Il legame genetico di ciascun individuo (x) con la generazione precedente mediato dalla coppia di gameti (oocita e spermatozoo) che hanno dato origine a x

Il legame genetico di x con la generazione successiva mediato dai suoi gameti che contribuiscono alla formazione di nuovi individui

Vengono definiti Parentali (P) i gameti prodotti da x che hanno la stessa combinazione allelica di quelli attraverso i quali lui/lei ha avuto origine, vengono invece definiti Ricombinanti (R) i gameti con una combinazione allelica diversa da quella dei gameti da cui x ha avuto origine

Se i 2 loci sono indipendenti no.gameti aB = no.gameti Ab = no.gameti ab = no.gameti ABno. gameti P (aB + Ab) = no. gameti R (ab + AB)Se i 2 loci sono associati no.gameti aB = gameti Ab > no.gameti ab = no.gameti ABno. gameti P (aB + Ab) > no. gameti R (ab + AB)Riferendoci allindividuo della precedente diapositiva, ci aspettiamo che:

La classificazione in gameti Parentali e Ricombinanti possibile anche quando i geni stanno su cromosomi diversi

1122AabB1A1a2B2b12b1a2BASe i 2 loci si trovano su cromosomi diversi la probabilit che si formi un gamete Parentale uguale alla probabilit che si formi un gamete RicombinanteGameti PGameti R

AaSe i 2 loci si trovano adiacenti sullo stesso cromosoma e talmente vicini da non ricombinare mai la probabilit che si formi un gamete Parentale 1 e la probabilit che si formi un gamete Ricombinante 0AAaaaaasolo gameti P (prodotti da un doppio eterozigote in fase cis)solo gameti P (prodotti da un doppio eterozigote in fase trans)

Se i 2 loci si trovano adiacenti sullo stesso cromosoma ma a una distanza che permette il verificarsi di crossing over la probabilit che si formi un gamete P > 0.5 e la probabilit che si formi un gamete R < 0.5gameti R (da un doppio eterozigote in fase cis)gameti P (da un doppio eterozigote in fase cis)gameti R (da un doppio eterozigote in fase trans)gameti P (da un doppio eterozigote in fase trans)

MAPPATURA GENETICACostruzione di mappe genetiche, cio di mappe in cui la posizione relativa dei geni (e la distanza tra di essi) viene stabilita attraverso la stima delle frequenze di ricombinazioneLa mappatura genetica si basa sul fatto che i geni sono disposti linearmente lungo il cromosoma e che il loro ordine lo stesso in tutti gli individui della stessa specie. Durante la meiosi i cromosomi omologhi vanno incontro a eventi di crossing-over che riassortiscono gli alleli presenti sui due omologhiLa probabilit che tra due loci avvenga un crossing-over tanto pi elevata tanto pi i loci sono distanti

Poich un crossing-over pu essere evidenziato solo se lindividuo in cui si verificato doppio eterozigote (= eterozigote per entrambi i loci in esame)il requisito minimo per mappare due geni luno rispetto allaltro che di ENTRAMBI si conoscano almeno due alleli: possibile mappare i loci A e B luno rispetto allaltro solo se locus A alleli A1 e A2locus B alleli B1 e B2

La costruzione di mappe genetiche relativamente facile per gli organismi modello in cui sia possibile:

1. Programmare gli incroci2. Ottenere una progenie numerosa

Tutti con corpo grigio e ali normalinati dallunione di un oocita B,Vg con uno spermatozoo b,vgConsideriamo i due loci polimorfici di Drosophila melanogaster che controllano il colore del corpo (b = corpo di colore nero, B = allele selvatico, corpo grigio) e la forma delle ali (vg = ali vestigiali Vg = allele selvatico, ali normali)Consideriamo i due loci polimorfici di Drosophila melanogaster che controllano il colore del corpo (b = corpo di colore nero, B = allele selvatico, corpo grigio) e la forma delle ali (vg = ali vestigiali,

Incrociamo un Bb Vgvg con un soggetto doppio recessivo:otteniamo la seguente progenieInvece degli attesi 300:300:300:300 in base allassortimento indipendente

Aa BbAa BbAa BbAa BbAa BbAa Bbaa bbAa BbAa Bbaa bbSe i 2 loci sono indipendenti la Probabilit di ottenere questa fratria (6 gameti Parentali su un totale di 6 meiosi informative) (1/2)6 = 0.0156

