Lezione 17 - 18mercoledì 27 aprile 2011

corso vettori biologici IIBiotec industrialiore 14:00 -16:00 aula 6A

Clonaggio in plasmidi dedicati con prodotti PCR

con TAQ polymerase w.t. si hanno aggiunte di A terminali spuriTAQ proof reading o altri producono ampliconi “blunt ends”Secondo che enzima si usa, si sceglie un plasmide adeguato.

Esistono in vendita: - plasmidi gia’ linearizzati con coda di T terminale per facilitare la ligasi tra l’amplicone ed il plasmide - plasmidi con topoisomerasi coniugata all’estremita’ del plasmide che attacca direttamente l’amplicone senza bisogno di ligasi

Clonaggio dei prodotti PCR

cerchiamo delle estremità ad un frammento di PCR intersperso all’interno

di una sequenza ignota:

- se ho trovato da Southern un frammento di DNA a sequenza ignota (però conosco la sonda),- una inserzione di un frammento noto in un genoma,- un vettore che si è integrato in una regione ignota, - un virus integrato non sito specifico, - una ricerca “gene trapping”, - la ricerca delle estremità genomiche di un gene noto solo come cDNA

la soluzione è la PCR inversaSi ha un ancoraggio sulla sequenza nota e nient’altro

Si deve amplificare in maniera inversa rispetto ad una PCR normale

Quale stratagemma si usa?

Circolarizzare un frammento dopo analisi di restrizione per Southern utilizzando la sequenza nota come sonda

Il templato può essere un frammento proveniente da una delle possibili analisi precedenti

analisi Southern del frgm

deve essere scelto il frammento da amplificare

sequenza genomica o di Bac o da cui si vuole recuperare la sequenza nota inserita o integrata

digestione con enzimi di restrizione

verde : no buonobleu : no buonogiallo: no buonoviola: troppo lungomarrò: buonorosso: buonogrigio + viola: buono

- tra due buoni si sceglie quello con estremità coesive per la ligasi più efficiente- si evita l’enzima che taglia all’interno del frgm, si otterrebe solo una estremità (diversa strategia)

grigio + viola se dx troppo lungo, estremità compatibili

dopo l’analisi Southern

Dopo l’individuazione del frammento di ampiezza conveniente

- digestione del DNA con l’enzima prescelto- arricchimento del frammento con corsa su gel (opzionale)- ligasi - PCR con primers divergenti - eventualmente seconda PCR con primers “nested” ancora più esterni ai primi, ma interni al frgm lineare

- una PCR produce sempre frgm lineari !!!!

PCR inversaIl nome deriva dal fatto che si usano primers disegnati su una sequenza con direzione divergente, direzione di sequenza dei primers apparentemente non convergente. Analisi Southern

Frammento di DNA

Ligasi per circolarizzare il frammento

A B c dSequenza nota (primers divergenti)

si amplifica il frammento circolarenella regione ignota

BA

Sequenza nota

primers divergentiC D

seq ignote seq ignote

amplificazione di DNA genomico o clonato

al primo ciclo cosa si amplifica ?

la Taq polimerase si ferma sull’amplicone ?

termini dell’amplicone

primer frw la taq polimerasi non ha ostacoli e non si ferma

allora ? perchè si amplifica solo l’amplicone ?

primer rev

Orientamento primers PCR inversa

5’3’3’5’

5’ 3’

3’c d

d c

cd

5’ 3’

5’3’

5’

a b

b a

ab

ligasi del sito di restrizione

PCR nested per PCR inversaestremità ignote digerite su DNA genomico e legate

regione nota

I primers dovranno sempre essere complementari ai due diversi filamenti

I coppiadivergente

II primerII primer

I amplicone

II amplicone

I primer I primer

II primer II primer

PCR nested quando si vuole ottenere maggiore specificità

Primo ciclo frgm + lungo

d

d ccd

frammento di restriz legato

c-d sequenza notaI ciclo

II ciclo

d

c

d c

d c

c

possibilità di concatenamero se la taq prosegue

si amplifica solo l’amplicone

dal II ciclo compare il frammento con le estremità corrispondenti al 5’ dei due primers:

primer frw la taq polimerasi non ha ostacoli e non si ferma

primer rev

primer rev

primer frw

templato I amplificaz

templato I amplificaz

il prodotto di PCR è sempre lineare

sia nella PCR diretta che inversa con un DNA circolare

provate a farvi uno schema!

