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Review n. 8 – Italus Hortus 15 (4), 2008: 35-45

L’addolcimento da freddo dei tuberi di patata: nuovi approcci biomole-colari per la comprensione di una “vecchia” problematica

Paolo Bagnaresi1*, Anna Moschella2, Bruno Parisi2, Pierdomenico Perata3 e Paolo Ranalli4

1 CRA-GPG-Centro di Genomica e Post-Genomica Animale e Vegetale, via S. Protaso 302, 29017Fiorenzuola d’Arda (PC)2CRA - Centro di Ricerca per le Colture Industriali, via di Corticella 133, 40128 Bologna3 Plant and Crop Physiology Lab , Scuola Superiore Sant’Anna, p.za Martiri della Libertà, 56127 Pisa4 CRA - Dipartimento di Trasformazione e Valorizzazione dei Prodotti Agro-industriali, Roma

Ricevuto: 27 maggio 2008; accettato: 11 luglio 2008

Biomolecular approaches for study-ing potato tuber cold sweetening

A b s t r a c t . As it is known by more than 120 years,cold incubation of tubers cause accumulation of sug-ars (mainly sucrose, glucose and fructose) at theexpenses of starch. This is detrimental for tuber quali-ty, as, upon cooking at high temperatures, an excessof dark, bitter tasting melanoidins are produced due tothe Maillard reaction involving reducing sugars andfree amino acids. In recent years, concern for phe-nomenon has further risen since a specific type ofMaillard reaction involving the amino-acid asparagine(abundant in potato tubers) and reducing sugars hasbeen shown to produce the neurotoxic and genotoxiccompound acrylamide. This unexpected finding wasprompted by investigations on the accidental releaseof acrylamide in the environment. Attempts have beenconducted in order to identify varieties with reducedasparagine level, but the extent of reducing sugara c c u m u l a t i o n appears by far the major parameteraffecting acrylamide production in potato derivativesand thus brings the focus back to the sweetening phe-nomenon. Research on potato cold-induced sweeten-ing (CIS) has implicated several carbohydrate-associ-ated genes in the process. However, still many uncer-tainties exist, as the relative contribution of each geneto the process is often unclear, possibly as the conse-quence of the heterogeneity of experimental systems.Some enzymes associated to CIS, as β-amylases andinvertases, still await identification at the sequencelevel. Additionally, little is known about early eventstriggering CIS and involvement/association to CIS ofgenes other than CAG. Many of those uncertaintiescould be resolved by profiling experiments, but noGeneChip is available for potato and the production ofthe potato cDNA spotted array (TIGR) has recentlybeen discontinued. In order to obtain an overall pic-ture of early transcriptional events associated to CIS,we investigated whether the commercially-availabletomato Affymetrix GeneChip could be used to discern

among potato cold-responsive gene family membersto be further studied in detail by Real-Time (RT)-PCR(qPCR). A tomato-potato global match file (GMF) wasgenerated by matching tomato targets to potato ESTsin order to establish of a core set of highly homologousgenes. A further, low-scale probe-level (oligonu-cleotide) approach was also explored to maximize reli-ability of the heterologous dataset for genes of particu-lar interest. Several cold-responsive genes were iden-tified, and their expression pattern was studied indetail by qPCR over a 26-d time course. We detectedbiphasic behaviour of mRNA accumulation for CAGand our combined GeneChip-qPCR data identify, atthe sequence level, enzymatic activities as β- a m y l a s e sand invertases previously reported to take part to CIS.Scrutiny of validated GeneChip data further unveilsimportant processes accompanying CIS, such as theinduction of redox- and hormone-associated genes.This strategy revealed essential for accurate heterolo-gous dataset interpretation and suggests that similarapproaches can fruitfully be conducted for otherspecies. Transcript profiling of early events associatedto CIS discloses a complex network of events involv-ing sugars, redox and hormone signalling which maybe either serially linked or act in parallel. Identificationat the sequence level of various enzymes long knownto take part to CIS provides molecular tools for furtherunderstanding of the phenomenon.

Key words: Mail lard reaction, acrylamide,asparagine, microarray.

Introduzione

Il fenomeno dell’addolcimento dei tuberi causatodalle basse temperature fu per la prima volta descrittonel 1882 da Muller-Thurgau e da allora è stato oggettodi costante investigazione.

Sotto il profilo strettamente di post-raccolta, l’in-cubazione a basse temperature dei tuberi presenta varivantaggi quali ridotto raggrinzimento, mantenimento* paolo.bagnaresi@entecra.it

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Bagnaresi et al.

della sostanza secca e prolungamento del periodo didormienza. Il tutto evidentemente si traduce in uncongruo aumento del periodo di valenza commerciale,senza fare ricorso a prodotti chimici antigermogliantiche il consumatore vede con sempre maggiore diffi-denza (Ranalli et al., 2004). Tuttavia, l’addolcimentodei tuberi si configura come problema particolarmentegrave in seguito al trattamento ad alte temperature(maggiori di 150 °C), determinandosi infatti l’anneri-mento non-enzimatico con acquisizione del notogusto amaro. Tale fenomeno è dovuto alla formazionedi melanoidine, composti eterociclici aromatici che siformano a partire dalla combinazione degli zuccheririducenti (abbondanti, per l’appunto, in patate “addol-cite”) e da gruppi amminici liberi, il cui livello neituberi è di norma elevato. Tale reazione, detta “diMaillard”, s’innesca ad alte temperature e, se control-lata, conduce alla formazione in moderata quantità dicomposti aromatici che conferiscono particolare appe-tibilità a vari prodotti animali e vegetali sottoposti adalte temperature. Tuttavia, a causa dell’accumulo par-ticolarmente pronunciato di zuccheri riducenti che siverifica nei tuberi incubati a basse temperature, la rea-zione viene ad esser massiccia fino a tradursi in untotale annerimento che, evidentemente, compromettela fruibilità del prodotto. Purtroppo a tale problemati-ca si è aggiunto, come evidenziato in questi ultimianni, il riscontro di produzione di acrilammide,sostanza genotossica e neurotossica che raggiungeproprio nei prodotti a base di patata (chips, crisps,sticks) una concentrazione particolarmente elevata.