MAPPATURA GENETICA NELLUOMOMETODO DEI LOD SCORE(Morton 1955)E in grado di distinguere tra associazione e indipendenzaNon dipende dalla fase degli alleli del doppio eterozigote (cis o trans) n dalla sua conoscenzaPermette di combinare dati provenienti da famiglie diverseIn caso di associazione non assoluta in grado di stimare la frazione di ricombinazione

METODO DELLA MASSIMA VEROSIMIGLIANZA (ML = Maximum Likelihood)Metodo che viene applicato quando non possibile verificare direttamente la veridicit di unipotesiData unipotesi A e un certo risultato R la verosimiglianza di A viene calcolata come probabilit che si verifichi R nel caso in cui A sia vera

Secondo i metodi di massima verosimiglianza (in inglese Maximum Likelihood, ML) quando ci si trova di fronte a un risultato (R) e a una serie di ipotesi tutte compatibili con esso, si valuta la verosimiglianza di ciascuna ipotesi, si ottiene cos una distribuzione di verosimiglianze (definite a posteriori perch ottenute sulla base del risultato R). Se una delle ipotesi risulta molto pi verosimile delle altre, la si considera lipotesi giusta. Talvolta, oltre al risultato R, si dispone di informazioni indipendenti che possono essere utilizzate per assegnare a ciascuna ipotesi una verosimiglianza indipendente da R (verosimiglianza a priori). In questi casi, il confronto tra le varie ipotesi avverr sulla base delle verosimiglianze globali (= verosimiglianza a priori x verosimiglianza a posteriori).

Esempio:abbiamo un sacchetto contenente vari tipi di monete:il 90% costituito da monete perfette (hanno un uguale probabilit di dare Testa o Croce) il restante 10% costituito da monete per le quali la probabilit di T minore della probabilit di C. Le monete di questo insieme differiscono tra di loro per la probabilit di dare T, per alcune P(T) = 0.4, per altre P(T) = 0.3 ecc.Supponiamo di prendere a caso una moneta e di dover stabilire se essa sia del tipo P(T) = 0.5 o P(T) < 0.5 Sulla base della numerosit (le P(T) = 0.5 sono il 90%) tenderemo a preferire lipotesi P(T) = 0.5. Tuttavia il risultato di una serie di n lanci potrebbe modificare questa preferenza

Immaginiamo di aver effettuato 6 lanci e di aver ottenuto 1T e 5C; la probabilit di questo risultato cambia a seconda del tipo di monetala verosimiglianza del risultato 1 T e 5 C in una serie di 6 lanci viene calcolata con la formula di Bernoulli, dove n il no. totale di lanci, k il no. di T ottenute, p la probabilit di ottenere T e (1-p) quella di ottenere CPossiamo scartare lipotesi che la moneta sia del tipo P(T) = 0, lipotesi pi verosimile che si tratti di una moneta con P(T) = 0.2, ma anche le altre ipotesi hanno verosimiglianze piuttosto elevate. Nessuna delle ipotesi molto pi verosimile di una qualsiasi delle altre

Tipo di monetaPTV a posteriori1 T, 5 CVPT/VPT = 0.50.50.40.30.20.100.09370.18660.30250.39320.3543011.993.234.193.78-

Possiamo valutare la verosimiglianza a favore/sfavore dellipotesi moneta-perfetta prima e dopo la serie di 6 lanciV. a priori 9:1 a favore (le monete perfette sono 9 volte pi abbondanti delle monete viziate)V. a posteriori a favore dellipotesi moneta P(T) = 0.2 (ma solo di 4 volte rispetto allipotesi P(T) = 0.5) Nessuno, sulla base del risultato della serie di 6 lanci, scommetterebbe una forte somma a favore di una qualsiasi delle ipotesi

La possibilit di effettuare altri lanci consentirebbe di acquisire maggiori informazioni e alla fine di fare una scelta con bassa probabilit di sbagliare

Quello appena illustrato il principio su cui si basa il metodo dei LOD scoreLa P(T) della moneta equivalente alla frequenza di ricombinazione tra i due loci in esame: le monete con P(T) = 0.5 sono le coppie di loci indipendenti, le monete con P(T) < 0.5 sono le coppie di loci associatiOgni lancio corrisponde a una meiosi informativa (cio a un figlio classificato con certezza come originato da un gamete P o R).

Quanto deve essere la verosimiglianza a favore di unipotesi per accettarla come vera?