Metodo real time

Differenza con PCR standard “end point”

“end point” si intende reazione a termine

Analisi dell’amplificazione in tempo reale

Tramite fluorescenza dei prodotti amplificati

Colorante fluorescente del DNA intercalante CYBRgreen

Marcatura dei primers o doppia sonda: “FRET”; “TaqMan”; “amplifluor”

Principio del funzionamento real-time

Analisi dell’amplificazione ad ogni ciclo lettura laser della fluorescenza (qualunque metodo)

Soglia di superamento rumore di fondo

Inizio crescita log macchina tra 35-40 cicli

Curva sigmoideEffetto inibiz.

10pg5pg

1pg

0.5pg

no DNAdeterminazionedi sensibilitàdel metodo

1 log per 3.3 cicli

Crescita a esponente 2 ogni tre,tre cicli 10 x incremento

n. cicli

fluor.

Intercetta col “cut off” background = punto inizio log phase determinabile

La conc. Misurata con una curva standarddi riferimento x = condizioni

Ascissa n. cicli / ordinata fluorescenza

Ogni genoma ha un certo numero di siti di restrizione per tipo di enzima di restrizione- si digerisce il genoma e ci si legano degli adapters- si disegnano dei primers che contengono l’adapter ed una sequenza random al 3’ con due, tre, quattro, cinque, sei… nucleotidi secondo quanto si vuole essere selettivi; da migliaia di frammenti si passa a meno di cento- Gli oligonucleotidi verso il 3’ oltre l’adapter possono contenere solo certi nucleotidi e allora sono piu’ selettivi e diminuiscono il numero di frammenti specifici rendendo il pattern piu’ semplice da analizzare.

AFLP Amplified restriction fragment lenght polymorphisms

Dagli RFLPs agli AFLPsNuovo metodo di studio dei polimorfismi con approccio globale genomico

Studio dei polimorfismi di frammenti di restrizione non conosciuti con amplificazione tramite PCR selettiva dei frammenti genomici

http://www.dea.gov/programs/forensicsci/microgram/journal071203/mj071203_pg7.html

Approccio globalecon micro-cips

Polimorfismo dei frammenti di restrizione amplificati (AFLP)

•Produzione in multiplex di 50-100 marcatori con un singolo esperimento.

•Produzione contemporanea di bande polimorfiche tra individui (DNA fingerprinting) e di monomorfiche entro e

polimorfiche tra specie (identificazione di specie)•Applicabili al genoma di qualsiasi specie senza bisogno

di informazioni a priori sulle sequenze o di disponibilità di sonde

Schema dei primers

usati

Fasi dell’esperimento

! digestione con Eco RI del genoma in analisi!! digestione della I reazione con Taq I (o altro enzima)!!! ligasi con la miscela dei due adattatori!!!! preamplificazione senza marcatura!!!!! amplificazione con primers marcati!!!!!! corsa su gel di acrilamide 4,5%!!!!!!! rivelazione con autoradiografia o elettroforesi capillare

in alternativa corsa elettroforetica capillare con fluorescenza

Adattatori e PrimersAdattatori secondo il metodo pubblicato da Pieter Vos et al. Nucl.Acid Res. 1995, 23 n.21, 4407-4414 e Paolo Ajmone-Marsan et al. Animal Genetics 1997, 28, 418-426.

