L’interazione gene-ambiente nello studio dei microinquinanti ambientali

Paola Silingardi

Convegno sul tema:

BIOSENSORI E BIOMARCATORI NELLA VALUTAZIONE DEL RISCHIO AMBIENTALE E SANITARIO ASSOCIATO AI SUOLI CONTAMINATI

Ferrara, 24 Settembre 2009

Per studiare interazioni gene-ambienteSi utilizzano tecnologie che trovano le loro basi nel sequenziamento del genoma umano/altri organismi

Studiano il comportamento di tutto il genoma in un singolo esperimento

Integrano competenze di scienze biologiche, informatica ed ingegneria

TECNOLOGIE OMICHE

Spazi omici

• Tutti i geni di una cellula o di un tessuto

• Profilo metabolico

1%-2% del nostro DNA è funzionalmente attivo

mRNA

TrascrittomicaL’analisi dei profili trascrizionali è lo spazio omico piu’studiato ed attualmente anche il piu’ promettente per

l’individuazione di biomarcatori da utilizzare nello screening dei cancerogeni e nel monitoraggio ambientale

mRNA si può copiare/amplificareDiverse tecnologie per depositare su supporto solido le

sequenze che riconoscono l’mRNA di un gene (collezioni miniaurizzate)

Avanzamento della microscopia in fluorescenzaSviluppo di sistemi di analisi statistica ed interpretazione

biologica dei dati

Perchè?

Modelli cellulari

• Mammella• Polmone• Colon PBMC• Fegato• Cervello

BALB/c 3T3

V. fisheri

Umani

Murini

Batterici

Analisi trascrizionale:MICROARRAY

Esposizione della cellula al composto in esame

Estrazione RNA

Retrotrascrizione e marcatura con sonde fluorescenti

Ibridizzo su supporto solido contente le informazione per migliaia di geni

ANALISI della VARIAZIONEdi ATTIVITA’ GENICA

CTP-Cianina

• La cianine presentano una struttura data da 2 indocianineeterocicliche unite da un ponte polimetinico: Cy 5 e Cy3 differiscono per la struttura di questo ponte. • Cy3 è molto più fotostabili di altri marcatori fluorescenti.

• Cy3 dà un forte segnale fluorescente e possono sopportare le temperature e le condizioni normalmente presentiin laboratorio.

Supporto solido = slide da microarrayMigliaia di geni spottati (probes) su un unico supporto (slide o chip)

• Un laser SHG-YAG (532nm) e un laser a Elio-neon (633nm), per eccitare i fluorocromi Cy3 e Cy5.• Carosello a 48 posizioni• Sistema distintivo di continua messa a fuoco automatica dei laser sul piano esatto del campione durante la scansione • Software di Feature Extraction: calcolo della intensità dei segnali nel canale del verde associando, ad ogni valore, un errore

Piattaforma Agilent

LABORATORIO MATER – ARPA Bologna

OO3: 5µg/m 3

MIAME

guidelines by the Microarray Gene Expression Data Society

• La conformità alle linee guida MIAME può essere verificata riportando i dati di microarray in data-base MIAME compatibili ( es. Array Express, EuropeanBioinformatic Institute, Cambridge).• La maggior parte delle riviste scientifiche richiede il soddisfacimento delle linee guida MIAME

CARATTERIZZAZIONE TOSSICOLOGICA DI MATRICI

AMBIENTALI CONTAMINATE DA PCB

PROGETTO ARCADEIDENTIFICAZIONE DEI RISCHI PER LA SALUTE UMANA

CORRELATI ALL’ESPOSIZIONE A MISCELE COMPLESSE AD ATTIVITÀ PSEUDO-ORMONALE IN MATRICI AMBIENTALI E

ALIMENTARI

Progetto finanziato da Fondazione del Monte di

Bologna e Ravenna

CONTAMINAZIONI DA PCB• Trasferimento per le vie d’acqua e per via aerea

dai punti di immissione nell’ambiente• Bioaccumulo e alla biomagnificazione nella

fauna selvatica • Arricchimento per selezione nella rete trofica dei

congeneri con metabolismo più lentoAllontanamento dei profili

analitici rilevabili nei sedimenti e nella fauna selvatica da quelli

caratteristici di specifici Aroclor

Stima dell’attivitàbiologica totale del campione prelevato

da un sito contaminato

CAMPIONI: SITO DI CREVALCORE• Il Canale Collettore Acque Basse è individuato nel reticolo idrografico provinciale come canale di bonifica utilizzato a fini irrigui: le sue acque sono inoltre da sempre utilizzate anche per pesca.

• Nasce da Sud- Ovest in prossimità della Località Le Budrie di San Giovanni in Persiceto e termina il proprio corso confluendo nel Panaroin Comune di Finale Emilia (MO).

• In Comune di Crevalcore il canale attraversa l’area su cuiinsiste lo stabilimento dell’ex zuccherificio dividendone il corpo centrale di produzione daquelle che un tempo erano le vasche di trattamento delle acque produttive, oggi area diriequilibrio ecologico. Dr.ssa Biagi, ARPA-ER

18 Luglio 2002 : Episodio di contaminazione

I segnalanti: Corpo Provinciale delle Guardie Ecologiche Volontarie (GEV) di Bologna

Oggetto della segnalazione: presenza di morchie oleose nel Canale Collettore Acque Basse

Intervento ARPA: verifica la presenza di oli minerali in superficie e lungo lesponde del canale in un tratto di circa 100 metri a valle del punto d'immissione di un condotto fognario proveniente dall’ex Zuccherificio in cui erano in atto operazioni di dismissione impianti e vasche contenenti oli minerali.