Prima di iniziare lesperimento si decide una soglia che risulta un compromesso tra due esigenze opposte:

1) ridurre al minimo i casi in cui si accetta per buona unipotesi che invece sbagliata;

2) ridurre al minimo i casi in cui si lascia senza risposta il problema in esame

Il valore della soglia dipende soprattutto da quanto gravi sarebbero le conseguenze di una decisione errata

MAPPATURA di un LOCUS MALATTIA RISPETTO ad un LOCUS MARCATORE con il METODO DEI LOD SCORE, esempio di mappatura di una malattia Autosomica Dominante :

reperimento delle famiglie in cui segrega la malattia, costruzione dei pedigree e assegnazione del fenotipo (malato o sano) a ciascun membro della famiglia;determinazione del genotipo di tutti gli individui per il marcatore e verifica dellinformativit delle famiglie (il genitore che trasmette la malattia deve essere eterozigote per il locus marcatore);per ciascuna famiglia conta dei gameti parentali e dei gameti ricombinanti;calcolo dei LOD score;somma dei LOD score ottenuti sulle singole famiglie;costruzione del grafico dei LOD score

Come si procede per calcolare i LOD score

calcolo della verosimiglianza a posteriori (= sulla base del risultato osservato) per una serie di ipotesi di linkage, cio di valori di ricombinazione i calcolo, per ciascun valore i, dellODD ratio (= verosimiglianza dellipotesi i / verosimiglianza dellipotesi di indipendenza); calcolo del Logaritmo degli ODD (= LOD)

La condizione minima che il GENITORE CHE TRASMETTE LA MALATTIA SIA ETEROZIGOTE PER IL LOCUS MARCATOREMETODO DEI LOD SCORE: 3) Verifica dellinformativit delle famiglie

MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVELocus di una malattia Autosomica Dominante, Locus del marcatore A individuo sanoindividuo malatoA) NON INFORMATIVAIl padre, II-1, che ha trasmesso la malattia alla figlia III-1, omozigote per il locus marcatore: i suoi alleli a questo locus non possono essere distinti

Queste famiglie non sono mai informative

MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVELa figlia ha ereditato dal padre lallele malattia INSIEME allallele A1 del marcatore (cio, lo spermatozoo che ha dato origine a III-1 era Parentale)C) INFORMATIVAI genitori delle famiglie B) e C) sono uguali, ma la famiglia B) NON informativa, mentre la C) lo La figlia ha ereditato dal padre lallele malattia, ma pu averlo ereditato insieme ad A1 OPPURE insieme ad A2 (cio, non possiamo classificare lo spermatozoo che ha dato origine a III-1 come Parentale o come Ricombinante)B) NON INFORMATIVA

MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE

La figlia ha ereditato dal padre lallele malattia INSIEME allallele A2 del marcatore (cio, lo spermatozoo che ha dato origine a III-1 era Ricombinante)

Queste famiglie sono SEMPRE informativeD) INFORMATIVA

Per poter classificare senza ambiguit un gamete come parentale o ricombinante necessario avere informazioni su almeno 3 generazioniII-1 ha ricevuto dalla madre lallele patologico del locus malattia E lallele A1 del locus marcatore: i suoi gameti P sono quelli con le combinazioni (A1+allele Malattia)e (A2+allele normale)II-1 ha ricevuto dalla madre lallele malattia ma non sappiamo se lo abbia ricevuto insieme allallele A1 o allallele A2 del marcatoreNon sappiamo quali siano i suoi gameti P e quali gli R

Mappare due loci A e B luno rispetto allaltro equivale a rispondere alla domanda:

A e B sono indipendenti? cio = (1 ) = 0.5oppure

A e B sono associati? cio < 0.5questa ipotesi costituita da n ipotesi, una per ciascuno degli n valori compresi tra 0 e 0.5

PROBLEMA: dove si trova il gene responsabile della malattia genetica M che una malattia mendeliana a trasmissione Autosomica Dominante?

Cerco di capire se esso sia vicino al locus del marcatore A, che un marcatore STR di cui si conoscono vari alleli e di cui nota la localizzazione cromosomica

Se dimostro che il locus malattia M e il locus marcatore A sono vicini ho individuato la regione cromosomica in cui si trova il locus M

Per cercare di rispondere a questa domanda applichiamo il metodo dei LOD SCORE (che un metodo di Massima Verosimiglianza)

Il risultato rappresentato dal no. di gameti P e Rprobabilit di un gamete P = (1 )probabilit di un gamete R =

tutte le ipotesi di associazione prevedono che no.P > no.R lipotesi di indipendenza prevede che no.P = no.R

METODO DEI LOD SCORE 4. conta dei gameti parentali e dei gameti ricombinanti;Gameti P = 5Gameti R = 1

