterolo, si potesse abbassare il suo livello ema-tico, e quindi diminuire il rischio di malattie car-diache. Ma i primi tentativi, intesi a bloccare lasintesi del colesterolo inibendo una delle reazio-ni finali della via biosintetica, dovettero essere ab-bandonati a causa dell’insorgenza di effetti colla-terali, come la cataratta, provocati dall’accumu-lo del substrato dell’enzima inibito, dotato di scar-sa solubilità. Venne allora identificato un bersa-glio più favorevole, l’enzima HMG-CoA ridut-tasi (cap. 26, p. 661). Questo enzima agisce sulsubstrato, l’HMG-CoA (3-idrossi-3-metilgluta-ril coenzima A), che può essere utilizzato anchein altre vie metaboliche ed è solubile in acqua.

Un prodotto naturale promettente, la com-pattina, fu scoperto durante la ricerca di agentiantibatterici presenti nel brodo di fermentazionedel Penicillium citrinum. La sperimentazione su-gli animali dimostrò che in alcune specie la com-pattina inibisce l’HMG-CoA riduttasi e abbassai livelli sierici del colesterolo. Nel 1982 fu trova-

to nel brodo di fermentazione di Aspergillus ce-reus un nuovo inibitore dell’HMG-CoA ridutta-si. Tale composto, ora denominato lovastatina, èstrutturalmente molto simile alla compattina, dacui differisce semplicemente perché possiede ungruppo metilico in più.

Le prove cliniche hanno dimostrato che la lo-vastatina riduce i livelli di colesterolo sierico conpochi effetti collaterali, la maggior parte dei qua-li può essere prevenuta per trattamento con me-valonato (il prodotto dell’HMG-CoA riduttasi),a dimostrazione che gli effetti collaterali sono do-vuti molto probabilmente al blocco quasi com-pleto dell’enzima. Uno di questi effetti collatera-li, la cui causa è però ancora da stabilire, è costi-tuito da dolore e debolezza muscolare (che van-no sotto il nome di miopatia). Dopo una serie dilunghe ricerche, la Food and Drug Administra-tion (FDA) ha ammesso la lovastatina per il trat-tamento dell’ipercolesterolemia.

Un altro inibitore correlato strutturalmentecon la lovastatina diminuisce in modo statistica-mente significativo il numero dei decessi dovutia malattie coronariche. Un risultato, questo, chedimostra gli effetti benefici provocati dall’abbas-samento della colesterolemia. Ulteriori studi sulmeccanismo d’azione hanno rivelato che l’inibi-tore dell’HMG-CoA riduttasi agisce non solo di-minuendo la velocità di biosintesi del colestero-lo, ma anche inducendo l’espressione dei recet-tori delle lipoproteine a bassa densità (LDL) (cap.26, p. 667). Le cellule che possiedono tali recet-tori rimuovono le particelle di LDL dal torrentecircolatorio, che quindi non possono più contri-buire alla formazione dell’ateroma.

La lovastatina e i composti correlati possonoessere prodotti naturali o composti facilmente ot-tenibili dai prodotti naturali. Il passo successivoè stato lo sviluppo di molecole totalmente sinte-tiche, che inibiscono ancora più effecacementel’HMG-CoA riduttasi (figura B18), che agisco-

CH3H

O

CH3

O O

H

O

HO

H3C

Lovastatina

CH3H

O

CH3

O O

H

O

HO

Compattina


N

F

NNH

O

F

OH

COOH

OH

H3C CH3

N

COOH

N

CH3

S

O

OH3C

OH OH

Atorvastatina Rosuvastatina

Figura B18 Statine sinteticheL’atorvastatina (Lipitor®) e larosuvastatina (Crestor®) sonofarmaci interamente sintetici cheinibiscono l’HMG-CoA riduttasi.

Pool

Primo setdi reagenti

Secondo setdi reagenti

Figura B19 Sintesi perseparazione e rimesco-lamento (split-pool)Le reazioni vengono fatteavvenire su granuli. Lareazione col primo set direagenti si fa avvenire sudiverse aliquote di granuli,separatamente. I granulivengono poi riuniti, mesco-lati, e di nuovo divisi indiverse aliquote. Si aggiun-ge ora il secondo set direagenti. Verranno prodottidiversi composti, ma icomposti legati a ognisingolo granulo sarannoidentici.


no a dosi più basse e inducono meno effetti col-laterali.

I primi inibitori dell’HMG-CoA riduttasi,come pure i loro precursori, sono stati scopertiattraverso lo screening di raccolte (librerie) di pro-dotti naturali. Oggi si tenta di effettuare lo screen-ing di ampie librerie non solo di prodotti natu-rali, ma anche di composti sintetici ottenuti nelcorso di ricerche programmate per lo sviluppodei farmaci. Attraverso questa procedura, deno-minata screening ad altissimo rendimento, centi-naia di migliaia, o anche milioni, di compostipossono essere sperimentati in condizioni favo-revoli. Un approccio alternativo consiste nel sin-tetizzare un gran numero di composti struttural-mente correlati, che differiscono tra loro solo inuna o più posizioni. Tale approccio spesso è chia-mato chimica combinatoria. La tecnica consistenel sintetizzare diversi composti attraverso le stes-se reazioni chimiche, ma utilizzando un set va-riabile di reagenti. Immaginiamo di avere a di-sposizione un supporto molecolare di riferimen-to contenente due siti reattivi e che 20 reagentipossano essere usati per reagire col primo sito e40 col secondo. Ne consegue che è possibile sin-tetizzare un totale di 20 × 40 = 800 possibili com-posti.