adattatore Eco RI

5’ 3’ 5’ 3’ CTGGTAGACTGCGTACC AATTCnnnnnnnnG AATTGGTACGCAGTCTAC

CATCTGACGCATGGTTAA  GnnnnnnnnCTTAA CCATGCGTCAGATGGTC 3’ 5’ 3’ 5’

adattatore Eco RIframmento di restrizione

adattatore Taq I

GACGATGAGTCCTGAC CGAnnnnnnnnnnnnnT CGGTCAGGACTCAT TACTCAGGACTGGC TnnnnnnnnnnnnnAGC CAGTCCTGAGTAGCAG

adattatore Taq I

e terza combinazione con adattatori Eco e Taq sui frammenti tagliati regolarmente

Elettroforesi su acrilamide

Ogni lane è un soggettoIl n. di bande presenti costituisce il pattern allelicoAlcuni alleli sono molto frequenti (strisce orizzontali) possono caratterizzare la razza animale

AFLPs gel acrilamidePCR-based screening of BAC DNA pools for SAS-DNA markers using AFLP technology. AFLP templates were prepared from BAC DNA PPs (1-32) and SPs (1-16) and selectively amplified with fluorescent-labeled EcoRI + TGA and MseI + CGG. Labeled products were analyzed on a LI-COR DNA sequencer. AFLP template from genomic DNAs (IS3620C and BTx623) were run as controls and are indicated above the respective lanes. Arrows to the right of the gel show selected SAS DNA markers that were analyzed in the DNA pools. Asterisks to the right of a subset of the markers indicate those SAS DNAs that revealed polymorphisms between BTx623 and IS3620C and could be mapped as AFLPs on the sorghum genetic map. Fluorescent-labeled molecular weight markers (LI-COR) were run in lanes marked M and their sizes (bp) are shown to the left of the gel.

Elettroforesi capillare

cosa è una“Nested” PCRPer aumentare la specificità con PCR ottimizzata e non ulteriormente ottimizzabile con i parametri di reazioneSe si deve avere un prodotto di amplificazione con alta efficienza eliminando altri prodotti indesiderati-a) omologia parziale dei primers già ottimizzati-b) sequenze omologhe, pseudogeni, sequenze duplicatecaso a: trovare una seconda coppia di primers interni al

primo amplicone (probabilità limitata di omologia di entrambe le sequenze in una stessa regione)

caso b: cercare le regioni divergenti dove scegliere altre coppie di primers

primer frw. I

primer rev.I

primer frw. II

primer rev.II

II amplicone interno

PCR nested primo esempioQuando abbiamo un amplicone per esempio di 500 bp

5’

3’ 5’

3’pr frw

pr rev

5’

5’

3’

3’

1° amplicone

5’5’3’3’