In questa review, in seguito ad un breve riepilogodi evidenze ormai consolidate sull’addolcimentoseguito da un aggiornamento sulle importanti novitàdel settore (quali, per l’appunto, l’acrilammide), sifocalizzerà l’attenzione su approcci molecolari comeinnovativi esperimenti di p r o f i l i n g trascrizionale conmicroarrays tesi a identificare gli eventi scatentantil’addolcimento. Per una trattazione più completa divari aspetti biochimici riguardanti l’addolcimento sirimanda in particolare a recenti r e v i e w s tra cuiSowokinos (2001) e Zhang e Zhang (2007). Per unatrattazione più capillare sull’effetto dell’agrotecnica efertilizzazione sull’addolcimento si rimanda invece adue recenti ricerche (De Wilde et al., 2006; Elmore etal., 2007) e alle referenze ivi contenute.

Il caso acrilammide

Nel 1997, nel sud-ovest della Svezia (penisola diBjare) si verificò un incidente nel corso dei lavori discavo di un tunnel che determinò il rilascio fortuito diacrilammide nell’ambiente. L’acrilammide è sostanza

mutagena e neurotossica ed è classificata dalla IARC(Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro)come probabile cancerogeno per l’uomo (gruppo 2A).Il limite fissato dall’Unione Europea per la sostanza èdi 0,1 microgrammi/litro in acqua potabile mentre invari al tri paesi, come Stati Uniti d’America eGiappone, pur non essendo definite soglie di concen-trazione, sono comunque suggerite precise proceduredi trattamento per evitare un accumulo di questasostanza. L’acrilammide presenta la peculiare capa-cità di formare, quando “innescata” da opportuni cata-lizzatori, “reti” ad alto peso molecolare, che ne deter-minano la polimerizzazione a poliacrilammide,sostanza innocua. Da ciò consegue la sua utilizzazio-ne in varie applicazioni, tra cui la separazione elet-troforetica di macromolecole e l’impiego come agentedi consolidamento del suolo, il cui uso per l’appuntodeterminò la dispersione ambientale nel 1997.Nell’incidente svedese, il riscontro di alterazionicomportamentali nella fauna locale (episodi di intos-sicazione acuta attribuibili alle caratteristiche neuro-tossiche della molecola) fornì il primo indizio del rila-scio ambientale di acrilammide. Immediatamente sirese necessario l’approntamento di tecniche analiticheal fine di chiarire in che misura questa contaminazio-ne potesse aver anche coinvolto persone del luogo, equindi la definizione di appropriati “controlli” prove-nienti da aree non interessate al rilascio. Con grandesorpresa si riscontrò che i anche “controlli” risultaro-no positivi per l’acrilammide. Fu quindi evidente chedovevano sussistere ulteriori fonti di contaminazioneambientale e venne perciò esaminata la possibilità chela sostanza fosse assunta con la dieta. In effetti, i pro-dotti derivati dalla trasformazione e frittura dellepatate si rivelarono ben presto come la fonte principa-le del composto. Nel volger di pochi anni si sviluppa-rono ed affinarono tecniche analitiche basate su cro-matografia liquida o gassosa associata a spettrometriadi massa (Tareke et al. , 2002; Jezussek andSchieberle, 2003; Pollien et al., 2003) e si confermòsperimentalmente che condizione necessaria e suffi-ciente perché si formino significativi livelli di acri-lammide è la presenza di zuccheri riducenti e ammi-noacidi liberi. In particolare l’asparagina, un ammi-noacido abbondante in patata (sono riportati valori trai 1-3 g/kg peso fresco corrispondenti circa al 40% deltotale degli amminoacidi liberi) si è rivelata estrema-mente efficace nel sostenere la reazione, spiegandocosì l’elevato potenziale per la formazione di acrilam-mide di patata e derivati (Mottram et al., 2002; Zhange Zhang, 2007).

La produzione di acrilammide risultò quindi esserecausata da una particolare sottoclasse della reazione

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L’addolcimento da freddo dei tuberi di patata

di Maillard, dove lo zucchero riducente si combinacon il gruppo amminico dell’amminoacido asparagina(la reazione è schematizzata in figura 1). Si cercòimmediatamente di sperimentare metodiche tese aridurre o comunque contenere il contenuto di acrilam-mide in vari prodotti ma in particolare nei derivati dipatata, che per l’appunto costituiva la fonte di granlunga più abbondante della sostanza. In pochi annirisultò evidente che, mentre la gamma di concentra-zioni degli zuccheri poteva fluttuare in modo estrema-mente cospicuo (migliaia di volte, a causa dell’effettodell’addolcimento da freddo), il contenuto dell’ammi-noacido presentava variazioni molto più modeste, del-l’ordine di poche volte. Ne conseguiva evidentementeche il parametro che più si prospettava come efficaceper contenere la generazione di acrilammide era l’am-montare degli zuccheri riducenti.