La metodologia di base della chimica combi-natoria consiste nella sintesi per «separazione e ri-mescolamento» (split-pool) (figura B19). La tecni-ca è basata sulla sintesi in fase solida, già utiliz-zata per la sintesi dei peptidi (cap. 4, p. 94). Icomposti vengono sintetizzati su piccoli granuliche recano un appropriato supporto molecolaredi riferimento (scaffold ), dove si faranno avveni-re le reazioni. I granuli vengono suddivisi in naliquote (fase «split»), dove n corrisponde al nu-mero dei reagenti che vengono fatti interagire colprimo sito specifico (tre nella figura B19, colo-rati in verde, blu e giallo). Una volta avvenute lereazioni di addizione al primo sito, i granuli ven-gono isolati per filtrazione su gel. Le n aliquotedi granuli vengono rimescolate (fase «pool»), edivise ancora in m aliquote, dove m corrispondeal numero dei reagenti che vengono fatti intera-

gire col secondo sito specifico (tre nella figuraB19, colorati in rosso, viola e arancione). Unavolta avvenute le reazioni di addizione al secon-do sito, i granuli vengono isolati per filtrazionesu gel. Anche se sono stati usati molti granuli,ciascuno di essi contiene un solo tipo di compo-sto. Per esempio, se si considerano i tre granulidel riquadro in basso a sinistra della figura B19,si può osservare che uno contiene solo il compo-sto rosso e blu, l’altro solo quello rosso e verde, eil terzo solo quello rosso e giallo. Inoltre, mentreil numero delle reazioni avvenute corrisponde an + m, quello dei composti sintetizzati sarà n ×m. Tornando ai valori di n e m per il caso di chi-mica combinatoria da noi prima ipotizzato, untotale di 20 + 40 = 60 reazioni produrrà un to-tale di 20 × 40 = 800 composti diversi. In alcu-ni casi si possono effettuare i saggi direttamentesui composti ancora legati al granulo, per trova-re quelli con le proprietà desiderate (figura B20).Alternativamente, ciascun granulo può essere iso-lato, il composto può essere staccato dal granu-lo, e ottenuto in forma libera per essere analizza-to. Una volta trovato un composto interessante,verranno utilizzati metodi analitici di vario tipo,per identificarlo nell’insieme degli n × m com-posti sintetizzati.

L’«universo» dei potenziali farmaci è moltovasto. In teoria sarebbe possibile sintetizzare piùdi 1040 composti con peso molecolare inferiorea 750. Quindi, anche se milioni di composti sonodisponibili nelle «ampie» librerie oggi esistenti,in realtà solo una minuscola frazione di tutti icomposti chimici possibili è disponibile per es-sere studiata.

Si possono progettare farmaci sulla basedelle informazioni disponibili sullastruttura tridimensionale dei loro bersaglimolecolari

Molti farmaci si legano ai loro bersagli moleco-lari con una modalità che ricorda il modello del-la chiave e serratura di Emil Fischer. Su questabase dovrebbe essere possibile progettare la chia-ve avendo sufficienti informazioni sulla forma esulla composizione chimica della serratura. In al-tri termini, in teoria dovrebbe essere possibile pro-gettare una piccola molecola, complementare performa e per struttura elettronica a una regione diuna proteina bersaglio, in modo che sia effetti-vamente in grado di legarvisi. Ma, nonostante siapossibile definire abbastanza rapidamente strut-ture tridimensionali, la realizzazione di un simi-le progetto non è ancora a portata di mano. È dif-ficile infatti progettare composti stabili, che ab-

Figura B20 Screening diuna libreria di carboi-drati di sintesiAl fine di identificare i car-boidrati che hanno la pro-prietà di legarsi saldamen-te alle lectine delle arachi-di, una piccola libreriacombinatoria di carboidratisintetizzati sulla superficiedi granuli del diametro di130 �m viene fatta reagirecon le lectine. I granulidove sono presenti carboi-drati in grado di legarsi allelectine assumono unacolorazione scura, dovutaall’azione di un enzimapreviamente fissato sullelectine stesse. [Fonte: R.Liang et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 94(1997):10544-10559; © 2004National Academy ofSciences, USA.]


biano la forma e le proprietà giuste per interagi-re correttamente e con precisione col sito di le-game di una proteina, perché è difficile predirequal è in realtà la struttura del composto che me-glio si adatta al sito. Predire l’affinità di legamerichiede che siano note in dettaglio non solo lepossibili interazioni tra il composto e il sito di le-game, ma anche quelle tra il composto e il sol-vente, una volta che il composto viene a trovarsilibero in soluzione.

Ciò nonostante, la progettazione basata su datistrutturali è risultata molto utile per lo sviluppodi nuovi farmaci. Un importante successo è sta-ta la sintesi dei farmaci che inibiscono la protea-si del virus HIV. Consideriamo in particolare l’i-nibitore denominato indinavir (Crixivan®; cap.9, p. 216). Erano già state scoperte due serie dicomposti che avevano elevata capacità inibitoria,ma bassa solubilità e biodisponibilità. L’analisicristallografica ai raggi X e la modellistica mole-colare avevano suggerito che una molecola ibri-da avrebbe dovuto possedere un’alta capacità ini-bitoria unita a una buona biodisponibilità (figu-ra B21). Una volta sintetizzata, la molecola in ef-fetti si dimostrò efficace, pur avendo bisogno diessere ottimizzata. I dati strutturali suggerivanoche esisteva una zona della molecola che avrebbepotuto tollerare modifiche strutturali. Fu allorasintetizzata tutta una serie di composti da esa-

minare (figura B22). Quelli più attivi presenta-vano però anche una bassa biodisponibilità, ec-cetto uno, che mostrò una accettabile biodispo-nibilità, unita a una buona attività inibitoria. Lamassima concentrazione sierica dopo sommini-strazione orale risultò significativamente più ele-vata dei livelli richiesti per inibire la moltiplica-zione virale. Questo farmaco, come pure altri ini-bitori della proteasi virale sintetizzati nello stes-so periodo, sono stati usati in combinazione conaltri farmaci per il trattamento dell’AIDS, con ri-sultati molto più incoraggianti rispetto quelli ot-tenuti in precedenza (figura B23).

Il bersaglio molecolare dell’aspirina, come giàdetto in precedenza, è il sito cicloossigenasico del-la prostaglandina H2 sintasi. Studi condotti su-

NHN

OHN O

H3CCH3

CH3

OH OH

NHN

O

N

HN O

H3C CH3

CH3

OH OHR

SO

N

R � IC50 (nmol)

0,4

0,01

0,3

0,6

log (P )

4,67

3,70

3,69

2,92

cmax (�M)

< 0,1

< 0,1

0,7

11

O

O

FF

N

O O

Figura B21 La primamolecola progettata perinibire la proteasi del-l’HIVLa molecola è stata proget-tata combinando la porzio-ne di un composto dotatadi buona attività inibitoriama bassa solubilità (por-zione della molecola mo-strata in rosso) e la porzio-ne di un altro compostodotato di buona solubilità(porzione della molecolamostrata in blu).