Questo calcolo viene ripetuto per una serie di valori di Rapporto tra la verosimiglianza dellipotesi i e la verosimiglianza dellipotesi di indipendenza

ODD = (1- )5 x 1 / (1/2)6

Calcolo del log10 degli ODD (1- )5 x 1LOD score = Z = log10 --------------------- (1/2)6 0 0.10.167 0.2 0.3 0.4 0.5ODD 0 3.7794.2874.1943.2271.991 1LOD - 0.5770.6320.6230.5090.299 0

METODO DEI LOD SCORE Costruzione del grafico dei LOD score, in ascisse sono riportati i valori di , e in ordinate i valori di LOD Risultato non conclusivo

Bisogna cercare e studiare altre famiglie in cui sia presente la stessa malattia

I LOD SCORE ottenuti sulle singole famiglie possono essere sommati

VALORI di LOD CRITICI(valori soglia)LOD + 3 Ipotesi di linkage accettataverosimiglianza a posteriori a favore del linkage 1000:1verosimiglianza a priori che due loci siano linked 1:50 (a sfavore dellassociazione)verosimiglianza globale 1000:50, cio 20:1 (P = 0.05)

LOD - 2 Ipotesi di linkage scartata verosimiglianza a posteriori a favore dellindipendenza 100:1verosimiglianza a priori a favore dellindipendenza 50:1verosimiglianza globale a favore dellindipendenza 5000:1

Esempi di curve di lod scoreEvidenza di linkage per = 0.23Evidenza di linkage assoluto ( = 0)Linkage escluso per valori di < 0.12Risultato non conclusivo per tutti i valori di

Metodo dei LOD SCORE efficienza:Massima per linkage assolutiTeoricamente in grado di scoprire qualsiasi grado di linkage, ma in pratica non cos per scoprire gradi di associazione modesti (= elevata frequenza di ricombinazione) necessaria una quantit di dati non realisticamente ottenibileEsempio con 25 gameti informativi si pu arrivare a dimostrare che due loci sono linked solo se la frequenza di ricombinazione tra di essi non supera il 10%Se non ci sono ricombinanti 10 meiosi informative sono sufficienti a fornire prova di linkage. Se = 0.2 sono necessarie 36 meiosi per dare una prova convincente dellesistenza di linkage; se = 0.3 ne sono necessarie 85Con la mappatura genetica si pu restringere la regione in cui si trova un gene malattia a qualcosa dellordine di 1-2 cM (equivalenti a 1-2 Mb)

ATTENZIONE!!!

La stessa malattia NON associata in tutte le famiglie allo stesso allele del marcatore

Nelle famiglie 1 e 2 segrega la stessa malattia, ma mentre nella famiglia 1 essa viaggia con lallele 1, nella famiglia 2 viaggia con lallele 3

Quando si mappa un gene malattia bisogna fare attenzione alla possibilit di classificare come sani individui che sono in realt malati (penetranza incompleta e/o insorgenza tardiva) classificazione errata di gameti P e R

Inoltre se la malattia presenta eterogeneit genetica di locus prima di mettere insieme dati provenienti da famiglie diverse bisogna accertarsi che in tutte le famiglie la malattia abbia la stessa causa genetica

Con il metodo dei LOD SCORE si producono gruppi di associazione (o di sintenia). Lassegnazione ad un particolare cromosoma possibile solo se almeno un marcatore del gruppo di associazione stato assegnato ad uno specifico cromosoma (problema che oggi non si verifica pi)Primi studi di mappatura genetica nelluomo anni 60-70per molti anni risultati molto modesti: scarsit di siti polimorficiABO - adenilatochinasiABO - sindrome unghia-rotulaDuffy - cataratta congenitaRh - ellissocitosiColinesterasi - transferrinaLutheran - secretoreG6PD - emofiliaG6PD - daltonismo

Anni 80 scoperta di marcatori analizzabili a livello di DNA (RFLP prima e STR poi) e coordinamento di vari gruppi a livello internazionaleFamiglie CEPH = Centre pour lEtude des Polymorphismes HumainCostruzione di mappa marcatore-marcatore

Le mappe genetiche e le mappe fisiche sono sovrapponibili?

