EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE

Epidemiologia classica • Limiti degli studi di epidemiologia classica:

– si limitano a studiare il nesso causale tra una determinata esposizione e l’insorgenza di una malattia,

– spesso la stima dell’esposizione è affidata alle risposte di un questionario (ed è quindi difficile verificarne la veridicità)

– i risultati ottenuti non tengono conto della interazione tra esposizione a genotossici e suscettibilità genetica dell’ospite

Esposizione

esternacancroEsposizione

esternacancro

Cosa è l’epidemiologia molecolare

Perera e Weinstein (1982) hanno suggerito di valutare end-points alternativi (dosabili con tecniche di biologia molecolare) al dato clinico in grado di fornire informazioni sul livello di esposizione, sull'effetto biologico e sulla suscettibilità individuale dei soggetti

esposti a presunti agenti genotossici

L'impostazione di uno studio di epidemiologia molecolare non è dissimile da quella di uno studio di epidemiologia analitica, i due approcci variano solo in relazione agli end-

points ricercati

Epidemiologia tradizionale

Epidemiologia molecolare

Diagnosi di malattia Biomarcatori End-points

APPROCCIO MOLECOLARE: APPLICAZIONI NELL’EPIDEMIOLOGIA DELLE MALATTIE

INFETTIVE

Sorveglianza epidemiologica - controllo delle malattie emergenti e ri-emergenti • Caratterizzazione, Rilevamento, Diagnosi • Sorveglianza di eventi epidemici • Sorveglianza al fine di valutare i programmi di intervento

Epidemiologia molecolare • Ricerca delle origini • Studio dell’ecologia dell’agente infettivo • Studio delle vie di trasmissione e dell’interazione ospite/agente

L’epidemiologia molecolare

L’epidemiologia molecolare è un nuovo campo dell’epidemiologia che studia la comparsa di alterazioni molecolari, subcellulari e cellulari che si verificano prima

dell’insorgere di una patologia

Il principale campo d’azione dell’epidemiologia molecolare sono le MALATTIE CRONICO-DEGENERATIVE ed in particolare

le MALATTIE NEOPLASTICHE

Il controllo dei TUMORI è reso difficile dalla loro natura MULTIFATTORIALE, con l’evoluzione verso la malattia condizionata da esposizioni multiple e ripetute a fattori di

rischio e con una PATOGENESI tipicamente MULTISTADI

La PATOLOGIA TUMORALE MANIFESTA è rappresentabile come la parte emersa, visibile di un iceberg

La parte visibile dell’iceberg è l’oggetto

di studio dell’EPIDEMIOLOGIA

TRADIZIONALE (morbosità o mortalità

per determinate malattie)

La parte invisibile è oggetto di studio

della EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE

Fenomeno “iceberg”

Cosa è l’epidemiologia molecolare

L'epidemiologia analitica tradizionale si propone di stabilire eventuali associazioni tra esposizione a fattori di rischio ed insorgenza di patologie

Le indagini di epidemiologia tradizionale: non consentono di indagare all'interno della "scatola nera” non permettono di caratterizzare le popolazioni in base alle variazioni interindividuali di suscettibilità ai composti genotossici

ESPOSIZIONE:Idrocarburi policiclici aromatici(es. fumo di tabaccoinquinamento atmosferico, etc.)

MALATTIA:Carcinoma polmonare

(Meccanismo d’azione?)

Progressione verso la malattia

xenobiota

Accumulo

Escrezione Biotrasformazione

Esposizione a xenobiotici

Dose esterna - quantità di xenobiotici presenti nell'ambiente che possono venire a contatto con l'organismo (monitoraggio ambientale) Dose interna - quantità totale di un composto chimico assorbita dall'organismo in un dato periodo di tempo (monitoraggio biologico)

Xenobiotico

Metabolita intermedio

Escrezione

Metabolita solubile in acqua

Può essere una specie

reattiva

Può accumularsi nei

tessuti

Fase I

attivazione

Fase II

Coniugazione

Biotrasformazione

Non-polare

Polare

Solu

bili

ty in w

ate

r

Doseinterna

Dosebiologicaefficace

Esposiz. Manifestaz.clinica

Effettibiologiciprecoci

Alteraz.strutturafunzione

Progressione verso la malattia

Markers di esposizione

Markers disuscettibilità individuale

Markers clinici

ESPOSIZIONE MALATTIA

Classificazione di biomarcatori

1) biomarcatori di esposizione 2) biomarcatori di effetto 3) biomarcatori di suscettibilità genetica individuale