II pr frw

II pr rev

2° amplicone nested

il secondo amplicone sarà più breve secondo la posiz. dei primers

esercizio 1 CTCAGAGCTG GGAAGGAGGC TCTAGATGGC GGCTGTGCCT TAGAGAGAGC GCGCTCTGCT 61 CCCTGCCTTT GCCTCACTTT ACGCAACTTT CCCTAACTTT CGGGCAGCCT CAGGGGGCCC 121 CCGTAGCCCC CTGCCTTTCC TAGGGACTTA CTGGGGTCGA TTCGAACCTT TTTTTGGGAG 181 AAAAGCAGCT TTTAGGAGCT TTCTTTTCGT GCCTTGTTGG AAAGAAGCAG CCGTACTGAG 241 AGCCCAGGTC GTTGTTTTTT CCAGCTTAGA AGCCATGGCG CACCTCCATT TTTGTGCGCT 301 CTCCTAATGA GGTTTTTTTT CTTTCGGACC TGTTTTAGTA TTAATTATTG CTTTATTTTT 361 TTGACCAGTT AACATATTTG AGGGTTATTT TATTTATTTT TCGTTTTTTA ACGGAGGATT 421 TTGCCTTTAT TTTTAATTAT TTGGGATCTG ATATTTTTCT ACTAGTAGAT AGGACTCTTG 481 GTTTGGACAT ACTACATGGA TCAGTAAATA CCTGGGCACA GGACTTCAAA GCAAACACAG 541 ATTCCCCCTC CCCCTTAATA TTTAAGAATT AAAAGATGAT GAGAAATAAG GACAAAAGCC 601 AAGAGGAGGA CAGTTCGCTA CACAGCAATG CATCGAGTCA CTCAGCCTCT GAAGAAGCTT 661 CGGGTTCAGA CTCAGGCAGT CAGTCGGAAA GTGAGCAGGG AAGTGATCCA GGAAGTGGAC 721 ATGGCAGCGA GTCGAACAGC AGCTCTGAAT CTTCTGAGAG TCAGTCGGAA TCTGAGAGCG 781 AATCAGCAGG TTCCAAATCC CAGCCAGTCC TCCCAGAAGC CAAAGAGAAG CCAGCCTCTA 841 AGAAGGAACG GATAGCTGAT GTGAAGAAGA TGTGGGAAGA ATATCCTGAT GTTTATGGGG 901 TCAGGCGGTC AAACCGAAGC AGACAAGAAC CATCGCGATT TAATATTAAG GAAGAGGCAA 961 GTAGCGGGTC TGAGAGTGGG AGCCCAAAAA GAAGAGGCCA GAGGCAGCTG AAAAAACAAG 1021 AAAAATGGAA ACAGGAACCC TCAGAAGATG AACAGGAACA AGGCACCAGT GCAGAGAGTG

- Trova i primers per fare una PCR di un frammento di circa 3- 400 bp di questa sequenza,

- trova i primers per una PCR nested. - Trova i primers per una PCR inversa e nested- Trova a che gene appartiene questa sequenza

esecuzione esercizio 1°primer forward: da b.72 a 92 = 21 basi; 10 GC, 11 AT = 40+22 =T melting 62°C

1°primer reverse: da 786 a 767 = 20 basi;10 GC, 10 AT = 40 + 20 = T melting 60°Camplicone = 715 bp (da 72 a 786)

nested: 2° forward: da b. 121 a 140 = 20 basi;14 GC, 6 AT = 56 + 12 = T melting 68°C

2° reverse: da b. 520 a 498 = 23 basi;11 GC, 12 AT = 44 + 24 = T melting 68°C amplicone = 400 bp (da 121 a 520)

Il gene ? andare su nucleotide dalla banca dati:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

esercizio II partePCR inversa: dopo aver analizzato per Southern la regione si sceglie l’enzima di restrizione per avere un frammento di circa 4-6 kb scelta dei primers: 2° e 1° primer forward invertiti (rev. compl.) del 1° amplicone

1° primer rev inv. e 2° da b. 961 a 982

cerca la sequenza in banca dati su sito NCBI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cginucleotide blast: UniGene infoGeoGene info Homo sapiens chromodomain helicase DNA binding protein 2 (CHD2), transcript variant 1, mRNA; Length=9374