L’allarme generato da questi studi ha comprensi-bilmente alimentato molta ricerca al tentativo di con-tenere la formazione di acrilammide nei prodotti ditrasformazione di patata. Un gran numero di approccieterogenei, tesi sia ad alterare la cinetica della forma-zione (agendo sulle modalità di cottura e parametriassociati e trattamenti aggiuntivi e/o complementari)oppure a variare le caratteristiche del materiale di par-tenza è stato testato. Nel caso di pre-trattamenti, lalogica di tali interventi consiste nel depauperare i pre-cursori dell’acrilammide, quindi zuccheri riducenti easparagina, con varie tipologie di trattamento o di ren-dere più blande le condizioni di frittura con particola-

re riferimento alla durata e temperatura, che condizio-nano fortemente la formazione della sostanza tossica.In tal senso, alcuni tra i più recenti approcci di cotturatestati per ridurre l’acrilammide prevedono una ridu-zione dei tempi e metodiche complementari quali pre-cottura col microonde (Erdogdu et al., 2007; Sahin etal., 2007). In tabella 1 si è tentato di riassumere sinte-ticamente (accorpando varie tipologie del prodottotrasformato, poiché in molti casi si riscontra unasostanziale similarità) lo stadio di intervento, la tipo-logia, ed il grado di successo ottenuto nel contenere laformazione di acrilammide e le eventuali problemati-che associate all’intervento correttivo, facendo riferi-mento, ove non altrimenti specificato, all’eccellenter e v i e w d i Zhang e Zhang (2007) e alle referenze ivicontenute.

In linea generale, comunque, il contenimento dellivello di zuccheri riducenti, (livelli non superiori a0,5-1 g per kg di peso fresco) e la riduzione al minimoindispensabile del periodo di frittura (evitando che lacolorazione si intensifichi oltre il giallo) sono tra i fat-tori che maggiormente influenzano lo sviluppo diacrilammide (fig. 2).

Fig. 1 - Schema sintetico della generazione di acrilammide intrasformati di patata. La reazione avviene ad alte temperature di

cottura ed è una sottoclasse della reazione di Maillard checoinvolge l’amminoacido asparagina (abbondante nei tuberi) e

zuccheri riducenti. Tra i vari zuccheri riducenti che possonosostenere la reazione, in patata prevalgono glucosio e fruttosio.

Molti passaggi sono stati omessi per ragioni di chiarezza. Fig. 1 - Scheme of acrylamide synthesis in potato derivatives. The

reaction takes place at high cooking temperatures and is aspecific type of Maillard reaction involving the amino-acid

asparagine (abundant in potato tubers) and reducing sugars. Inpotato, the main reducing sugars are glucose and fructose Many

steps have been omitted for the sake of clarity.

Fig. 2 - Effetto della temperatura di conservazione dei tuberi sullaproduzione di acrilammide in trasformati di patata. Metà sinistra,

patate conservate a 10 °C (zuccheri riducenti: 0.7 g/kg;acrilammide sviluppata: 290 µg/kg). Metà destra: conservazione a

4 °C (zuccheri riducenti: 6.9 g/kg; acrilammide: 2500 µg/kg).Tratto da Koni Grob (2003).

Fig. 2 - Effect of different storage temperaures on acrylamideproduction in potato derivatives. On the left side, tubers were

incubated a 10 °C (reducing sugars: 0.7 g/kg; acrylamideproduced: 290 µg/kg). On the right side: tubers were incubated at4 °C (reducing sugars: 6.9 g/kg; acrylamide: 2500 µg/kg). From

Koni Grob (2003).

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Bagnaresi et al.

Il ruolo del germoplasma nel controllo dell’acri-lammide

Sulla base di quanto descritto, la selezione di cv conuna bassa predisposizione alla formazione di acrilam-mide si è basata sull’individuazione di varietà conbasso livello basale e/o potenzialità per l’accumulo dizuccheri riducenti. Recentemente, la varietà america-na ‘Ranger Russet’ è stata geneticamente trasformataesibendo alterazione in alcune caratteristiche dell’a-mido che ne diminuiscono la suscettibilità alla degra-dazione e quindi contenendo (anche se in modomodesto) l’accumulo di zuccheri (Rommens et al. ,2006). Degno di nota il fatto che è stata utilizzata a tal

proposito una peculiare tecnica di trasformazione cheha fatto esclusivo utilizzo di geni di patata (approccio“intragenico”) diminuendo così possibili fattori dirischio reali e/o percepiti inerenti a tali tecniche(Rommens, 2007; Rommens et al. , 2007).Prescindendo da approcci che originano OGM, analisicondotte da investigatori europei hanno identificatovarietà quali ‘Panda’, ‘Lady Claire’, ‘Markies’,‘Agria’ e ‘Fontane’ come interessanti. Infatti si sonodimostrate, dopo stoccaggio ad 8 °C, in grado di con-tenere la produzione finale di acrilammide anche setale caratteristica presentava significative fluttuazionistagionali e dipendeva dalla tipologia precisa finaledel trasformato (Heibeisen et al., 2005). Oltreoceano,

Problematiche associateAzione Riduzione diacrilammideStadio

Cultivar di patata

Cultivar di patata

Tipo di agrotecnica

Stoccaggio tuberi

Trattamento pre-fittura

Trattamento pre-fittura

Trattamento pre-fittura

Modalità di frittura

Modalità di frittura

Rapporto patate/olio

Modalità di frittura

Modalità di frittura

Modalità di frittura

Selezione di cv con bassa suscettibilità all’addolcimento

Moderato contenuto di asparagina

Alta fertilizzazione azotata

Temperatura stoccaggiosuperiore a 10° C

Immersione in soluzioni divaria natura tipo acidoacetico, NaCl, acido citrico, ecc.

Incubazione con asparaginasiper ridurre il contenuto diasparagina

Blanching (trattamento acquacalda- varie temperature- perridurre il contenuto dizuccheri riducenti easparagina)

Accorciamento dei tempi(fermare la colorazione)

Abbassamento temperatura difrittura (a.e.160 vs 170°C)

Mantenere il rapportoprossimo 1:8

Tipo di olio usato

Ridurre il tempo di frittura: ilcontenuto di umiditàcaratteristico del prodotto siraggiunge in seguito aessiccamento post frittura

Ridurre il tempo di frittura:pre-cottura con forno amicroonde

Buona

Modesta

Modesta

Ottima

Buona

Buona

Buona

Buona

Buona

Buona

Scarsa

Buona

Buona

Possibile basso contenuto diamido

-

-

-

Possibile alterazionecaratteristicheorganolettiche finaliScarsa disponibilitàdell’enzima

Possibile alterazionecaratteristicheorganolettiche finali

Possibile alterazionecaratteristicheorganolettiche finaliPossibile alterazionecaratteristicheorganolettiche finali

-

-

Possibile alterazionecaratteristicheorganolettiche

-(Erdogdu et al., 2007;Sahin et al., 2007)

Tab. 1 - Principali strategie finora valutate per contenere lo sviluppo di acrilammide.Tab. 1-Main approches tested to date in order to limit acrylamide content.

