Stefania Varani Laboratorio CRREM-UO Microbiologia

Università degli Studi di Bologna/Policlinico S.Orsola-

Malpighi

Le leishmaniosi: solo infezioni

tropicali neglette?

- Protozoo emoflagellato del genere Leishmania

- Sono state identificate > 20 specie

- Ogni specie è suddivisa in diversi zimodemi (MON1,MON2,etc.)

in base alla diversa mobilità elettroforetica degli isoenzimi, con

diversa patogenicità (zimodemi viscerotropi - dermotropi)

Leishmaniosi: il patogeno

L.donovani

L.infantum

L.major

L.tropica

L.aethiopica

L.braziliensis.

.

.

Leishmaniosi: il vettore

-Insetti del genere Phlebotomus (flebotomi o pappataci)

-Dimensioni: 2-3 mm

-In Italia i flebotomi sono distribuiti su tutto il territorio nazionale sotto i

1200 m di altitudine

-Attivi soprattutto al crepuscolo e di notte

-Si allontanano pochissimo dai luoghi di riproduzione

-Depongono le uova in terreni umidi

Leishmaniosi: altre vie di trasmissione

• Tossicodipendenti che utilizzano droghe endovena (condivisione di

aghi infetti)

• Trapianto d’organo

• Trasfusioni di sangue (trasmissione rara)

• Trasmissione verticale (da madre con leishmaniosi viscerale)

Leishmaniosi umana

3 forme cliniche:

• Leishmaniosi viscerale (Mediterraneo, America Latina, India, Cina, Africa)

• Leishmaniosi mucocutanea/mucosa (America Latina, Europa)

• Leishmaniosi cutanea (Mediterraneo, Medio Oriente, America Latina, Africa)

1-2 x 106

casi/anno

500.000 casi/anno

50.000 morti/anno

Leishmaniosi: epidemiologia globale

Leishmaniosi

cutanea

Leishmaniosi

viscerale

L.donovani

L.infantum

L.infantum

L.major

L.tropica

L.aethiopica

90% casi leishmania viscerale in India, Bangladesh,

Sudan,Sud-Sudan, Etiopia and Brasile

� Approximately 100.000

people have been

infected with the

leishmaniasis in the past

2 years after civil war

broke out in Syria,

children are particularly

vulnerable

� Poverty, malnutrition, population displacement, collapse of health systems,

weakened immunity, and poor housing are all risk factors for leishmaniasis

� Sudan-South Sudan: An outbreak started at the end of 2009 with

thousands of cases , possibly caused by massive population movements

and growing food insecurity. This outbreak continued to cause extremely

high case numbers in both 2010 and 2011

Saroufim et al. Emerging Infect Dis, Vol 20—October 2014

Leishmaniasis outbreaks

Leishmaniosi del Mediterraneo

La leishmaniosi è endemica nel bacino del Mediterraneo e in Italia

-approssimativamente 5% dei casi globali di leishmaniosi viscerale

• L. infantum, zimodemi viscerotropi (MON 1, MON 72) e dermotropi (MON11, MON24, MON29 etc.)

• Serbatoio

Cani (lepri, volpi)

• Vettore

Phlebotomus perniciosus,

Phlebotomus perfiliewi

(trasmissione dell’infezione tra maggio e ottobre)

• Periodo di incubazione: MESI

L.infantum

Grey= absent

Dark grey: present

Rischio di introduzione

di specie esotiche di

Leishmania con

aumento dei viaggi

internazionali (uomini e

cani)

Rischio di diffusione di

L.infantum e L.tropica

all’interno dell’UE

L.infantum

L.tropica

(cutanea)

L.major

(cutanea)

L.donovani

(cutanea e

viscerale)

Human leishmaniasis/country profile: Italy

Alvar J et al. PLOS ONE 2012

Leishmania

species Clinical form Vector species Reservoirs

L. infantum VL, CLP. perniciosus, P. perfiliewi,

P. neglectus, P. ariasi

Canis familaris,

Vulpes vulpes

•In Italy, zoonotic VL is endemic, and sporadically zoonotic CL occurs, both caused by L.

infantum

•In immunocompetent people, half of the cases of VL occur in children

In 2003-2005, Italy provided the first evidence in Europe of

the emergence and northward spreading of VL transmission

as a probable result of climatic modifications. No cases of

canine leishmaniasis were recorded in North Italy before, but a

prospective survey, carried out between 2003 and 2005,

detected 47 cases of canine leishmaniasis and 2% seropositivity

among asymptomatic dogs

Incidenza leishmaniosi viscerale in Emilia-Romagna2013

Varani et al. Eurosurveill. 2013

�Ciclo zoonotico

(Mediterraneo)

�Ciclo antroponotico

(Asia, Africa)