Figura B22 Ottimizzazione dei compostiPer i quattro composti mostrati in rosso sono stati determinati nel siero di cane i seguenti parametri: la IC50 (la concentrazione richiesta per ridurre la replicazio-ne dell’HIV fino al 50% del valore massimo raggiungibile), il log P, e la Cmax (la concentrazione massima raggiunta dal composto). Il composto mostrato in bas-so possiede il potere inibitorio minore (misurato come IC50), ma di gran lunga la migliore biodisponibilità (misurata come Cmax). Tale composto è stato sceltocome punto di partenza per la realizzazione di altri farmaci, fino alla produzione dell’indinavir (Crixivan®).


gli animali hanno evidenziato che i mammifericontengono non una, ma due distinte cicloossi-genasi. Ambedue fungono da bersaglio dell’aspi-rina. Ma l’enzima scoperto più di recente, la ci-cloossigenasi 2 (COX2), viene espresso soprat-tutto in risposta a un episodio infiammatorio,mentre l’espressione della cicloossigenasi 1(COX1) ha un carattere più generale. Perciò unipotetico inibitore specifico per la COX2 do-vrebbe essere in grado di ridurre l’infiammazio-ne che si riscontra in malattie come l’artrite, sen-za produrre gli effetti collaterali a livello gastrico,di cui è responsabile l’aspirina.

Le sequenze amminoacidiche della COX1 edella COX2, dedotte dai rispettivi cDNA, mo-strano una omologia di oltre il 60%, il che sug-gerisce che le due proteine enzimatiche hannouna struttura spaziale simile. Tuttavia sono statetrovate alcune differenze nella natura dei residuiche circondano il sito per l’aspirina. La cristallo-grafia a raggi X ha dimostrato che nella COX2 èpresente una estensione della tasca dove si posi-ziona l’aspirina, che non è presente nella COX1.Questa differenza strutturale tra i due enzimi hasuggerito una strategia per la sintesi di inibitori

specifici della COX2: la progettazione di com-posti dotati di una protuberanza che sia in gradodi posizionarsi esattamente nella tasca dellaCOX2, ma non in quella della COX1. Compo-sti con tali caratteristiche sono stati infatti pro-gettati, sintetizzati e, una volta perfezionati, sonodiventati farmaci di uso comune, come il Cele-brex® e il Vioxx® (figura B24). Il successo di que-sta tecnica innovativa ha dimostrato le grandi po-tenzialità della progettazione, basata sulle cono-scenze strutturali, di farmaci altamente specifici,in grado di riconoscere bersagli molecolari strut-turalmente correlati.

B3 L’ANALISI DEI GENOMIPROMETTE IMPORTANTISVILUPPI VERSO LA SCOPERTADI NUOVI FARMACI

Il sequenziamento dell’intero genoma umano edi altri genomi, portati a termine di recente, hamesso a disposizione dei ricercatori un mezzo po-tentissimo per la scoperta di nuovi farmaci. Il se-quenziamento del genoma umano di per sé, e an-che tutto il lavoro analitico a esso correlato, han-no aumentato considerevolmente le nostre co-noscenze sulle proteine codificate dal genomastesso. Si tratta di una nuova fonte di conoscen-ze, che permetterà di accelerare notevolmente iprimi stadi del processo di sviluppo dei farmaci,e perfino di disegnare farmaci a misura del sin-golo paziente.

È possibile identificare potenziali bersaglinel proteoma umano

Il genoma umano codifica approssimativamente23000 proteine, senza tener conto delle modifi-cazioni prodotte dagli splicing alternativi del-

CauseaccidentaliTumorimaligniMalattiecardiacheSuicidiInfezioneda HIVOmicidiMalattieepatichecronicheMalattiecerebro-vascolariDiabete

0

Dec

essi

per

100

000

abi

tant

i

45

10

5

20

15

25

30

35

40

200019901988 1998199619941992

NNF3C

CH3

SNH2

O O

SCH3

O O

O

O

Celecoxib (Celebrex®) Rofecoxib (Vioxx®)

Figura B23 Effetti dovutiall’introduzione dei far-maci anti-HIVLa diminuzione della morta-lità da infezione da HIV(AIDS), verificatasi subitodopo l’introduzione degliinibitori della proteasi del-l’HIV in combinazione congli inibitori della trascrittasiinversa, dimostra il fortissi-mo impatto che tali farmacihanno avuto sulla diffusionedell’AIDS. I grafici si riferisco-no alla mortalità dovuta allecause più frequenti tra isoggetti affetti da AIDS dietà compresa tra i 24 e i 44anni negli Stati Uniti. [Fonte:Centers for Disease Control.]

Figura B24 Inibitorispecifici della COX2I due composti presentanoprotuberanze (indicate inrosso), in grado di posizio-narsi esattamente nellatasca dell’isozima COX2,che nel contempo impedi-scono stericamente l’inte-razione con l’isozimaCOX1.


l’mRNA e delle modificazioni post-traduzionali.Molte di queste proteine, in particolare gli enzi-mi e i recettori, la cui attivazione o inibizione pro-duce effetti biologici significativi, potrebbero co-stituire altrettanti bersagli molecolari. Alcune fa-miglie di proteine a elevato peso molecolare sonouna ricca sorgente di bersagli molecolari. Peresempio, più di 500 proteine chinasi sono codi-ficate dal genoma umano. Ciascuna di esse puòessere riconosciuta e identificata, confrontandole diverse sequenze amminoacidiche dedotte dal-le sequenze nucleotidiche del genoma. È noto cheuna di queste proteine, la Bcr-Abl chinasi, è im-plicata nell’insorgenza della leucemia, ed è quin-di il bersaglio di un farmaco specifico, l’imatinibmesilato (Gleevec®; cap. 15, p. 382). Altre pro-teine chinasi svolgono un ruolo centrale in par-ticolari tipi di tumore. Ancora, il genoma uma-no codifica circa 800 recettori 7TM (cap. 15, p.363), dei quali circa 350 sono recettori olfattori.Molte altre proteine della stessa famiglia sono po-tenziali bersagli, o sono già state utilizzate comebersagli molecolari di alcuni farmaci. Per esem-pio, il recettore �-adrenergico è il bersaglio mo-lecolare del beta bloccante atenololo. Il recettoreH2 dell’istamina, che fa parte della famiglia deirecettori 7TM e partecipa al controllo della se-crezione acida gastrica, è il bersaglio molecolaredel farmaco antiulcera ranitidina (Zantac®).

Nuove proteine, che non fanno parte di quel-le famiglie proteiche che hanno già fornito ber-sagli molecolari, possono essere identificate an-cora più facilmente, utilizzando informazioni cheil genoma umano stesso può fornire. Si possonoseguire diverse vie per identificare le proteine chepotrebbero fungere da bersagli di potenziali far-maci. Una è quella di studiare, in cellule ottenu-te da organismi portatori di malattie, le variazio-ni strutturali che si verificano durante l’espres-sione e la localizzazione delle proteine, o duran-te le modificazioni post-traduzionali. Un’altra èquella di condurre studi su tessuti o cellule dovesono espressi geni particolari. L’analisi del geno-

O

NH2

O

NH

OHH

CH3

CH3

Atenololo

ma umano dovrebbe condurre a un aumento didue o tre volte del numero dei bersagli moleco-lari riconoscibili dai potenziali farmaci.