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L’addolcimento da freddo dei tuberi di patata

d’altro canto, la pressione per lo sviluppo di varietà abasso contenuto di zuccheri riducenti o addiritturaqualificabili come “cold chippers” (ossia capaci diesibire un modesto sviluppo di zuccheri riducentianche durante stoccaggio a basse temperature) è sicu-ramente altrettanto intensa e numerose varietà interes-santi in tal senso sono state introdotte in questi anni,quali ‘Ivory Crisp’ (Love et al., 2003), ‘Dakota Pearl’(Thompson et al., 2005) e ‘White Pearl’ (Groza et al.,2006).

Un altro aspetto recentemente affrontato in modosistematico è la possibilità di contenere l’acrilammideanche modulando il livello di asparagina. Mentre ilivelli di asparagina, a parità di genotipo, sono scarsa-mente influenzati da stress abiotici quale il freddo(Olsson et al., 2004) si è in alcuni casi evidenziatauna certa variabilità in funzione delle varietà conside-rate (Vivanti et al., 2006), per quanto in numerosi altristudi le variazioni varietali registrate siano assaimodeste. Tuttavia, l’evidenza sperimentale sulla cor-relazione tra il livello di asparagina e la formazione diacrilammide è decisamente più aleatoria (se non spes-so addirittura assente) di quanto non si sia verificatotra livelli di zuccheri riducenti e acrilammide, ed uncospicuo numero di studi condotti anche molto recen-temente, (Vilklund et al., 2008) ribadiscono il ruoloprioritario rivestito dagli zuccheri riducenti nel predi-sporre alla formazione di acrilammide rispetto all’a-sparagina. Si ritiene, infatti, che i livelli di asparagina,anche nelle varietà a basso contenuto, siano comun-que ampiamente sufficienti per consentire la reazionedi formazione di acrilammide. Un altro fatto da tenerein considerazione è la funzione di stoccaggio d’azotodell’asparagina: la riduzione (ad esempio, abbassandoi livelli di fertilizzazione azotata) del contenuto diasparagina potrebbe infatti risultare in una partizionepreferenziale del carbonio verso carboidrati (e quindianche zuccheri riducenti) rispetto a composti azotati,con un effetto controproducente sull’accumulo diacrilammide per quanto già esposto sopra (De Wildeet al., 2006; Elmore et al., 2007).

Perchè le patate addolciscono al freddo?

Nonostante il fenomeno sia oggetto da lungotempo di intensi studi, molti aspetti dell’addolcimentosono a tutt’oggi ancora poco chiari. In particolare, nonesiste neppure uniformità di vedute sul fatto che ilfenomeno si possa inquadrare come una reazione“fisiologica”, adattativa e quindi tesa a fronteggiare ilfreddo oppure rappresenti una semplice disfunzione acarico del metabolismo dei carboidrati senza alcunsignificato protettivo. Tra le ipotesi raggruppate nella

visione “disfunzionale” si annoverano, ad esempio,l’ipotesi della sensibilità al freddo degli enzimi depu-tati alle prime fasi della glicolisi (a.e. fosfofruttochi-nasi) che determinerebbe un disaccoppiamento fradegradazione dell’amido (processo inevitabile, mache decorre lentamente nel tubero conservato a tem-perature normali al fine di garantire i processi minimivitali) e processi a valle (glicolisi, via dei pentosifosfati, respirazione mitocondriale, respirazione anae-robica) che, a temperature normali, in varie propor-zioni e secondo le condizioni di stoccaggio smaltisco-no gli zuccheri evitandone l’accumulo (Sowokinos,2001). Ulteriori ipotesi disfunzionali fanno riferimen-to ad un’alterata integrità delle membrane mitocon-driali, con conseguente malfunzionamento del catabo-lismo aerobico ed “intasamento” del flusso del carbo-nio con l’insorgenza di un meccanismo analogo aquello sopra descritto. Alternativamente, sono statiinvocati danni a carico della membrana vacuolare, checauserebbe una perdita di zuccheri dalla sede piùappropriata di accumulo degli stessi (vacuolo). Infine,altre ricerche hanno proposto un’alterazione tempera-tura-dipendente dei fenomeni di s p l i c i n g ( p r o c e s s a-mento del trascritto di RNA primario nella sua formamatura) dell’invertasi (enzima chiave che catalizza lademolizione del saccarosio in glucosio e fruttosio)(Bournay et al., 1996).

A questa corrente di pensiero “disfunzionale”, tut-tavia, se ne è più di recente affiancata un’altra cheassegna all’accumulo di zuccheri un preciso significa-to difensivo. Infatti, l’accumulo di zuccheri si stasempre più dimostrando come un meccanismo crio-protettivo, condiviso da varie specie vegetali sottopo-ste a basse temperature (Deiting et al., 1998, e refe-renze ivi incluse). In particolare, le basse temperatureproducono effetti che in ultima analisi sono riconduci-bili a quelli della disidratazione, poichè la formazionedi ghiaccio apoplastica causa un efflusso di acqua dalcitoplasma e quindi prelude alla disidratazione(Bagnaresi et al., 2004). In questo senso, l’aumentodella concentrazione dei soluti contrasta la perdita diacqua diminuendo il potenziale osmotico del citopla-sma. Inoltre, poiché molti zuccheri sono “soluti com-patibili” (Bagnaresi et al., 2004, e referenze ivi inclu-se; Kaplan et al., 2004) un aumento anche significati-vo della loro concentrazione è compatibile con unnormale metabolismo citoplasmatico ed anzi, in casidi disidratazione più estrema gli zuccheri possono sta-bilizzare le strutture biologiche, vicariando in parte lafunzione esplicata dall’acqua (Hoekstra et al., 2001).In aggiunta, fatto ancora più importante, molti zuc-cheri esibiscono più o meno accentuate proprietà dis c a v e n g e r s con funzioni protettive verso composti