Ciclo biologico delle leishmanie

Le femmine ematofaghe si infettano con gli amastigoti

presenti nel sangue o derma degli animali infetti

Nell’intestino si

trasformano in

promastigoti

Durante la puntura del nuovo

ospite vertebrato vengono

rigurgitati attraverso la proboscide

Nell’ospite

si trasformano in

amastigoti

Patogenesi di leishmaniosi

Infezione sistemica persistente

Iperplasia delle cellule

del sistema reticolo

endoteliale

Parassitemia in sangue

periferico

Promastigoti

Leishmaniosi

cutanea

Amastigoti in

cellule target

Leishmaniosi viscerale:la punta di un

iceberg

Modificata da : Michel et al Acta Tropica 2011

Infezioni asintomatiche

-7% adulti Piemonte (Biglino2010)

-10% Sardegna (Gramiccia 1990)

- 15% Toscana (Bettini 1983)

- 28% Abruzzo (Marty 1992)

Forme

paucisin-

tomatiche

Potenziali

reservoir?

Potenziali

reservoir?

Leishmaniosi visceraleLeishmaniosi viscerale

HIV-positività

Bambini sotto i 2 anni

Malnutrizione

Leishmaniosi viscerale (kala-azar)L. donovani-complex: L.donovani, L. infantum/L.chagasi

• incubazione di 2-8 mesi

• sviluppo generalmente lento (mesi)

• febbre

• anoressia, calo ponderale, astenia

• splenomegalia, epatomegalia, linfoadenopatia

• anemia normocromica

• leucopenia (2.000-3.000 GB/mm3)

• piastrinopenia

• ipergammaglobulinemia (>3 g/dl);

Coinfezione HIV-leishmania

Il rischio di leishmaniosi viscerale in pazienti con infezione da

HIV è correlato al numero di linfociti CD4+:

<200/mm3: rischio 77-90%

Aspetti particolari

• Possibile assenza di splenomegalia

• 40% dei soggetti non ha anticorpi specifici

• Letalità elevata

Leishmaniosi viscerale cronica attiva in pazienti

immunocompromessi

Definizione di caso di leishmaniosi

viscerale - OMS 2010

“Presenza di sintomi clinici (febbre irregolare

prolungata, splenomegalia e diminuzione di peso)

e

esame parassitologico positivo (microscopia,

coltura, PCR)

e/o

sierologia positiva”Fondamentale la

diagnosi

microbiologica

� Identificazione diretta del protozoo:

1.microscopica

2.colturale

3.molecolare

�Diagnosi indiretta: ricerca di anticorpi specifici

Diagnosi microbiologica di

leishmaniosi viscerale (LV)

Diagnosi di leishmaniosi viscerale: A1.microscopia

-in striscio di agoaspirato/biopsia da midollo osseo, milza, fegato,

linfonodi

-presenza di amastigoti (intracellulari)

-Sensibilità: da midollo osseo: 50-80%

da milza >90%

AMASTIGOTE

-Evidenziazione dei promastigoti

(extracellulari, mobili)

-Richiede terreni appropriati (terreno Novy–

MacNeal–Nicolle) e fino a 4 settimane di coltura

-Sensibilità?

- Importante per la diagnosi di specie ed

isolamento del ceppo

http://www.youtube.com/watch?v=yG-6KF1pstg

Diagnosi di leishmaniosi viscerale: A2.coltura

PROMASTIGOTE

Diagnosi di leishmaniosi viscerale: A3.PCR

� ricerca del DNA di leishmania su sangue midollare e sangue

periferico

� sensibilità più alta di esame microscopico (70-100%),

specificità 100%

� diagnosi di specie

- Real-time PCR

- rapidità di diagnosi

�Alta sensibilità e specificità

in identificazione di anticorpi

anti -leishmania (L.infantum,

Brandonisio et al 2002)

�rapidità e semplicità di

esecuzione:utile come test di

screening

�test qualitativo

Diagnosi di leishmaniosi viscerale: B1. test rapidi

immunocromatografici

• Test rapidi basati su rK39, kinesin-like gene

-test di riferimento utilizzato per la diagnosi ed il

monitoraggio della terapia di leishmaniosi viscerale nei Paesi

occidentali

�Alta sensibilità e specificità

�Permette determinazione

titolo anticorpale (importante

nel follow up dei pazienti)

Diagnosi di leishmaniosi viscerale: B2. test di

immunofluorescenza indiretta (IFAT)

Nr. Age / Sex HIV + Parasitological Findings Serological Findings

Microscopy PCR rk39 IFAT

Peripheral Blood Bone Marrow

1 18 m / F No NEG / POS POS POS

2 12 m / F No NEG / POS POS POS

3 5 m / F No NEG / POS POS POS

4 49 y / M No NEG / POS POS POS

5 76 y / M No NEG / POS POS POS

6 60 y / M Yes / POS / POS POS

7 62 y / M No / NEG / POS POS

8 18 m / M No NEG / POS POS POS

9 65 y / M No POS / POS POS POS

10 57 y / M No NEG / POS POS POS

11 30 m / M No POS POS POS POS POS

12 57 y / M No NEG POS POS POS POS

13 61 y / M No NEG POS POS POS POS

14 52 y / M No POS POS POS POS POS

15 86 y / M No / POS / POS POS

16 47 y / M No NEG POS POS NEG POS

17 59 y / M No / POS / POS POS

18 57 y / M No / POS / NEG POS

Leishmaniosi viscerale - Bologna Gennaio 2013-Giugno 2014

3/13: 23%

9/10: 90% 13/13: 100%

16/18: 89% 18/18: 100%

Suspicious of Visceral Leishmaniasis

rk39 serological testnegative

positive

Indirect Fluorescent

Antibody Test (IFAT) =>

Titre determination

Leishmania genus-

specific PCR

negative positive

Previous

infection of

Leishmania

VL diagnosis

All other cases:

dismiss the

diagnosis of VL

Identification of

Leishmania

species by PCR

If still high suspicion of

VL or if

immunocompromised

patient

Laboratorio CRREM-Bologna

Leishmaniosi cutaneaL.infantum, L.tropica, L.major..

Nella zona di inoculazione: piccola maculo-papula

che molto lentamente si estende nel

sottocutaneo con infiltrato di linfociti,

plasmacellule e macrofagi

Granuloma

Ulcerazione all’esterno

Crosta grigio-rossastra

- Zone scoperte (le leishmanie rimangono

nella zona d’inoculo)

- Evoluzione molto lenta

- Assenza di dolore

Leishmaniasi muco-cutanea

• Evoluzione di leishmaniosi cutanea

• Interessamento di cute e mucose , in genere di bocca,

naso, gola (faringe e laringe)

• Fa seguito a una forma cutanea localizzata, soprattutto da

L.braziliensis

• Forme destruenti e mutilanti (espundia)

L. braziliensis, L.guyanensis, L.panamensis

-Maschio, residente a Forlì,

49 anni,

- immunocompetente

-Leishmaniosi tonsillare

-No precedente manifestazione

cutanea

�Leishmaniosi mucosa rappresenta il 2.3% di tutte le leishmaniosi

�Localizzazione: bocca,tonsille, laringe, seni nasali

� Lesioni polimorfiche: ulcere, polipi, noduli, lesioni infiltranti

Definizione di caso di leishmaniosi

cutanea o muco-cutanea - OMS 2010

“Presenza di sintomi clinici (lesione cutanea o

mucocutanea)

e

esame parassitologico positivo (microscopia, coltura)

e/o

sierologia positiva (SOLO per leishmaniosi muco-

cutanea”

Fondamentale la

diagnosi

microbiologica

+ PCR

Diagnosi di leishmaniosi cutanea

• Diagnosi clinica: sensibile ma non specifica

• Diagnosi microbiologica su materiale prelevato dalla lesione

(biopsia cutanea):

- esame microscopico su biopsie paraffinate e colorate con Giemsa :

sensibilità 70%

-coltura: sensibilità 50-90%

-- PCR: >90% sensibilitPCR: >90% sensibilitàà

• Diagnosi sierologica:

-nonnon utile in leishmaniosi cutanea, spesso risulta negativa

Case Nr. Age/Sex

Localization of the

lesionParasitological findings

Microscopy

PCR

(L.infantum)

1 16 y/M face POS POS

2 68 y/F forehead POS POS

3 65 y/M face POS POS

4 53 y/M face POS POS

5 27 y/M right wrist POS POS

6 86 y/F right arm POS POS

7 68 y/F right cheek POS POS

8 76 y/M scalp POS POS

9 77 y/F forehead POS POS

10 50 y/M left arm NEG POS

Leishmaniosi cutanea - Bologna Gennaio 2013-Giugno 2014

Leishmaniosi cutanea

UO Dermatologia, Ospedale S.Orsola

Bologna: V Gaspari

••Ospedale MorgagniOspedale Morgagni--Pierantoni, ForlPierantoni, Forlìì

A Mastroianni, C Cancellieri

Grazie a:

• UO Microbiologia

• Metodiche molecolari: G Gentilomi, R

Tigani, M Ortalli, F Macca

• P Gaibani, G Rossini, C Vocale

• MP Landini

• UO Malattie Infettive: L Attard, C

Salvadori

• Oncoematologia Pediatrica:

F Melchionda

• UO Dermatologia: V Gaspari, A

Patrizi

••Dipartimento MIPIDipartimento MIPI-- ISS RomaISS Roma

M Gramiccia, T Di Muccio, A Scalone, L

Gradoni

•R Cagarelli

•A Finarelli

•• Ospedale BellariaOspedale Bellaria-- BolognaBologna

Anatomia Patologica:

MP Foschini, C Baldovini

-- Azienda OspedalieroAzienda Ospedaliero--Universitaria, BolognaUniversitaria, Bologna

•• Laboratorio Microbiologia Laboratorio Microbiologia --Area Vasta Area Vasta

RomagnolaRomagnola

V Sambri, A Pierro, S Semprini

••Ospedale MorgagniOspedale Morgagni--Pierantoni, ForlPierantoni, Forlìì

A Mastroianni, C Cancellieri