Misure di contenimento di emergenza: aspirazione e assorbimento degli oliisul canale e sul condotto dello stabilimento; chiusura con cemento del condotto fognario dello Zuccherificio.

Ordinanza Sindacale di divieto d’uso irriguo e pesca sul canaleNei giorni successivi nonostante i tempestivi ed accurati interventi di aspirazione ed assorbimento degli idrocarburi, il canale presenta un costante e marcato affioramento di oli dai sedimenti; la movimentazione del fondo del canale con benna lascia intravedere sotto uno strato di sedimento di colorazione normale, un ulteriore strato melmoso di intensa colorazione nera e di consistenza oleosa.

Dr.ssa Biagi, ARPA-ER

Procedura di sito contaminato

18/07/2002: episodio di 18/07/2002: episodio di sversamentosversamento , interventi di emergenza, interventi di emergenza

Agosto/settembre 2002 : caratterizzazione interna allo zuccherifAgosto/settembre 2002 : caratterizzazione interna allo zuccherificio e del canaleicio e del canale

Settembre 2002: dichiarazione di sito contaminatoSettembre 2002: dichiarazione di sito contaminato per l’area dello per l’area dello stabilimento ex zuccherificio e per area canalestabilimento ex zuccherificio e per area canale

Novembre 2003 :indagine integrativa di caratterizzazione Novembre 2003 :indagine integrativa di caratterizzazione Giugno 2004:approvazione del progetto di bonifica/messa in sicuGiugno 2004:approvazione del progetto di bonifica/messa in sicurezzarezza

Agosto/ottobre 2006: intervento di bonifica/messa in sicurezza Agosto/ottobre 2006: intervento di bonifica/messa in sicurezza con con asportazione dei sedimenti nel tratto di canale interessato dallasportazione dei sedimenti nel tratto di canale interessato dalla a contaminazionecontaminazione

Novembre 2006 marzo 2007: controllo post bonifica/messa in sicurNovembre 2006 marzo 2007: controllo post bonifica/messa in sicurezza ezza e relazione finale Arpa e relazione finale Arpa

Giugno 2008 chiusura procedimento e ritiro Ordinanze di divieto Giugno 2008 chiusura procedimento e ritiro Ordinanze di divieto d’uso irriguo e ricreativo del canaled’uso irriguo e ricreativo del canale

Dr.ssa Biagi, ARPA-ER

Caratterizzazione sedimenti 100m a valle

0

10

20

30

40

50

28 52 95 101 99 110 151 149 118 146 153 105 138 187 183 177 180 170

SEDIMENTO CR

PCB totali campioni:

• valle centro 92.1ppb

• valle bordo 194.6 ppb

(Limiti PCB: 0.06 mg/kg, DL 152/2006)

Pentaclorobifenili Esaclorobifenili Eptaclorobifenili

OBIETTIVIApplicazione della tecnologia microarray per la

verifica delle modulazioni dei profili espressione genica dopo esposizione

Identificazione di biomarker di esposizione

Confrontare i profili di espressione delle miscele ambientale con quelli di Arochlor 1260

Comprensione dei meccanismi di azione a livello molecolare di sostanze o miscele complesse di origine ambientale

MODELLO BALB/c 3T3• Linea di fibroblasti murini

• Utilizzato lo studio della trasformazione in vitro di:cancerogeni chimici

cancerogeni fisici

promoventi (cancerogeni non mutageni con dose soglia stimabile)

Concordanza con il test nell’animale (IARC/NCI/EPA Working Group 1989, 1993, OECD Working Group 2006)

Metodo per la determinazione della tossicità e degli altri effetti sulla salute riportato tra i metodi di prova del regolamento REACH

Il protocollo sperimentale è attualmente sottoposto a uno studio di validazione coordinato dall’ECVAM

MICROARRAY: disegno sperimentale• Trattamenti (4 ore):

– A1260 (2-20-200 ppb)

– SEDIMENTI CrevalcoreTrattamenti microarray unendo i campioni valle centro e bordo : 170 ppbe 35 ppb

– Reference: DMSO

• Slide Agilent mouse whole genome 44K

• Single Colour hybridisation (Cy3)

• Analisi statistica con GENESPRING

Arochlor 1260Analisi statistica: T test

– 2-20-200 ppb vs DMSO– P VALUE < 0.05– FOLD CHANGE > 1.5

A1260

345

UP

284

DOWN

61

→

→

Estratti da sedimentiCrevalcore

Analisi statistica: T test – 2 dosi per ciascun sedimento vs DMSO– P VALUE < 0.05– FOLD CHANGE > 1.5

Crevalcore

814

UP

556

DOWN

256

→

→

Crevalcore

814

A1260

345

U

63 geni con lo stesso trend di modulazione: candidati per definire l’esposizione a PCB

282 63 751

Intersezione Arochlor 1260/ sedimenti Crevalcore

La trascrittomica

preparano la loro “rivoluzione”e noi stiamo partecipando

TossicologiaTossicologia EcotossicologiaEcotossicologia

Annamaria ColacciMonica VaccariPaola SilingardiMaria Grazia MascoloElena MorandiStefania PerdichizziFrancesca Rotondo

CTR CANCEROGENESI AMBIENTALE

e VALUTAZIONE DEL RISCHIO