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Bagnaresi et al.

reattivi (molecole reattive dell’ossigeno; ROS) chevengono prodotti a tassi particolarmente elevati in cir-costanze stressanti. Il coniugarsi dei due effetti è rite-nuto essenziale per funzioni protettive in vari stressabiotici che comportano la disidratazione ed, in effet-ti, come recenti esperimenti di profiling trascrizionalee di determinazione di metaboliti su varie speciehanno evidenziato, l’accumulo di vari zuccheri equindi una induzione dell’apparato biosintetico asso-ciato è un fenomeno interspecifico che si registracomunemente in seguito alla percezione del freddoanche in sistemi modello (Gilmour, et al., 2000;Fowler e Thomashow, 2002; Hannah et al., 2006).Nonostante questa ipotesi fisiologica acquisti via viamaggiore consenso presso i ricercatori, molte incer-tezze ancora affliggono la nostra comprensione del-l’addolcimento, ed in particolare la successione preci-sa degli eventi molecolari che innescano l’addolci-mento stesso è sostanzialmente ignota. Queste diffi-coltà almeno in parte derivano dall’eterogeneità deisistemi sperimentali utilizzati e/o delle metodiche abassa efficienza che, sino a pochi anni or sono, sisono dovute necessariamente utilizzare in mancanzadi alternative.

Tra gli enzimi che sicuramente esplicano un ruolocentrale nel fenomeno vi è l’invertasi, infatti già daalcuni anni un’invertasi acida inducibile da freddo èstata clonata. Contrariamente alle aspettative, l’inatti-vazione con procedure antisenso della stessa ha peròquasi esclusivamente alterato il rapporto tra glucosio+ fruttosio e saccarosio, con modesto impatto sull’ac-cumulo complessivo degli zuccheri (Zrenner et al. ,1996). Maggiore successo è stato ottenuto con unulteriore approccio transgenico che è consistito nell’e-spressione ectopica di un inibitore di invertasi ditabacco; in tal modo, infatti, si è ovviato al problemadi isoforme dell’invertasi, raggiungendo un’inibizionedell’accumulo di esosi con picchi di riduzione fino al75% (Greiner et al., 1998, 1999). Tuttavia, comenotato da alcuni studiosi (Sowokinos, 2001), la mediadi accumulo di zuccheri riducenti che persisteva eraancora decisamente troppo elevata per gli standard diprocessamento di patata. Il ruolo esplicato dalle inver-tasi è probabilmente più esteso e complesso di quantoa tutt’oggi sia stato possibile chiarire, anche a causadella partecipazione alla regolazione della loro attivitàdi un inibitore dal ruolo poco chiaro (Pressey, 1967;Rausch e Greiner, 2004) e di fatto un numero maggio-re di invertasi rispetto a quelle fino ad oggi investigatesembra partecipare all’addolcimento da freddo; inparticolare, varie invertasi stimolate da freddo e carat-terizzate da un certo grado di varietà in termini didipendenza da pH, Km e termostabilità sono state evi-

denziate con tecniche cromatografiche già diversianni orsono (Sasaki et al., 1971). Infine, sempre inmerito alle invertasi, un approccio genetico basato suiQuantitative Trait Loci (QTL) ha suggerito il coinvol-gimento di un’invertasi di parete cellulare (invGE),che è tra l’altro risultata ortologa ad una invertasi(lin5) di pomodoro che controlla i livelli di glucosionella bacca (Fridman e Zamir, 2003). Tuttavia, lalocalizzazione extracellulare di invGE non facilitauna chiara comprensione del suo ruolo che resta dadefinire con ulteriore sperimentazione (Menendez e tal., 2002; Li et al., 2005).

Altri enzimi candidati per un ruolo nell’addolci-mento (vedi anche Fig. 3) sono l’UGPasi (che cataliz-za l’attivazione del glucosio formando il compostoUDP-glucosio) e la saccarosio fosfato sintasi (SPS)che combina UDP-glucosio e fruttosio consentendo laformazione di saccarosio fosfato, poi defosforilato dauna fosfatasi che produce il saccarosio vero e proprio.Tuttavia, ambo gli enzimi in approcci antisenso non

Fig. 3 - Diagramma semplificato dei principali metaboliti edenzimi che si ritiene partecipino allo sweetening. Molte tappeenzimatiche e metaboliti sono omessi per ragioni di chiarezza.UGPasi: UDP-glucosio pirofosforilasi; SPS: saccarosio fosfatosintasi; GWD: Glucan-water Dikinase; PWD: Phosphoglucan-

Water Dikinase; OPPP: via ossidativa dei pentosi fosfati. Sievidenzia in particolare il flusso di carbonio che, a fronte della

accentuata degradazione dell’amido scatenata dal freddo, vede ilcontributo di vari enzimi amiloplastici tra cui alcuni sono indicati

(molti aspetti della fase amilolitica sono tuttavia ancora dachiarire). Il carbonio proveniente dall’amido viene incanalato nellavia di generazione degli esosi (a partire dall’azione della UGPasi)a discapito di altri processi catabolici (tra cui riportiamo Glicolisi

e OPPP) che prevalgono in situazioni fisiologiche.Fig. 3 - Simplified scheme of the main enzymes and metabolitesthought to be involved in potato tuber cold sweetening. Many

enzymatic steps as well as metabolites were omitted for the sake ofclarity. UGPasi: UDP-glucose pyrophosphorylase; SPS: Sucrose

Phosphate Synthase GWD: Glucan-water Dikinase; PWD:Phosphoglucan-Water Dikinase; OPPP: Oxidative Pentose

Phosphate Pathway. The carbon flux triggered by cold exposureprompts the intervention of various amyloplastic enzymes,

including those indicated (however, several aspects of starchdegradation still await a clear understanding). Starch-derived

carbon is channelled for hexogenesis (starting from UGPase) atthe expenses of other catabolic pathways (including glycolysis and

OPPP) prevailing in other physiological contexts.