Si possono utilizzare modelli animali perverificare la validità dei potenziali bersaglimolecolari dei farmaci

Sono stati sequenziati i genomi di alcuni anima-li, frequentemente utilizzati come modelli speri-mentali. Il più importante ai fini dello sviluppodi nuovi farmaci è il genoma del topo, che per il70% è identico a quello dell’uomo. Inoltre, piùdel 98% dei geni umani hanno la loro contropartenel topo. Gli studi sul topo forniscono un potentemezzo di indagine per lo sviluppo di nuovi far-maci, che consiste nella possibilità di sopprimeregeni specifici («knockout genico») nel topo (cap.6, p. 148). Se la soppressione genica produce uneffetto interessante, allora il prodotto del gene co-stituirà un promettente bersaglio molecolare. L’u-tilità di un tale approccio è stato dimostrato re-trospettivamente. Per esempio, la soppressione delgene per la subunità � della H+-K+ ATPasi, unaproteina che svolge un ruolo primario nella se-crezione di acido cloridrico nello stomaco, dà ori-gine a topi che presentano una bassa concentra-zione di acido nello stomaco, corrispondente a unpH di 6,9, contro un pH di 3,2 dei topi control-lo. La subunità � della H+-K+ ATPasi è il bersa-glio dei farmaci omeprazolo (Prilosec®) e lanso-prazolo (Prevacid® e Takepron®), usati per il trat-tamento del riflusso gastro-esofageo.

Oggi vengono compiuti notevoli sforzi su lar-ga scala, intesi a produrre in laboratorio centinaia

N

HN

S

N

H3C O CH3

CH3

O

S

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N

HN

N

H3C O

CF3

Omeprazolo

Lansoprazolo

S

HN

NO2

HN

CH3ON

H3C

H3C

Ranitidina


o addirittura migliaia di ceppi murini, ciascunoportatore di una soppressione genica. L’analisi ditali fenotipi suggerisce se la proteina codificata dalgene soppresso è o no un promettente bersagliomolecolare. Questo tipo di approccio permette airicercatori che si occupano dello sviluppo di nuo-vi farmaci di valutare potenziali bersagli senza pre-vie nozioni sulle funzioni fisiologiche.

Nei genomi di organismi patogeni sipossono identificare potenziali bersagli

Le proteine umane non sono il solo importantebersaglio molecolare dei farmaci. Farmaci comela penicillina e gli inibitori della proteasi dell’HIVhanno come bersaglio le proteine degli agenti pa-togeni, anziché dell’uomo. Perciò le centinaia digenomi di organismi patogeni che sono stati se-quenziati fino a oggi costituiscono una minieradi potenziali bersagli.

Per combattere la moltiplicazione dei batteridiventati resistenti a un gran numero degli anti-biotici fino a oggi disponibili sono necessari nuo-vi antibiotici. Un approccio è quello di indivi-duare le proteine che risultano conservate nelmaggior numero possibile di batteri. I farmaci ingrado di inattivarle dovrebbero possedere attivitàantibiotica ad ampio spettro, quindi risultare uti-

li per il trattamento di infezioni provocate da ungran numero di batteri patogeni. Una di tali pro-teine è la deformilasi, un enzima che rimuove igruppi formilici presenti nella terminazione am-minica di proteine batteriche subito dopo il pro-cesso di traduzione (cap. 29, p. 759).

In alternativa potrebbe essere necessario pro-gettare un farmaco contro uno specifico agentepatogeno, per esempio contro la sindrome respi-ratoria acuta grave (SARS). Appena un mese dopoil riconoscimento di questa nuova sindrome a ca-rattere epidemico, è stato isolato il virus respon-sabile, e nel giro di settimane ne è stato comple-tamente sequenziato il genoma formato da 29751basi. La sequenza ha rivelato la presenza di ungene che codifica la proteasi virale, già noto per-ché è essenziale per la replicazione di altri mem-bri della famiglia dei coronavirus, a cui appar-tengono i virus della SARS. La ricerca in questosettore è oggi rivolta alla realizzazione di specifi-ci inibitori della proteasi (figura B25).

Le differenze genetiche influenzano lerisposte individuali ai farmaci

Molti farmaci non risultano efficaci in tutti i pa-zienti, spesso a causa di differenze genetiche in-dividuali. I soggetti che non rispondono a un far-maco possono presentare piccole differenze nel-la molecola bersaglio o nelle proteine che parte-cipano al trasporto e al metabolismo del farma-co. Il fine ultimo di discipline emergenti, comela farmacogenetica e la farmacogenomica, è di di-segnare farmaci in grado di agire in modo diffe-renziato da persona a persona o specificamenteadattabili ai particolari genotipi.

Figura B25 Un bersa-glio molecolare emer-genteLa figura mostra la strutturadella proteasi del coronavi-rus, l’agente patogenodella SARS (severe acuterespiratory sindrome, «sin-drome respiratoria acutagrave»), legata a un inibito-re. La struttura è stata risol-ta meno di un anno dopola scoperta del virus.

O

H3C O

H OH

NH

CH3

CH3H

Metaprololo


Farmaci come il metaprololo, il cui bersaglioè il recettore �1-adrenergico, sono oggi ampia-mente utilizzati per il trattamento dell’iperten-sione. Ma alcuni soggetti non rispondono ade-guatamente. Nella popolazione statunitense sonostate trovate due varianti del gene che codifica ilrecettore �1-adrenergico. L’allele più comune pre-senta una serina in posizione 49 e un’arginina inposizione 349. Però nel recettore di alcuni sog-getti la glicina sostituisce uno o l’altro dei due re-sidui. I soggetti che possiedono due copie del-l’allele più comune rispondono bene al meta-prololo: la loro pressione diastolica si riduce inmedia di circa 14,7 ± 2,9 mm Hg. Per contro, isoggetti che possiedono una delle due varianti al-leliche rispondono meno. Infine il farmaco nonha effetti significativi nei soggetti con due variantialleliche (figura B26). Queste osservazioni sug-geriscono l’utilità di conoscere i genotipi indivi-duali. Sarebbe così possibile predire se il tratta-mento con il metoprololo o altri �-bloccanti avrào non avrà effetto.