segnare i primers

1 CTCAGAGCTG GGAAGGAGGC TCTAGATGGC GGCTGTGCCT TAGAGAGAGC GCGCTCTGCT 61 CCCTGCCTTT GCCTCACTTT ACGCAACTTT CCCTAACTTT CGGGCAGCCT CAGGGGGCCC 121 CCGTAGCCCC CTGCCTTTCC TAGGGACTTA CTGGGGTCGA TTCGAACCTT TTTTTGGGAG 181 AAAAGCAGCT TTTAGGAGCT TTCTTTTCGT GCCTTGTTGG AAAGAAGCAG CCGTACTGAG 241 AGCCCAGGTC GTTGTTTTTT CCAGCTTAGA AGCCATGGCG CACCTCCATT TTTGTGCGCT 301 CTCCTAATGA GGTTTTTTTT CTTTCGGACC TGTTTTAGTA TTAATTATTG CTTTATTTTT 361 TTGACCAGTT AACATATTTG AGGGTTATTT TATTTATTTT TCGTTTTTTA ACGGAGGATT 421 TTGCCTTTAT TTTTAATTAT TTGGGATCTG ATATTTTTCT ACTAGTAGAT AGGACTCTTG 481 GTTTGGACAT ACTACATGGA TCAGTAAATA CCTGGGCACA GGACTTCAAA GCAAACACAG 541 ATTCCCCCTC CCCCTTAATA TTTAAGAATT AAAAGATGAT GAGAAATAAG GACAAAAGCC 601 AAGAGGAGGA CAGTTCGCTA CACAGCAATG CATCGAGTCA CTCAGCCTCT GAAGAAGCTT 661 CGGGTTCAGA CTCAGGCAGT CAGTCGGAAA GTGAGCAGGG AAGTGATCCA GGAAGTGGAC 721 ATGGCAGCGA GTCGAACAGC AGCTCTGAAT CTTCTGAGAG TCAGTCGGAA TCTGAGAGCG 781 AATCAGCAGG TTCCAAATCC CAGCCAGTCC TCCCAGAAGC CAAAGAGAAG CCAGCCTCTA 841 AGAAGGAACG GATAGCTGAT GTGAAGAAGA TGTGGGAAGA ATATCCTGAT GTTTATGGGG 901 TCAGGCGGTC AAACCGAAGC AGACAAGAAC CATCGCGATT TAATATTAAG GAAGAGGCAA 961 GTAGCGGGTC TGAGAGTGGG AGCCCAAAAA GAAGAGGCCA GAGGCAGCTG AAAAAACAAG1021 AAAAATGGAA ACAGGAACCC TCAGAAGATG AACAGGAACA AGGCACCAGT GCAGAGAGTG

1° frw; 2 inv2° frw; 1 inv

2° rev

1° rev; 1° inv

2° inv

inv = primer per PCR inversa che ha due coppie di primers per poter fare una PCR nested, quelli al 5’ della seq. devono essere complementary-reverse e quelli al 3’ sono uguali alla sequenza stampo data

primers con code!

la regione di annealing deve essere efficiente sul 3’

templato3’ 5’

3’la coda verrà inserita e dal ciclo successivo fara parte dell’amplicone

amplicone con coda incorporata

5’

5’ 3’

se i primers hanno la coda

5’ 3’ 3’5’

5’5’3’3’

5’5’3’ 3’

alla polimerase importa solo che il 3’ sia appaiato, però la coda del primer sarà incorporato e farà parte dell’amplicone

è la stessa cosa che succede in una amplificazione aspecifica in cui solo il 3’ del primer (specifico) trova omologia di sequenza e farà amplificare un prodotto non specifico

Per fare avvenire una delezione o inserzione si utilizza il metodo a tre passaggi (esempio per inserzione).

per inserire la sequenza mutata nella sequenza voluta o si seleziona un ricombinante dopo trasfezione o si inserisce direttamente la sequenza mutagenizzata con enzimi di restrizione.

Mutagenesi tramite uso di primers modificati

pr.ext. frw.

pr.int. rev. pr.ext. rev.

pr.int. frw.3’

3’5’5’

a b

pr.ext. frw.

pr. int. rev.

3PCR indipendenti

pr.ext. frw.

pr.ext. rev.

I

III ( )( )

pr.int. frw.

pr.ext. rev.inserzione

II

I e II PCR indipendenti

b

a

a b

Mutagenesi con PCR in tre passaggi

DNA mitocondriale bovino acc. N. V00654, gi 12800 con 16338 bpL8014 (external forward primer) 5’-ACCCATTGTCCTTGAGTTAGT-3’,H8393 (external reverse primer) 5’-GAGGGTTACAAAGCGATTGCT-3’,

H8242 (internal reverse primer) 5’-GAGATCTGCCGTACAGGCCTAGAATATTTTTGTTGGTGTCAGT-3’ and L8283 (internal forward primer) 5’-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA-3’, III PCR per estensione della regione sovrappostaI primers interni L8283 e H8242 hanno una coda al 3’-terminale che è stata usata per introdurre una inserzione di 22 bp (parte sottolineata nella sequenza del primer). La complementarietà sta nell’inserzione tra il 3’ dell’int. frw. primer ed il 5’ dell’int.rev.primerL’inserzione permette di discriminare per peso molecolare la sequenza bovina da quella del nuovo costrutto usato nella PCR competitiva come riferimento con varie diluizioni a partire da una concentrazione nota.Il competitore sintetico è stato clonato nel vettore pBlueScript KS+ della ditta Stratagene (La Jolla, Ca.CA USA).