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L’addolcimento da freddo dei tuberi di patata

hanno dimostrato significativa riduzione dell’addolci-mento, probabilmente a causa dell’abbondante gradodi espressione costitutivo e quindi controllo dell’atti-vità enzimatica esercitato dai substrati più che dalgrado di espressione dell’enzima stesso (Sowokinos,2001). Tuttavia, la UGPasi sembra rivestire un ruolodi una certa rilevanza legato al tipo di isoforme(Gupta et al., 2003; 2007), mentre la SPS dimostra inseguito all’incubazione da freddo un’alterazione dellesue caratteristiche cinetiche e un accumulo dei tra-scritti (Deiting et al., 1998). Recenti studi di inattiva-zione tramite RNA interference della saccarosio fosfa-to fosfatasi hanno invece evidenziato una correlazioneinversa tra l’accumulo di saccarosio fosfato e attivitàinvertasica, con molti aspetti ancora da chiarire (Chenet al., 2008).

Procedendo a ritroso, cioè sempre più a montedegli zuccheri riducenti ma vicino ai probabili eventiscatenanti lo s w e e t e n i n g, si accetta in generale chel’addolcimento sia alimentato dai monosaccaridi pro-venienti dall’amido, e vari enzimi amilolitici sonostati coinvolti nello sweetening, ossia amido fosforila-si, α-amilasi e β-glucosidasi. L’enzima amido fosfori-lasi è stato frequentemente in passato coinvolto nelladegradazione dell’amido da freddo (Sowokinos,2001) e in alcune pubblicazioni approcci transgeniciantisenso, anche recenti, hanno avuto successo, perquanto modesto, nel ridurre gli zuccheri accumulatinel corso di tre mesi di stoccaggio (Rommens et al.,2006). Nessuna modulazione dell’attività fosforoliticaè stata tuttavia evidenziata nel corso dei primi 48 gior-ni d’incubazione al freddo (Hill et al., 1996). In questiultimi anni si tende infatti a dare maggiore credito aprocessi di degradazione dell’amido non-fosforolitici,anche in relazione ad ampie evidenze di degradazionedell’amido prevalentemente idrolitica in altri distrettidella pianta (Smith et al., 2005, Lu e Sharkey, 2006).In particolare, un’attività amilasica, dimostratasi sullabase delle specificità di substrato una β-amilasi, sirende visibile assai precocemente in tuberi sottopostia basse temperature (dopo 3 gg) (Nielsen et al., 1997;Deiting et al., 1998) per quanto fino ad oggi non fossenota a livello di sequenza. Tuttavia, il grado di fosfo-rilazione dell’amido può esplicare una funzione facili-tante gli eventi amilolitici: è stato infatti recentementeproposto che, in altri contesti, la GWD (Glucan-waterdikinase, enzima che fosforila l’amido; Mikkelsen, eta l ., 2005) faciliti l’azione proprio della β- a m i l a s i(Edner et al., 2007).

Come si può apprezzare da questa breve panorami-ca, a parte qualche evidenza episodica, molto resta dachiarire sull’addolcimento.

Gli eventi trascrizionali precoci associati allos w e e t e n i n g

Un grave problema che ha afflitto la ricerca sullosweetening nel passato è stata l’eterogeneità dei siste-mi sperimentali utilizzati (diversità in termini di culti-var, tempi di stoccaggio, metodologie sperimentali)che sovente ha prodotto risultati poco riproducibili.Inoltre, la mancanza fino a pochi anni orsono di meto-dologie ‘high throughput’ ha costretto di focalizzarel ’ i n d a g i n e ad uno o pochi geni, con risultati spessodifficilmente collocabili in un contesto complessivo ecoerente. L’approccio ideale, quindi, si configuravacome un monitoraggio a 360° dell’attività di espres-sione genica (profiling trascrizionale con microarray)come condizionata dai primi giorni della percezionedel freddo. L’utilizzo di piattaforme microarray, pur-troppo, è però limitato dalla disponibilità degli stessiche, specialmente nel caso delle piattaforme piùaccreditate, copre solo poche specie, solitamente spe-cie modello come Arabidopsis o comunque altre spe-cie di primario rilievo commerciale (riso, vite, pomo-doro, ecc.) per le quali si siano rese disponibili nume-rose sequenze, se non addirittura il completo genoma.Nel caso della patata, pur essendosi resa disponibileper qualche anno una piattaforma m i c r o a r r a y ( o r anon più disponibile) basata su cDNA spottati (ingenerale ritenuti di qualità modesta), la piattaformapiù accreditata, cioè i GeneChip Affymetrix (microar -ray di oligonucleotidi di alta qualità e standardizzati),non sono ancora stati sviluppati. Si è quindi testato unapproccio di ibridazione eterologa facendo uso delGeneChip di pomodoro, avvalendosi dell’alta parente-la filogenetica delle due specie e delle peculiari carat-teristiche tecniche dei GeneChip Affymetrix. Quindi,una ulteriore valenza di questo approccio è consistitonell’esplorazione di metodologie di ibridazione etero-loga che possono essere di utilità generale per i ricer-catori perché applicate nei numerosi casi laddove nonesista un supporto microarray specifico per una spe-cie in studio (Bar-Or et al., 2006; 2007).