Vista l’importanza che l’ADME e la tossicitàhanno nella determinazione dell’efficacia dei far-maci, non sorprende che le variazioni struttura-li delle proteine coinvolte nel trasporto e nel me-tabolismo dei farmaci possano alterarne l’effetto.Un esempio importante è l’uso delle tiopurine,quali la 6-tioguanina, la 6-mercaptopurina e l’a-zatioprina, per il trattamento di patologie comela leucemia, i disordini immunitari e le sindromiinfiammatorie intestinali.

Le comuni dosi di questi farmaci, general-mente ben tollerate dalla grande maggioranza deipazienti, talvolta risultano tossiche per alcuni sog-getti. Tali differenze sono dovute a rare varianti

del gene che codifica la tiopurina metiltransfera-si, un enzima che metabolizza gli xenobiotici, eche catalizza l’aggiunta di un residuo metilico adatomi di zolfo.

La forma variante dell’enzima è meno stabi-le. I pazienti che ne sono portatori possono quin-di accumulare livelli abnormi dei farmaci se nonsi prendono opportune precauzioni. Quindi lavariabilità genetica di un enzima coinvolto nelmetabolismo dei farmaci gioca un ruolo impor-tante nel determinare il grado di tolleranza alleparticolari concentrazioni del farmaco. Molti al-tri enzimi coinvolti nel metabolismo dei farma-ci e altre proteine coinvolte nel trasporto dei far-maci sono state implicate nel controllo delle rea-zioni individuali a specifici farmaci. L’identifica-zione dei fattori genetici permetterà di capire me-glio perché alcuni farmaci risultino efficaci in al-cuni soggetti, e in altri invece abbiano scarso ef-fetto. È probabile che in futuro i medici, attra-verso l’esame del genotipo di ciascun paziente,potranno meglio programmare la terapia.

−4

−2

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−10

SR/SR SR/GR SR/SG GR/SG

0Figura B26 Correlazio-ne fenotipo-genotipoVariazioni medie dellapressione diastolica insoggetti trattati con meta-prololo. I soggetti con duecopie dell’allele più comu-ne (S49R389) rispondono almetaprololo con una dimi-nuzione significativa dellapressione. Quelli con unasola variante allelica (GR oSG) rispondono con unadiminuzione più modesta,e quelli con due variantialleliche (GR/SG) nonpresentavano alcuna dimi-nuzione. [Fonte: J. A. John-son et al., Clin. Pharmacol.Ther. 74(2003): 44-52.]

N N

HN

H2N

6-Tioguanina

N N

HN

NN

S

6-Mercaptopurina

N N

HN

N

SHSH

N

N

H3C

NO2

Azatioprina

N

N N

HN

SH

3C

+ S-adenosilmetionina + S-adenosilomocisteina + H+

Tiopurinametiltransferasi

N

N

N

H

N

SH

6-Mercaptopurina


B4 LO SVILUPPO DI NUOVI FARMACIPROCEDE ATTRAVERSO DIVERSISTADI

Negli Stati Uniti la FDA (Food and Drug Ad-ministration) richiede non solo che i potenzialifarmaci dimostrino la loro efficacia, ma ancheche non risultino dannosi per l’uomo, se som-ministrati su larga scala. Queste caratteristichesono particolarmente importanti per quei far-maci destinati a essere somministrati a soggettirelativamente sani. Un certo numero di effetticollaterali è invece tollerato per quei farmaci pro-gettati per il trattamento di malattie gravi, peresempio alcune gravi forme tumorali, quando èchiaro che il mancato trattamento avrebbe sfa-vorevoli conseguenze.

La sperimentazione clinica richiede tempilunghi e ha costi elevati

La sperimentazione clinica serve a saggiare l’effi-cacia del farmaco in esame, e a evidenziarne i pos-sibili effetti collaterali, prima che la FDA ne au-torizzi l’utilizzo in terapia. La sperimentazioneclinica procede attraverso almeno tre fasi (figuraB27). Nella fase 1 un modesto numero di vo-lontari sani (in genere da 10 a 100) assumono ilfarmaco per uno studio preliminare sulla sua even-tuale tossicità. Si somministrano dosi crescentidel farmaco, per monitorarne gli eventuali effet-ti tossici. Durante questa fase non viene specifi-camente valutato l’effetto terapeutico.

Nella fase 2 l’efficacia del farmaco in esameviene valutata su un piccolo campione di sogget-ti, che si pensa potrebbero trarne giovamento.Anche in questa fase si possono trarre ulteriorideduzioni sulla sua eventuale tossicità. La speri-mentazione clinica viene controllata, anche indoppio cieco. Nella normale procedura di con-trollo i soggetti in esame vengono divisi a caso indue gruppi. Ai soggetti appartenenti a un grup-po viene somministrato il farmaco in esame. Isoggetti del gruppo di controllo vengono invecetrattati o col placebo, cioè con una compressacontenente zucchero o qualche altro compostodi nessun valore intrinseco, oppure col farmaconelle condizioni standard migliori, se si pensa che

il non somministrare affatto il farmaco non siaeticamente accettabile. Nella sperimentazione indoppio cieco, né i soggetti in esame, né i ricer-catori sanno quali sono i soggetti che apparten-gono al gruppo dei trattati e quali al gruppo dicontrollo, e non vi è quindi alcuna possibilità cheessi vengano in qualche modo influenzati. Unavolta terminata la sperimentazione clinica, si apro-no le buste che identificano i soggetti sotto trat-tamento e i soggetti di controllo, e gli effetti suidue gruppi vengono messi a confronto. Spessonella fase 2 si somministrano dosi diverse del far-maco, per stabilire fino a che dose il farmaco nonprovoca effetti collaterali di rilievo, e quali dosirisultano efficaci terapeuticamente.

Non si deve trascurare l’effetto placebo, cioèla tendenza a percepire segni di miglioramentoda parte di soggetti che pensano di essere statisottoposti a un trattamento terapeutico poten-zialmente efficace. In uno studio di chirurgia ar-troscopica per alleviare il dolore al ginocchio, isoggetti ai quali era stato fatto credere di esserestati sottoposti a trattamento chirurgico, trami-te l’uso di videocassette o con altri mezzi, hannoriferito lo stesso grado di miglioramento dei sog-getti effettivamente operati.

Nella fase 3, la stessa sperimentazione clinicaviene effettuata su larga scala. Il fine è quello distabilire in modo definitivo l’efficacia del farma-co in esame, e di determinare gli effetti collate-rali che si evidenziano in bassa percentuale neisoggetti trattati. Migliaia di soggetti possono par-tecipare a una tipica fase 3.