Evento (biochimico, molecolare, genetico, immunologico o fisiologico) misurabile in un sistema biologico, che possa essere considerato come parte di un continuum tra un

evento iniziale (generalmente un'esposizione a genotossici) ed il risultante stato patologico (es. neoplasia)

Un biomarcatore • non è un test diagnostico • è un indicatore di un'alterazione che potrebbe risultare completamente reversibile o

che potrebbe evolversi in manifestazione clinica • deve essere correlato all'end-point clinico • deve essere sensibile anche a basse dosi di esposizione • deve essere possibilmente specifico • non deve richiedere indagini invasive

Biomarcatore

Biomarcatori di esposizione

Permettono di valutare se un individuo è stato esposto a genotossici e di determinarne l'entità dell'esposizione

Suddivisi in: • biomarcatori di dose interna - stimano l'entità dell'esposizione ad un dato composto

misurando la concentrazione dello xenobiotico stesso e/o dei suoi metaboliti nei fluidi biologici (ad es. mutagenesi urinaria,tioeteri urinari, ecc.);

• biomarcatori di dose biologica efficace - valutano l'entità delle alterazioni reversibili causate dall'esposizione a genotossici (ad es. danno primario al DNA, addotti al DNA ed alle proteine, ecc.);

• biomarcatori di effetti biologici precoci - valutano alterazioni al genoma (aberrazioni cromosomiche, scambi tra cromatidi fratelli, micronuclei)

Misurazioni dose interna

q/tà assorbita

q/tà rilasciata nei tessuti

nelle cellule

nelle

macromolecole

nei siti

critici

Biomarcatori di esposizione

Incr

eme

nto

de

l leg

ame

tra

as

sorb

imen

to e

d e

ffet

ti s

ulla

sal

ute

R

elazion

e co

n l’esp

osizio

ne estern

a

DOSE BIOLOGICA EFFICACE

Biomarcatori di esposizione - dose interna -

Aspecifici

Mutagenesi urinaria

Tioeteri urinari

Specifici

Esposizione Tecnica Biomarcatore

IPA HPLC 1-OH-pirene

Cromo VI Assorbimento atomico

Cr urinario

Aflatossina B1 HPLC Metaboliti urinari AF(P)1 ecc

Fumo di tabacco Cotinina HPLC

Urine di fumatori

Biomarcatori di esposizione - dose biologica efficace -

Addotti al DNA: sono soggetti a riparo del danno

Addotti alle proteine: (emoglobina albumina) non sono soggetti al riparo

Comet test

Head Length 21.97Tail % intensity 18.53Tail Moment 3.16

Tail Length 47.60Total Area 639.36

Total Intensity 476477.11

Head % intensity 81.47Mean Grey Level 69.98

1 cell scored Image is frozenx50 (Olio immersione)

Measure

Edit

Live

Frozen

Delete

È un metodo rapido e sensibile per la valutazione quantitativa del danno primario al DNA inteso come rotture dirette dello scheletro fosfodiesterico o lesioni della molecola

convertibili in rotture, che interessino il singolo o il doppio filamento del DNA (single- e double-strand breaks).

Campo al microscopio a fluorescenza e schermata rappresentativa ottenuta nella valutazione del danno al DNA con il sistema computerizzato di analisi di immagini

Biomarcatori di esposizione - effetti biologici precoci -

Aberrazioni cromosomiche: risultano dalla rottura e dal riarrangiamento dei cromosomi

SCE Micronuclei

Schema generale del metabolismo degli xenobiotici

Sostanza

esogena

Derivato

idrosolubile

Metabolita attivato

Fase I

funzionalizzazione Fase II

coniugazione

Fase II

coniugazione

Permettono di evidenziare se un singolo individuo è particolarmente sensibile all'azione di uno specifico xenobiotico o di una classe di xenobiotici

Lo stesso livello espositivo a genotossici non è necessariamente correlato, nei singoli soggetti, con lo stesso grado di rischio, e ciò in relazione al polimorfismo genetico di

alcune attività enzimatiche di Fase I , di Fase II e di riparo del DNA

Attività enzimatiche di Fase I (Esempi) polimorfismi genetici del citocromo P450 aldeide deidrogenasi diidropirimidina deidrogenasi Attività enzimatiche di Fase II (Esempi) glutatione S-transferasi N-acetiltransferasi

Biomarcatori di suscettibilità

Biomarcatori di suscettibilità

I geni biomarcatori di suscettibilità possono essere:

• molto diffusi nella popolazione • scarsamente correlati all’evento clinico (penetranza bassa) • geni che codificano per la produzione di enzimi del metabolismo delle sostanze

cancerogene OPPURE • poco diffusi nella popolazione • altamente correlati all’evento clinico (penetranza elevata) • geni deputati al controllo del differenziamento, del ciclo cellulare e del riparo del DNA

Biomarcatori di suscettibilità -PCR -

Lo studio dei loci genetici codificanti per attività enzimatiche di Fase I e di Fase II possono essere realizzati mediante PCR su qualsiasi tessuto biologico senza esporre il soggetto ad

alcuna indagine invasiva

Biomarcatori di suscettibilità

Polimorfismi del citocromo P450

I citocromo P450 sono enzimi codificati da geni della superfamiglia CYP che catalizzano l'inserzione di un atomo di ossigeno molecolare nel substrato Il sequenziamento del genoma umano ha rivelato la presenza di 58 geni diversi che codificano per i citocromo P450, ma solo le famiglie CYP1, CYP2 e CYP3 sono quelle maggiormente coinvolte nel metabolismo degli xenobiotici. CYP1A1, il cui prodotto genico è un enzima chiave nel metabolismo di numerosi cancerogeni aromatici, presenta il gene nella sua forma selvaggia (CYP1A1*1A) e 2 polimorfismi denominati CYP1A1*2A e CYP1A1*2C. In entrambi i casi la mutazione comporta un aumento dell'attività dell'enzima

Biomarcatori di suscettibilità

Polimorfismi delle GST

La famiglia delle GSTs è costituita da un gruppo di enzimi dimerici ad azione detossificante ( coniugazione di molecole elettrofile con il glutatione ridotto). Nel citosol umano sono state identificate 5 classi di GSTs Entro la classe µ esistono almeno 5 geni che codificano per altrettanti isoenzimi (GSTM1, M2, M3, M4, M5) ed il gene che codifica l'isoforma GSTM1 è polimorfico. Il gene polimorfico può presentarsi con completa delezione di un allele dando origine, in omozigosi, al genotipo nullo (GSTM1-nullo). Tale configurazione genica determina una diminuita produzione di glutatione-S-transferasi.

Polimorfismi delle NAT (N-acetiltransferasi)

L’enzima trasferisce un gruppo acetilico ad arilammine ed idrazine

NAT1 - 19 differenti polimorfismi

NAT2 - 24 differenti polimorfismi

L’acetilazione detossifica:

NAT1 mutato - acetilatori rapidi

NAT2 mutato - acetilatori lenti (+ rischio)

Biomarcatori di suscettibilità

Polimorfismi e tumori alla vescica

Song et al., Carcinogenesis 22 : 11 - 16, 2001

Fumo e tumore al polmone

Effetti del metabolismo del CYP1A1

Studio caso-controllo - valori di OR -

Sigarette fumate/anno CYP1A1*1A Gene selvaggio

Non fumatori 3.2 1.0

Fumatori < 20 pacchetti/anno > 20 pacchetti/anno

3.6 11.4

2.6 4.2

Genotipi metabolici - sinergie sfavorevoli presenti nella

popolazione generale - • Un soggetto GSTM1 nullo possiede un RR di sviluppare cancro pari a 1.5 rispetto a

soggetti GSTM1+

• Un soggetto con genotipo CYP1A1 mutato possiede un RR di sviluppare cancro compreso tra 1.2 e 1.9 rispetto a soggetti genotipo CYP1A1 selvaggio

•Un soggetto che presenta ambedue i polimorfismi sfavorevoli ha un RR di sviluppare cancro alla vescica pari a 6.8

SUGGERIRE ALLA POPOLAZIONE CORRETTI STILI DI VITA

MONITORAGGIO BIOLOGICI IN AMBIENTI DI LAVORO:

ESPOSIZIONE OCCUPAZIONALE A CAMPI MAGNETICI A BASSISSIMA FREQUENZA (50

HZ): EFFETTI CITOGENETICI IN SALDATORI

CAMPO MAGNETICO ELF: CANCEROGENICITA’

Gruppo 1 Cancerogeno accertato per l’uomo.

Vi è sufficiente evidenza di cancerogenicità nell’uomo in studi epidemiologici adeguati.

Gruppo 2A Probabile cancerogeno per l’uomo.

Evidenza limitata nell’uomo ed evidenza sufficiente negli animali da esperimento.

