Le cellule del sistema immunitario con funzioni di riconoscimento

STRUTTURA DELLE Ig

L’IMPORTANZA DELLA REGIONE CERNIERA

Digestione parziale con enzimi proteolitici

La scoperta che individui affetti da mieloma multiplo (tumore derivato da una plasmacellula) producono in grande quantità Ig con un’unica specificità antigenica, ha reso possibile il sequenziamento delle catene leggere (L) e pesanti (H) delle Ig

Il confronto delle sequenze ottenute da pazienti diversi ha rilevato, sia nelle catene L che nelle H, la presenza di una porzione Variabile (ca. 110 aa) e di una porzione costante (ca. 110 aa nelle catene L e 330 o 440 aa nelle catene H)

LE TRE REGIONI IPERVARIABILI (CDR) DEL DOMINIO VARIABILE

Variabilità = n° di differenti aa in una certa posizione / freq. dell’aa più comune in quella posizioneCDR = Complementarity Determining RegionLe CDRs delle catene L ed H vengono a trovarsi spazialmente vicine nella struttura quaternaria sito di legame per l’Ag

Sulla base della sequenza aminoacidica le catene pesanti possono essere suddivise in 5

differenti classi (e alcune classi possono essere suddivise in

sottoclassi) che vengono indicate con lettere dell’alfabeto greco (,

, , , )Le catene leggere possono

essere suddivise in 2 differenti tipi ( e ) e le in sottotipi

Le catene pesanti , e hanno 3

domini C

Le catene pesanti e hanno 4

domini C

LE CINQUE CLASSI DI Ig

Le Ig vengono prodotte come proteine secrete o di membrana

Differenze isotipicheIndividui della stessa specie presentano tutti gli stessi isotipi. Il numero di diversi isotipi varia da specie a specieDifferenze allotipicheSi riscontrano tra individui della stessa specie

Differenze idiotipicheSi riscontrano tra linfociti B dello stesso individuo

La struttura delle Ig presenta alcune caratteristiche difficili da conciliare con i modelli genetici classici dell’epoca in cui la loro struttura è stata in gran parte chiarita Enorme diversità (= grande repertorio,

dell’ordine di 108) in ciascun individuo Presenza nella stessa molecola di una

regione variabile (sostanzialmente unica, cioè presente solo in quel clone cellulare) e di una regione costante

Esistenza di Ig di classi diverse ma con la stessa specificità antigenica

1965 - Dreyer e Bennett ipotizzano che sia le catene pesanti che le leggere siano codificate da due segmenti genici distinti che in qualche modo ad un certo stadio dello sviluppo dei linfociti riarrangiano e formano un unico gene che viene trascritto e tradotto (viene contraddetto il dogma un gene una catena polipeptidica).

Essi inoltre ipotizzano l’esistenza di molti (centinaia o migliaia) segmenti V e di pochi segmenti C.

Solo nel 1976 si è avuta la prova definitiva della sostanziale esattezza di questa ipotesi

Tonegawa e Hozumi confronto tra i DNA estratti da cellule di mieloma e da cellule embrionali digeriti con RE e ibridati con Ig-mRNA nelle prime si ha ibridazione con un solo frammento, nelle seconde con due

Dimostrazione sperimentale dell’esattezza dell’ipotesi ‘due geni una catena

polipeptidica’ formulata da Dreyer e Bennett nel 1965

Organizzazione dei cluster genici delle catene leggere e delle catene pesanti delle

Immunoglobuline nell’uomo

Riarrangiamenti (V-J) a livello di DNA portano alla formazione di un gene

funzionante

Catene pesanti: ricombinazione V-D-J

La regione Variabile è codificata dai segmenti genici riarrangiati: V e J nelle catene leggere e V, D e J nelle catene

pesanti

Il riarrangiamento avvicina sequenze Promotrici e sequenze

Enhancer

Il linfocita B maturo che non ha ancora incontrato l’Ag esprime mIgM e mIgD

Splicing alternativo

In ciascun linfocita B viene espresso un solo allele per le catene pesanti

ed un solo allele per le catene leggere (esclusione allelica)

MATURAZIONE DEI LINFOCITI B

1. Riarrangiamento dei segmenti genici della catena pesante produzione di catene (e da un solo allele

2. Riarrangiamento dei segmenti genici della catena leggera produzione di una IgM (e IgD) completa (con catene prodotte da un solo allele)

3. Se lo step 2. non è stato produttivo, si ha riarrangiamento dei segmenti genici della catena produzione di una IgM completa (con catene prodotte da un unico allele)

Se non si arriva alla formazione di un gene VH E di un gene VL funzionanti il pre-linfocita non sarà in grado di produrre alcuna Ig e morirà per apoptosi

Il riarrangiamento produttivo del 1° allele blocca il riarrangiamento del 2° allele – Se nessuno dei due

alleli effettua un riarrangiamento produttivo il linfocita muore per apoptosi

COME AVVIENE LA RICOMBINAZIONE DEI VARI

SEGMENTI GENICI ?Sono necessarie sequenze segnale che fiancheggiano le regioni che

devono essere unite e

sistemi enzimatici (sia ubiquitari che linfocita-specifici)

STRUTTURA DELLE SEQUENZE SEGNALE (RSS = Recombination

Signal Sequence)

1. Riconoscimento delle RSS da parte di RAG-1 e RAG-2 (complesso enzimatico linfocita-specifico) e sinapsi delle RSS i due segmenti genici vengono avvicinati

2. Taglio di un singolo filamento di DNA

3. Taglio del secondo filamento e legame ‘a forcina’ delle estremità tagliate

4. Taglio casuale delle forcine

5. Riunione delle estremità catalizzata dal complesso enzimatico DSBR (Double Strand Break Repair)

I punti di giunzione

possono variare. Questa

flessibilità giunzionale può dare origine a

riarrangiamenti non produttiviSi stima che solo

nel 10% dei pre-linfociti si verifichino riarrangiamenti produttivi per le catene L e per le H

Un’ulteriore fonte di variabilità deriva dal taglio casuale delle forcine e

dall’aggiunta di nucleotidi nel sito di riunione

Aggiunta di nucleotidi P e N

Origine della variazione nelle tre CDR

Grandezza del repertorio anticorpale generato dall’unione combinatoriale dei

diversi tipi di segmenti

Ig dello stesso isotipo e con uguale regione V vengono prodotte sia come proteine di

membrana che secrete attraverso un meccanismo di splicing alternativo

Eventi di splicing alternativo producono anche Ig con la stessa regione variabile ma diversa regione

costante

Il legame con l’Ag induce ulteriori cambiamenti produzione di Ig secrete, switch isotipico,

ipermutazione somatica (in seguito alla quale verrà prodotto un Ab che ha con l’Ag una

aumentata affinità di legame)

TCR = T Cell Receptor

Proteina di membrana dei linfociti T, scoperta e caratterizzata all’inizio degli anni ‘80

TCR = T Cell Receptor

Cluster dei geni per il TCR

La ricombinazione dei segmenti genici del TCR

I cluster genici del TCR nell’uomo

I meccanismi di

generazione della

diversità nelle Ig e nei

TCR

Linfociti B (e T) diversi esprimono Ig (e TCR) diversi perché HANNO geni diversi (generati dalla ricombinazione somatica) e non perché ESPRIMONO geni diversi di genomi uguali