La sperimentazione clinica è estremamentecostosa. Si devono reclutare centinaia o migliaiadi pazienti, che dovranno essere monitorati du-rante tutto il periodo della sperimentazione. Me-dici, infermieri, farmacologi clinici, statistici e ri-cercatori con diverse competenze partecipano allaprogettazione e all’esecuzione dei test. I costi van-no da alcune decine ad alcune centinaia di mi-lioni di euro. Tutte le osservazioni fatte vanno ac-curatamente registrate, anche quelle che riguar-dano le reazioni indesiderate. I dati vengono rac-colti e sottomessi al giudizio della FDA. La rea-lizzazione di un farmaco, dalla progettazione finoalla commercializzazione, ha un costo comples-sivo che oscilla tra i 400 e gli 800 milioni di euro.

Fase 1 Fase 2 Fase 3

Sicurezza SicurezzaEfficaciaDosaggio

Sicurezza Efficacia

Effetti collaterali

Scoperta preclinicadel farmaco

Usoclinico

Figura B27 Le fasi dellasperimentazione clinicaLa sperimentazione clinicaprocede attraverso tre fasiche verificano la sicurezzae l’efficacia di un farmacoin gruppi di soggetti sem-pre più numerosi.


Ma, anche dopo che il farmaco è stato ap-provato e diventato di uso comune, possono in-sorgere ulteriori difficoltà. Per esempio, il rofe-coxib (Vioxx®) è stato ritirato dal commercio aseguito di evidenti effetti collaterali a livello car-diaco emersi durante ulteriori prove cliniche.

L’insorgenza della resistenza può limitarel’utilità dei farmaci contro le malattieinfettive e il cancro

Molti farmaci possono essere assunti per lunghiperiodi di tempo, senza che perdano la loro effi-cacia. Però in alcuni casi, come per le malattie in-fettive e il cancro, il trattamento terapeutico, ini-zialmente efficace, col tempo diventa sempremeno efficiente. In altre parole, la malattia di-venta resistente al trattamento farmacologico.Qual è l’origine del fenomeno? Le malattie in-fettive e il cancro hanno una caratteristica in co-mune: i soggetti colpiti contengono molte cellu-le (o virus), che possono mutare e riprodursi. Dalpunto di vista biologico tali caratteristiche sononecessarie ai fini evolutivi. Quindi una singolacellula batterica o una singola cellula cancerosapuò casualmente andare incontro a una varia-zione genetica che la rende più adatta a cresceree a riprodursi, anche in presenza del farmaco. Talitipi di cellule tendono quindi a prendere il so-pravvento su tutte le altre. Man mano che la pres-sione selettiva esercitata dalla somministrazionedel farmaco procede, la popolazione di cellulebatteriche o cancerose resistenti cresce sempre dipiù rispetto a tutte le altre. La resistenza può in-staurarsi attraverso meccanismi diversi.

Gli inibitori della proteasi dell’HIV discussiin precedenza sono un esempio importante cheillustra il meccanismo di insorgenza della resi-stenza ai farmaci. I retrovirus vanno facilmenteincontro al fenomeno della resistenza, perché laloro trascrittasi inversa, che catalizza la replica-zione dell’RNA virale, non possiede il meccani-smo della «correzione delle bozze». In un geno-ma di 9750 basi, come è quello del virus HIV,una mutazione puntiforme può avvenire più di

1000 volte al giorno in un soggetto infetto. Pos-sono avvenire anche diverse mutazioni multiple.Molte di tali mutazioni non hanno effetto, o pos-sono risultare dannose per il virus. Però alcuneparticelle virali mutanti codificano proteasi cherisultano meno suscettibili all’inibizione da par-te del farmaco. Quindi, in presenza di un inibi-tore della proteasi dell’HIV questi virus tendonoa replicarsi meglio della restante popolazione vi-rale. Col passare del tempo i virus mutanti di-ventano dominanti, fino a che tutta la popola-zione virale diventa resistente.

I microrganismi patogeni possono diventareresistenti agli antibiotici attraverso meccanismitotalmente differenti. Alcuni di essi possiedonoenzimi che inattivano o degradano specificamentecerti antibiotici. Per esempio, molti microrgani-smi sono resistenti ai derivati �-lattamici, comela penicillina, perché contengono enzimi che idro-lizzano l’anello �-lattamico (vedi sotto). Idroliz-zando tale anello, questi enzimi rendono inatti-vi i farmaci che lo contengono.

Molti di questi enzimi sono codificati dai pla-smidi, piccoli frammenti di DNA circolare, spes-so trasportati dai batteri. Molti plasmidi si tra-sferiscono facilmente da una cellula batterica al-l’altra, contribuendo così al trasferimento dellaresistenza agli antibiotici. Il trasferimento dei pla-smidi è uno dei principali fattori responsabili del-la diffusione della resistenza agli antibiotici, an-cora oggi una delle sfide più difficili che la me-dicina moderna si trova a dover affrontare. D’al-tro canto, i plasmidi vengono ampiamente uti-lizzati in laboratorio, nella tecnologia del DNAricombinante (cap. 6, p. 139).

La resistenza ai farmaci insorge comunemen-te nel corso del trattamento dei tumori. Le cel-lule cancerose sono caratterizzate dalla capacitàdi crescere rapidamente, avendo perso alcuni mec-canismi inibitori propri delle cellule normali.Molti dei farmaci usati in chemioterapia inibi-scono i processi responsabili della rapida cresci-ta cellulare. Però ogni singola cellula cancerosapuò accumulare mutazioni genetiche, che miti-gano l’effetto dei chemioterapici. Tali cellule mu-

N

HN

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CH3

CH3

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+ H2O�-Lattamasi

Penicillina

HN

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CH3

CH3

COO�OH

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tate tenderanno a crescere più rapidamente del-le altre, fino a diventare dominanti. La tendenzadelle cellule cancerose a mutare rapidamente co-stituisce uno dei maggiori ostacoli a una delle piùimportanti scoperte nel campo della terapia deitumori: l’uso di inibitori di proteine specifichedelle cellule tumorali, presenti in certi tipi di leu-cemia (cap. 15, p. 381). Per esempio, nei pazientitrattati con imatinib mesilato, un farmaco inibi-tore della proteina chinasi Bcr-Abl, si osserva re-gressione del tumore. Sfortunatamente, però,dopo alcuni anni il tumore ricompare in moltidei pazienti trattati. Nella maggior parte dei casisi osserva che alcune mutazioni hanno condottoalla sintesi di una proteina Bcr-Abl alterata, non

più suscettibile all’inibizione da parte delle con-centrazioni di imatinib mesilato usate in terapia.