La peculiarità dei GeneChip Affymetrix che facilitaapprocci di ibridazione eterologa scaturisce dallastruttura stessa degli array. Infatti, per ciascun mRNArappresentato nel microarray stesso, in sede di proget-tazione del chip viene inizialmente definita la regionerappresentativa di un trascritto (regioni ‘target’, disolito non più di 500 paia di basi, localizzate verso laregione in 3’). Quindi, il confronto della regione tar-get con altri geni di organismi omologhi può già for-nire una misura di affidabilità. Sulla base e all’internodi queste sequenze target vengono sintetizzati in situsul chip diversi oligonucleotidi (nel caso di pomodo-

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ro, 11) ciascuno lungo 25 nucleotidi. La logica di taleconcezione progettuale è quella di fornire un ampiar i d o n d a n z a di segnali sperimentali, tanti quanti sonogli oligonucleotidi, per ciascun target, al fine di mini-mizzare problematiche quali ‘cross-ibridazioni’ moltocomuni negli approcci globali. Va tuttavia rilevatoche spesso un numero ben inferiore di oligonucleotidiè sufficiente per una buona st ima del segnale(Antipove et al., 2002; Grigoryev et al., 2005). Da ciòconsegue che, nel caso di una ibridazione eterologa, sipossono scartare in sede di elaborazione dei dati isegnali associati a specifici oligonucleotidi che riflet-tono sequenze non identiche tra le due specie preser-vando invece gli oligonucleotidi identici. Va tuttaviaosservato che, ovviamente, tale approccio “correttivo”è limitato ai trascritti della pianta in studio per i qualiesista informazione di sequenza. Nel caso questi sianoin numero modesto, va tuttavia osservato che il datogrezzo dell’ibridazione eterologa, riguardante la tota-

lità dei geni rappresentati nel microarray, può sicura-mente fornire preziose informazioni sulle tendenzecomplessive di espressione anche se va ovviamenteinterpretato con cautela.

La peculiarità strutturale dei GeneChip Affymetrixha infatti trovato varie applicazioni in contesti di ibri-dazioni eterologhe. Un approccio sviluppato è“Xspecies” che, con una metodologia biologica einformatica, basandosi sui segnali ottenuti in test pre-liminari di ibridazione con DNA genomico di unaspecie di interesse, scarta gli oligonucleotidi che nonproducono segnale assumendo che questo fatto riflettamancanza di identità nucleotidica tra i trascritti delledue specie (Hammond et al., 2005; 2006). Per quantola fattibilità di tale approccio sia assodata, alcuni fat-tori tra cui la necessità di sviluppare protocolli biochi-mici ad hoc ed un certo margine di incertezza relativoall’uso di sequenze genomiche che includono DNAnon-codificante che potrebbe interferire in modo inat-

Fig. 4 - Analisi del segnale del GeneChip a livello di oligonucleotidi. A titolo di esempio, è stata scelta la saccarosio fosfato sintasi (SPS).Sulla sinistra, gli oligonucleotidi che rappresentano nel GeneChip la SPS di pomodoro (da 1 a 11) sono allineati a sequenze della SPS di

patata con cui è risultata massima l’identità in seguito ad allineamento. I mismatches, se presenti, sono contrassegnati da un simbolo nero.A: stress da freddo (4 gg a 4 °C); B: controllo a 17 °C. Si noti come nel solo caso di mismatch multipli e/o centrali (a.e. 9, 5, 11) il segnale

si discosta notevolmente da quello medio (induzione da freddo di circa 3 volte) per gli oligonucleotidi identici. Le barre rappresentano isegnali associati ai probes ‘perfect match’ (chiare) e ‘mismatch’ (scure).

Fig. 4 - Probe-level analysis of GeneChip signals as affected by sequence mismatches. SPS ( induced about 3- fold by cold) is shown as an example. On the left, numbered from 1 to 11, tomato probe sequences (perfect matchprobes) are aligned to potato sequences and mismatches are highlighted by a black dot. Noteworthy, only signals associated to probeswith multiple and/or central mismatches are severely impaired. Light and dark bars represent signal intensities associated to perfect

match and mismatch probes, respectively.

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teso rende poco attraente l’approccio a molti ricerca-tori.

Sulla base della struttura dei GeneChip Affymetrix,sono quindi state esplorate due strategie di approccio.

Globale, a livello di target, con generazione di unfile “Global Match” (Bagnaresi et al., 2008) che, con-frontando l’interezza delle sequenze target di pomo-doro identifica il miglior corrispettivo di patata, con-sentendo quindi di assodare la rappresentatività di ungene di pomodoro per il corrispettivo di patata; poi-ché, infatti, gli oligonucleotidi del GeneChip che rap-presentano tale gene di pomodoro sono definiti entrola sequenza target, maggiore è l’identità complessivatra la sequenza target e un corrispettivo di patata mag-giore è evidentemente la possibilità che tali oligonu-cleotidi abbiano alta identità con le sequenze di pata-ta. Il Global Match File pomodoro-patata è un databa-se ricercabile che consente di identificare immediata-mente, a partire da un segnale ottenuto nel GeneChipdi pomodoro, a quale corrispettivo di patata meglio siattagli, quale sia la annotazione del corrispettivo dipatata e la bontà di tale associazione tramite alcuniparametri che definiscono la qualità dell’allineamen-to. Permette inoltre di definire sottoinsiemi di genicon alta omologia pomodoro-patata. Un alto grado diomologia, infatti, minimizza l’incertezza nell’ affida-bilità dei dati.