Complementarietà delle codeH8242 (internal reverse primer) 5’-GAGATCTGCCGTACAGGCCTAGAATATTTTTGTTGGTGTCAGT-3’ and L8283 (internal forward primer) 5’-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA-3’

5’-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA- 3’3’…………TTTTATAAGATCCGGACATGCCGTCTAGAG

seq mitoc. spec

seq mitoc. spec

coda per appaiamento

5’

5’3’ int rev pr

templato

int frw pr5’

5’3’

5’ 3’

3’

3’ 5’templato

appaiamento PCR I + II

5’

3’5’

3’ 5’3’3’

5’5’

5’3’

5’

3’XX

3’3’

5’

“elongation” solo di due filamenti

impossible impossible

mission impossible

possiblepossible

di un frammento f in un amplicone (3 steps = 3 passaggi)

inserzione

frw frw

rev reva

f

fb

inserzionefrw

reva fb

ff

annealing di 2 PCR

ab

PCR I = a PCR II=b

x

y

5’

5’

3’

3’ elongation

elongation

primer frw e rev interni sono contigui per poter inserire la sequenza f

di un frammento b da un amplicone

1

1

2

frwfrw

revrev

a b c

delezionea b

a c

1 2 c3’liberooredil 3’

2

1

22

2

1 caannealing II PCR

delezione

primer 1 e 2 interni iniziano e finiscono sui limiti della sequenza da deletere

in un amplicone in 3 passaggi

z 3’

aI cb

z

z

3’5’II

III

annealing III PCRed “extension”

II PCR separate

z

ac

3’5’ 5’

a cz3’5’

3’ 5’

PCR finale

sostituzione 5’

5’

giunzione di due frammenti distanti

la procedura è la stessa di quella della delezione, la differenza consiste nella collocazione del secondo amplicone che si vuole legare al primo che può essere ovunque nel genoma,unica condizione necessaria è la presenza delle code complementari dei primers che è obbligatoria, basta scegliere quale sequenza va al 5’ e quale al 3’ del nuovo amplicone artificiale

x y

x y

quali code sono produttive ?3’ 3’

5’5’

cc

aa

aa

cc

5’ 5’

3’3’

ccx

tt

gg

aagg

tt

y5’aa

cc 3’

5’gg

3’ tt

5’

x3’

5’

cc

aa5’

3’ gg

tt

ordine del prodotto : x - y

ccy 5’

A) code compl. rev

strand +/-

aa

B) code rev. perchè non funge?

3’

cc5’

3’ gg

altre code5’

3’

aa

5’

5’

3’

gg

tt

x ysi

tt

aa

cc

no

5’

3’

5’

3’

gg

tt

yaa

cc5’

3’

x

verso = x - y strand +/+ dirette

aa

cc5’

3’

tt

ggno

si

verso = y - x strand +/- invertite

code = al 3’ e 5’

code invertite al 5’

Questo terzo metodo che abbiamo visto, può essere utilizzato sia per ottenere inserzioni o sostituzioni, ma anche delezioni però con l’inserzione di un nuovo frammento di lunghezza diversa, anche molto diversa per avere una regione di omologia per l’appaiamento ed “elongation”. Dipende da dove si fanno partire i primers interni con la coda. In realtà si possono giuntare anche frammenti non limitrofi per costruire geni di fusione. Si possono legare esoni di geni diversi come per esempio esoni di un gene a cui attaccare la GFP o Lac Z.

Applicazioni dell’ultimo metodo

riepilogo

RT-PCR

nested PCR

mutagenesi