Nel corso del trattamento chemioterapico ipazienti affetti da tumore assumono spesso piùfarmaci contemporaneamente, e in molti casi lecellule cancerose diventano resistenti a molti diessi o a tutti. La resistenza multipla ai farmaci puòessere dovuta alla proliferazione di cellule che so-vraesprimono un certo numero di proteine ABC,che pompano i farmaci fuori della cellula (cap.13, p. 320). Quindi le cellule cancerose possonodiventare resistenti ai farmaci, o perché sovrae-sprimono proteine umane normali, o perché mo-dificano proteine proprie di uno specifico feno-tipo tumorale.

RIEPILOGO

B1 Lo sviluppo di nuovi farmaci comporta la risoluzione diproblemi assai complessi

La maggior parte dei farmaci agisce legandosi a enzimi o a recetto-ri, modulandone l’attività. Per esercitare la loro azione, essi devonolegarsi ai loro bersagli molecolari con elevata affinità e specificità.Tuttavia molti composti, pur possedendo queste caratteristiche, nonpossono essere utilizzati come farmaci, perché vengono male assor-biti, o rapidamente escreti, o modificati attraverso vie metabolichedeputate alla modifica delle sostanze estranee. In conseguenza, sevengono assunti oralmente, questi composti non si legano ai lorobersagli molecolari nelle concentrazioni desiderate per un periododi tempo sufficiente. Le proprietà di assorbimento, distribuzione,metabolismo ed escrezione di un farmaco vengono collettivamen-te indicate con l’acronimo ADME. La biodisponibilità orale è unamisura della capacità di un farmaco di essere assorbito; più preci-samente è il rapporto tra la concentrazione massima raggiunta dauna determinata dose di composto somministrato oralmente e laconcentrazione massima raggiunta dalla stessa dose del compostosomministrato parenteralmente. La struttura di un composto puòinfluenzare la sua biodisponibilità in vari e complessi modi, tutta-via le regole di Lipinski forniscono alcuni criteri di generale utilità.Il metabolismo dei farmaci include la loro ossidazione, catalizzatadal complesso del citocromo P450 (fase I) e la loro coniugazionecol glutatione, l’acido glucuronico, e il solfato (fase II). Un com-posto può non risultare utile terapeuticamente perché risulta tossi-co. La sua tossicità può dipendere da una eccessiva modulazione delbersaglio o dal fatto che si lega anche a proteine diverse da quellebersaglio. Il fegato e i reni giocano un ruolo centrale nel metaboli-smo e nell’escrezione dei farmaci.

B2 Si possono scoprire potenziali farmaci per serendipità(osservazione fortuita), screening o progettazione

Molti farmaci sono stati scoperti per serendipità. La scoperta dellapenicillina risultò da una osservazione fortuita. Una muffa in gra-do di sintetizzare l’antibiotico, che per accidente aveva contamina-to una coltura batterica, provocò la lisi dei batteri con cui era ve-

nuta a contatto. Farmaci come la clorpromazina e il sildenafil fu-rono scoperti perché mostrarono effetti sull’uomo completamentediversi da quelli attesi. La capacità delle statine di diminuire il tas-so di colesterolo è stata riconosciuta a seguito dello screening di ungran numero di composti che si pensava avessero effetti diversi. Letecniche della chimica combinatoria sono state messe a punto perrealizzare ampie collezioni di composti chimicamente correlati, mapur sempre diversi, da essere sottoposti a screening. In alcuni casi,quando è disponibile la struttura tridimensionale del bersaglio delfarmaco, si possono progettare inibitori potenti e specifici. Per esem-pio, l’indinavir, un inibitore della proteasi dell’HIV, e il celecoxib,un inibitore della cicloossigenasi 2, sono stati progettati secondoquest’ultimo criterio.

B3 L’analisi del genoma promette importanti sviluppi verso lascoperta di nuovi farmaci

Il genoma umano codifica approssimativamente 23000 proteine;in realtà sono molte di più, se si tiene conto anche di quelle sinte-tizzate a seguito dello splicing alternativo dell’mRNA e delle mo-difiche post-traduzionali. Le sequenze geniche possono essere con-siderate esse stesse potenziali bersagli dei farmaci. Numerose fami-glie di proteine, come le proteina chinasi e i recettori 7TM, cheprendono parte in processi fisiologici importanti, costituiscono ilbersaglio molecolare per altrettanti farmaci di ampio uso. Ma an-che i genomi di organismi modello sono utili per lo sviluppo dinuovi farmaci. Ceppi murini portatori di geni soppressi sono ri-sultati utili per individuare i bersagli dei farmaci. I genomi dei bat-teri, dei virus e dei parassiti codificano molte proteine che costi-tuiscono potenziali bersagli molecolari, e che possono essere uti-lizzate sia perché svolgono importanti funzioni, sia perché differi-scono dalle proteine umane. I possibili effetti collaterali sono cosìminimizzati. Si possono esaminare le differenze genetiche tra indi-viduo e individuo, per metterle in relazione con le differenti rispo-ste ai farmaci. Il che può essere di aiuto sia alla pratica clinica, siaallo sviluppo dei farmaci.


B4 Lo sviluppo di nuovi farmaci procede attraverso diversistadi

Prima che un composto possa essere somministrato all’uomo sottoforma di farmaco, deve essere sottoposto a numerosi test clinici, chene stabiliscano la sicurezza e l’efficacia. La sperimentazione clinicaviene effettuata in diversi stadi, prima per accertare soltanto la si-curezza del farmaco, poi la sicurezza e l’efficacia su un piccolo grup-po di soggetti, e infine la sicurezza e l’efficacia su un vasto gruppodi soggetti, al fine di evidenziare eventuali rari effetti collaterali in-

desiderati. A causa dell’elevato costo dei test clinici, la spesa globa-le per la messa in commercio di un nuovo farmaco si aggira intor-no a 800 milioni di euro. Ma possono sopravvenire complicazioni,anche dopo che un farmaco è stato approvato per essere comercia-lizzato. I pazienti affetti da malattie infettive e i pazienti portatoridi tumori, dopo un certo periodo di trattamento sviluppano spes-so il fenomeno della resistenza, perché anche in presenza dei far-maci compaiono e si moltiplicano varianti dell’agente patogeno cherisultano meno suscettibili ai farmaci stessi.