Locale (attualmente in sviluppo), a livello deglioligonucleotidi definiti entro la sequenza target, ascala più ridotta (al momento, pochi geni possonoessere simultaneamente processati) ma più accurata.In questo modo, si determina un vero e proprio “adat-tamento” a livello di sequenza del GeneChip di pomo-doro ai geni di patata escludendo dalla valutazione deidati gli oligonucleotidi con un grado di omologiabasso tra le due specie. Come si può osservare nellafigura 4, infatti, solo in caso di numerosi mismatch om i s m a t c h in regioni centrali il dato di espressionerisulta significativamente alterato. In questo modo,(laddove esista informazioni di sequenza per la specied’interesse) si minimizzano potenziali fonti di erroredovute a differenze di sequenza tra i geni, mentre evi-dentemente si può sempre osservare l’andamento“grezzo” dell’espressione genica sulla totalità dei genirappresentati nel GeneChip.

La sperimentazione (Bagnaresi et al., 2008) hapermesso di discriminare specifici membri di famigliegeniche che sono modulati dal freddo (4 giorni a 4 °Crapportati al controllo a 17 °C) e l’espressione di taligeni è stata studiata in modo dettagliato con esperi-menti di PCR Real-time nel corso di 24 giorni di incu-bazione ottenendo una panoramica dettagliata e com-prensiva degli eventi trascrizionali precoci indotti dal

freddo. In particolare, si è evidenziato un andamentobifasico dell’espressione genica per vari geni associatiai carboidrati, che ben si integra con l’andamento tra-scrizionale di geni quali l’invertasi acida e la saccaro-sio fosfato sintasi precedentemente studiati. Di estre-mo interesse si è rivelata l’identificazione a livello disequenza di attività enzimatiche da lungo tempo noteper la partecipazione all’addolcimento, come β-amila-si ed invertasi neutre, fatto che consentirà ai ricercato-ri di avvalersi di efficaci e precisi strumenti molecola-ri con tecniche quali RNA interference per una com-prensione approfondita del fenomeno. Inoltre, l’atti-vità β-amilasica identificata a livello di sequenza pre-senta residui critici conservati di cisteina, caratteristicidi altre β-amilasi che hanno dimostrato di essereoggetto di controllo redox in altri contesti (Sparla e tal., 2006). Appare quindi estremamente probabile chel’impulso di attività β-amilasica, un tratto saliente del-l’addolcimento da freddo, sia controllato da segnali ditipo redox, così come del resto sta emergendo per variprocessi cellulari in particolare legati all’amido(Kolbe et al., 2006). Di interesse ancora maggiore l’e-videnziazione di processi globali, quali l’induzione digeni associati ai processi redox ed alla sintesi e rispo-sta a specifici ormoni che potrebbero veicolare ilsegnale che conduce all’addolcimento.

In ultima analisi, questo tipo di approccio, inaggiunta allo sviluppo di metodologie bioinformati-che per condurre ibridazioni eterologhe, già alla lucedei primi risultati si profila di estremo interesse, aven-do reso disponibili strumenti molecolari e concettualidi sicuro ausilio nella comprensione dell’addolcimen-to e quindi potenzialmente nel controllo dell’acrilam-mide nei prodotti di trasformazione di patata.

Conclusioni

Se da un lato la ricerca di metodologie di conser-vazione naturali come alternative a trattamenti chimi-ci ha riproposto un generale interesse per le bassetemperature, la conservazione dei tuberi a temperatureinferiori a 7-8 °C genera problematiche di estremorilievo tra cui l’accumulo di zuccheri riducenti, consgradevoli conseguenze come l’annerimento in sededi frittura a causa della reazione di Maillard. Negliultimi anni la ricerca ha evidenziato un fattore di peri-colo ben più cospicuo, ossia la formazione di acrilam-mide, sostanza neurotossica e genotossica, che si pro-duce a causa di una particolare sottospecie della rea-zione di Maillard tra zuccheri riducenti e l’amminoa-cido asparagina, particolarmente ricco in patata. Alivello varietale, quindi, il moderato tenore in zucche-ri riducenti e asparagina si configurano tra i primi

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obiettivi del b r e e d i n g p e r germoplasma con bassopotenziale di sviluppo per l’acrilammide. E’ necessa-rio tuttavia sottolineare che, in accordo con quantosino ad oggi sperimentato, ci si attende una fluttuazio-ne molto più marcata nei livelli di zuccheri riducenti(soprattutto, per l’appunto, a causa di fenomeni qualil’addolcimento) che non nei livelli di asparagina.

Un’ulteriore sfera di intervento per il contenimentodell’acrilammide è invece rappresentata dalla tipolo-gia di preparazione e cottura, poiché, infatti, tempera-tura, durata di cottura e pretrattamenti quali pre-lavag-gi finalizzati a depauperare la matrice dei fattori criti-ci (a.e. b l a n c h i n g, pre-incubazioni con acidi e basi,pre-cottura con microonde) hanno rivelato un certogrado di efficacia.

La via maestra, tuttavia, per contrastare l’addolci-mento si prospetta come una chiara comprensionedella dinamica degli eventi che si innesca a partiredalla percezione del freddo da parte dei tuberi. A talescopo, le ricerche condotte con un approccio di profi -l i n g trascrizionale tramite microarray e ibridazioneeterologa si stanno rivelando cruciali nell’identifica-zione a livello molecolare di vari enzimi associati allos w e e t e n i n g, fornendo ai ricercatori potenti strumentimolecolari e concettuali per intervenire sul fenomeno.

Riassunto

Si è recentemente appurato che lo stoccaggio deituberi a basse temperature non solo provoca l’addolci-mento ma, in seguito a frittura si produce la sostanzaneurotossica e genotossica acrilammide. A tale pro-cesso contribuiscono zuccheri riducenti e in minormisura l’asparagina. Diverse varietà e procedure difrittura sono state esplorate al fine di contenere lo svi-luppo di acrilammide. Tuttavia, l’approccio più pro-mettente appare la prevenzione dell’accumulo deglizuccheri. A tal proposito, si descrivono recenti ricer-che che, con metodologia microarray stanno chiaren-do gli eventi trascrizionali precoci associati alla perce-zione del freddo nei tuberi.

Parole chiave: reazione di Maillard, acrilammide,asparagina, microarray.

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