Gruppo 2B Possibile cancerogeno per l’uomo.

Evidenza limitata nell’uomo e evidenza non del tutto sufficiente negli animali da esperimento.

Gruppo 3 Non classificabile come cancerogeno per l’uomo

Tutto ciò che non rientra nei gruppi precedenti.

RISULTATI: TEST DEL MICRONUCLEO

• Valori medi della frequenza dei Micronuclei e dell’Indice Mitotico:

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1IM

esposti controlli

0

2

4

6

8

10

1

MN

/1000ce

ll b

inucl

eate

esposti controlli

Micronuclei Indice Mitotico

* *

RISULTATI: TEST DEL MICRONUCLEO

• Valori medi della frequenza dei Micronuclei e dell’Indice Mitotico per classi di età:

0

2

4

6

8

10

< 40 anni > 40 anni

MN

/1000cell b

inucle

ate

esposti controlli

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

< 40 anni > 40 anni

IM

esposti controlli

Micronuclei Indice Mitotico

ESPOSIZIONE OCCUPAZIONALE AD ANTIBLASTICI

PREPARAZIONE

MANIPOLAZIONE

EVENTI ACCIDENTALI

BONIFICA

SMALTIMENTO

SOMMINISTRAZIONE

SCOPO DELLA RICERCA

Biomarcatore

Esposiz. Dose

interna

Dose biologica efficace

Effetti biologici precoci

Suscett. genetica

individuale

Superfici Urine PBL PBL PBL

Farmaci Farmaci Danno al

DNA Alterazioni cromos.

Polimorf. genetici

CP 5-FU

CP 5-FU

Test della cometa

MN AC

GSTM1

Linee Guida

RISULTATI – MICRONUCLEI e ABERRAZIONI CROMOSOMICHE

Popolazione totale - Esposti vs. controlli:

aumento statisticamente significativo della frequenza di micronuclei e di aberrazioni cromosomiche nei soggetti professionalmente esposti a chemioterapici antiblastici

CONTROLS EXPOSED

0,00

2,00

4,00

6,00

MIC

RO

NU

CL

EI

P .0= 0 01

CONTROLS EXPOSED

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

%T

OTA

LA

BE

RR

AT

ION

S

P< 0.001

RISULTATI MN e AC Esposti (anzianità di mansione) - < 10 anni vs. > 10 anni:

effetti genotossici significativamente più elevati nei soggetti esposti con maggiore anzianità di mansione

<10 > 10

Years of exposure

2,00

4,00

6,00

8,00

MIC

RO

NU

CL

EI

(* )

<10 > 10

Years of exposure

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

%T

OTA

LA

BE

RR

AT

ION

S

(* )

DISCUSSIONE I risultati ottenuti suggeriscono:

le misure di protezione individuali e collettive adottate dagli operatori sanitari sono inadeguate per prevenire effetti biologici indesiderati di tipo genotossico;

le procedure chimico-analitiche previste dalle attuali Linee Guida per la valutazione dell’esposizione non restituiscono informazioni adeguate riguardo l’impatto dell’esposizione sulla salute dei lavoratori.

???

CONCLUSIONI generali L’uso di biomarker di epidemiologia molecolare può dare utili

informazioni su:

Etiologia dei tumori:

benzene, addotti e aberrazioni cromosomiche e leucemia

fumo di sigaretta e cancro polmonare

Valutazione dei rischi cancerogeni

Dal 1997 la IARC ha utilizzato prove meccanicistiche (bioindicatori animali o umani) per spostare la classificazione dei cancerogeni. Es. ossido di etilene e diossina da 2A a 1 (cancerogeno umano).

Valutazione di interventi preventivi

riduzione di livelli di inquinamento ambientale

interventi di chemioprevenzione

Il futuro della cancerogenesi professionale

Integrazione tra monitoraggio ambientale monitoraggio biologico

Integrazione immediata dei controlli tradizionali con bioindicatori predittivi (micronuclei, addotti, Comet test)

Integrazione futura dei bioindicatori attuali con nuovi biondicatori epigenetici e con nuove “omic technologies”:

- Proteomica

- Metabonomica

- Epigenomica

FAQ

• Come vengono valutati i rischi cancerogeni per composti singoli

• Che correlazione esiste tra mutagenicità e cancerogenicità

• Come avviene il monitoraggio ambientale dei rischi mutageno/cancerogeni?

• Che cosa è l’Epidemiologia molecolare?

• Come avviene il monitoraggio biologico dei rischi cancerogeni?