PAROLE CHIAVE

ADME (p. 23)ateroma (p. 32)barriera emato-encefalica (p. 25)biodisponibilità orale (p. 24)chimica combinatoria (p. 34)circolo entero-epatico (p. 27)compartimenti (p. 24)composti xenobiotici (p. 25)coniugazione (p. 25)costante di dissociazione, Kd (p. 22)

costante di dissociazione apparente, Kdapp

(p. 23)costante di inibizione, Ki (p. 23)effetti collaterali (p. 23)glomerulo (p. 27)indice terapeutico (p. 28)ligando (p. 22)metabolismo dei farmaci (p. 25)miopatia (p. 32)ossidazione (p. 25)

progettazione dei farmaci basata su datistrutturali (p. 35)

regole di Lipinski (p. 24)screening ad altissimo rendimento (p. 34)sintesi per «separazione e rimescolamento»

(p. 34)trasformazioni di fase I (p. 27)trasformazioni di fase II (p. 27)trasformazione metabolica primaria (p.

27)

LETTURE CONSIGLIATE

Libri

Hardman, J. G., Limbird, L. E., Gilman, A. G., 2001. Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics (X ed.). McGraw-HillProfessional.

Levine, R. R., Walsh, C. T., 2004. Levine’s Pharmacology: Drug Actions andReactions (VII ed.). Taylor and Francis Group.

Silverman, R. B., 2004. Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action.Academic Press.

ADME e tossicità

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Lee, W., Kim, R. B., 2004. Transporters and renal drug elimination. Annu.Rev. Pharmacol. Toxicol. 44:137-166.

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Progettazione dei farmaci basata sulla struttura

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Dorsey, B. D., Levin, R. B., McDaniel, S. L., Vacca, J. P., Guare, J. P., Darke,P. L., Zugay, J. A., Emini, E. A., Schleif, W. A., Quintero, J. C., et al.,1994. L-735,524: The design of a potent and orally bioavailable HIVprotease inhibitor. J. Med. Chem. 37:3443-3451.

Chen, Z., Li, Y., Chen, E., Hall, D. L., Darke, P. L., Culberson, C., Shafer,J. A., Kuo, L. C., 1994. Crystal structure at 1.9-Å resolution of humanimmunodeficiency virus (HIV) II protease complexed with L-735,524,an orally bioavailable inhibitor of the HIV proteases. J. Biol. Chem.269:26344-26348.

Chimica combinatoria

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Genomica

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Weinshilboum, R., Wang, L., 2004. Pharmacogenomics: Bench to bedside.Nat. Rev. Drug Discov. 3:739-748.


PROBLEMI

1. Vie che conducono alla scoperta di nuovi farmaci. Per ciascunodei farmaci elencati, dite se gli effetti fisiologici di ciascuno di essisono stati riconosciuti prima o dopo l’identificazione del bersagliomolecolare. (a) Penicillina; (b) sildenafil (Viagra®); (c) rofecoxib(Vioxx®); (d) atorvastatina (Lipitor®); (e) acido acetilsalicilico(aspirina); (f ) indinavir (Crixivan®).

2. Regole di Lipinski. Quale dei seguenti composti soddisfa le re-gole di Lipinski? [In parentesi i valori di log(P).] (a) Atenololo (0,23);(b) sildenafil (3,18); (c) indinavir (2,78).

3. Calcolo dei log(P). Sono stati effettuati molti tentativi per rea-lizzare programmi computerizzati, in grado di predire i valori dilog(P ) interamente sulla base dell’esame delle strutture chimiche.Quale potrebbe essere l’utilità di tali programmi?

4. Un’oncia di prevenzione. Una proposta di legge prevede l’in-clusione della N-acetilcisteina nelle compresse di acetominofene.Discutete il possibile ruolo funzionale dell’additivo.

5. Interazione tra farmaci. Come discusso nel capitolo specifico,il coumadin può risultare dannoso, perché spesso provoca emorra-gie incontrollate. I soggetti che lo assumono devono quindi presta-re particolare attenzione quando assumono anche altri farmaci, inparticolare quelli che si legano all’albumina. Proponete un mecca-nismo per tale tipo di interazione tra farmaci.

6. Come individuare il bersaglio. I tripanosomi sono parassiti uni-cellulari, che causano la malattia del sonno. Durante uno degli sta-di del loro ciclo cellulare, essi dimorano nel torrente circolatoriodell’uomo, e soddisfano tutto il loro fabbisogno energetico trami-te la glicolisi, che avviene all’interno di organelli specializzati en-docellulari, denominati glicosomi. Proponete un possibile bersaglioper il trattamento della malattia del sonno. Quali sono le potenzialidifficoltà da superare?

Problema sui meccanismi

7. Variazioni sul tema. Il metabolismo dell’anfetamina, di cui sonoresponsabili gli enzimi del sistema del citocromo P450, risulta nel-la trasformazione indicata qui sotto. Proponete un meccanismo eindicate altri eventuali prodotti.

Problema sull’interpretazione dei dati

8. Progettazione di inibitori della proteasi dell’HIV. Il composto Aappartiene a un gruppo di composti progettati per agire da poten-ti inibitori della proteasi dell’HIV.

CH3

NH2

H

CH3

O

Anfetamina

Il composto A è stato sperimentato utilizzando due diversi saggi:(1) determinazione in vitro del grado di inibizione della proteasidell’HIV e (2) inibizione della sintesi dell’RNA virale in cellule in-fettate dall’HIV, una misura della replicazione virale. I risultati ven-gono mostrati nelle due tabelle. L’attività della proteasi dell’HIV èstata misurata a una concentrazione del peptide substrato pari allaKM dell’enzima.

Composto A (nM) Attività della proteasi dell’HIV (unità arbitrarie)

0 11,20,2 9,90,4 7,40,6 5,60,8 4,81 4,02 2,2

10 0,9100 0,2

Composto A (�M) Sintesi dell’RNA virale (unità arbitrarie)

0 7601,0 7402,0 3803,0 2804,0 1805,0 100

10 3050 20

Calcolate i valori delle KI per il composto A nel saggio di atti-vità proteasica e il valore del suo IC50 nel saggio di inibizione dellasintesi dell’RNA virale.

Trattando i ratti con una dose relativamente alta del composto A(20 mg kg–1), si raggiunge una concentrazione massima pari a 0,4�M. Sulla base di questo dato, vi aspettate che il composto A sia ingrado di prevenire la replicazione dell’HIV, se assunto oralmente?

Composto A

HO OH

O

N N

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