S, per quanto riguarda lordine dei geni lungo i cromosomiNo, per quanto riguarda la distanza che li separa

Gli eventi di crossing-over non si distribuiscono in modo uniforme lungo i cromosomi: esistono zone calde di ricombinazione (Hot Spot), inoltre la frequenza dei crossing-over pi elevata nelle femmine che nei maschi

Mappa fisica e genetica del cromosoma 13 umano nel maschio e nella femmina

Mappe genetiche ottenute con meiosi femminili (in rosso) e maschili (in azzurro) e mappa fisica del cromosoma 18

Il marcatore ideale per studi di mappatura genetica deve essere:altamente polimorfico;analizzabile con una tecnica semplice e a basso costo;analizzabile su un materiale biologico facilmente reperibile;

Marcatori ideali sono STR (Simple Tandem Repeats) e SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Perch ci interessa mappare i geni? interesse di tipo evolutivo applicazioni praticheil restringimento della regione cromosomica in cui mappa un gene-malattia costituisce il primo passo per la sua identificazionelindividuazione della regione cromosomica in cui mappa un gene-malattia ed il linkage con altri marcatori trova unimmediata applicazione nella consulenza genetica indiretta (diagnosi prenatale, diagnosi presintomatica, diagnosi dello stato di portatore), che lunica possibile quando non sia stato clonato il gene-malattia

Identificazione di geni-malattia attraverso la strategia del clonaggio posizionale1

2

3

4

5

Oggi possibile passare direttamente dalla fase 1) alla fase 3)Come si stabilisce lordine di priorit?Funzione appropriataEspressione spazio-temporale appropriataOmologie e relazioni funzionaliOmologie con fenotipi simili in organismi modello

DIAGNOSI GENETICA Diretta viene studiato il gene responsabile della malattia, possibile solo se il gene stato clonato e se ne conoscono le mutazioni patologicheIndiretta viene utilizzata quando non si conosce il gene malattia o quando la ricerca diretta delle mutazioni ha dato esito negativo. Deve essere nota la localizzazione del gene e si devono conoscere dei marcatori strettamente associati al gene (= che ricombinano raramente con il gene malattia). Pu essere applicata a malattie a trasmissione AD, AR e X-linked. Il problema principale rappresentato da diagnosi errate dovute alla ricombinazione.

come si procede nella diagnosi genetica INDIRETTAsi cerca un marcatore informativo nella specifica famiglia in modo tale da poter distinguere i due cromosomi omologhi del/i genitore/i che potrebbe(ro) trasmettere la malattiasi determina la fase di associazione tra lallele-marcatore e lallele malattia;si determina quale cromosoma sia stato trasmesso al probando

Diagnosi genetica indiretta per una malattia Autosomica Dominante, la diagnosi soggetta ad un errore la cui grandezza dipende dalla frequenza di ricombinazione tra locus marcatore e locus malattia

Lanalisi di un marcatore a monte del locus malattia e di uno a valle permette di stabilire se si siano verificati eventi di ricombinazione: si diminuisce la probabilit di diagnosi errate

Diagnosi genetica indiretta per malattia X-linked recessiva

OMIM = Online Mendelian Inheritance in Man

Versione online del catalogo dei fenotipi mendeliani umani (la Bibbia dei genetisti medici) edito in versione cartacea fin dal 1966 a cura di Victor McKusick (sei edizioni: la prima nel 1966, lultima nel 1998)

E un compendio dei geni e dei fenotipi umaniContiene informazioni su > 13000 geni e su tutte le malattie e i fenotipi mendeliani noti

Ogni voce (entry) contrassegnata da un numero a sei cifre preceduto da un simboloil significato della prima cifra:

1..... e 2..... entries create prima del 15/05/1994 riguardanti loci o fenotipi autosomici3.....entries riguardanti loci o fenotipi X-linked 4.....entries di loci o fenotipi Y-linked5.....entries di loci o fenotipi mitocondriali6.....entries di loci o fenotipi autosomici creati dopo il 15/05/1994

il significato del simbolo che precede il numero:*gene#fenotipo+gene a sequenza nota + fenotipo%fenotipo mendeliano a base molecolare notano simbolofenotipo a sospetta (ma non confermata) eredit mendelianaEsempi relativi alla CF (= Cystic Fibrosis)Il gene*602421La malattia 1 (CF)#219700La malattia 2 (CBAVD)#277180

Per ogni gene il database fornisce numerose informazioni sia cliniche che genetico-molecolari , una serie di link ad altri siti e unampia bibliografia

*ad es. in drosofila e nei batteri si possono ottenere progenie molto numerose su cui confrontare attesi ed osservati in caso di associazione o di indipendenza. La percentuale di ricombinanti se calcolata su grandi numeri d una buona stima della frequenza di ricombinazione

*1 linkage assoluto; 2 linkage per valori di ricombinazione 0.23;3 linkage escluso per teta < 0.12;4 non informativo *topografia del genoma*