La rigenerazione cardiaca: dal pesce zebra all ’uomo

   

       

                     

                       

 Aaron Petruzzella 4A

Lavoro di maturità di biologia 2012:

Novità dalla ricerca in biologia marina e dal mondo subacqueo

Liceo cantonale di Mendrisio

Prof. Andreas Duij ts

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Indice  

PREMESSA ................................................................................................................................................................... 3  INTRODUZIONE ......................................................................................................................................................... 4  PESCE  ZEBRA  (DANIO  RERIO)........................................................................................................................................................ 4  RIGENERAZIONE  NEGLI  ANIMALI.................................................................................................................................................. 5  CUORE,  MIOCARDIO  E  CARDIOMIOCITI ........................................................................................................................................ 6  

RIGENERAZIONE  DEL  TESSUTO  MUSCOLARE  CARDIACO  NEL  PESCE  ZEBRA........................................ 7  ANALISI  ISTOLOGICA  E  PRIMI  INDIZI  SULL’ORIGINE  DELLE  NUOVE  CELLULE ....................................................................... 7  I  CARDIOMIOCITI  RIGENERATI  DERIVANO  DA  ALTRI  CARDIOMIOCITI .................................................................................... 8  DEDIFFERENZIANDOSI  I  CARDIOMIOCITI  SI  SEPARANO  E  AL  LORO  INTERNO  I  SARCOMERI  SI  DISORGANIZZANO.......... 9  CAMBIAMENTI  NELL’ESPRESSIONE  GENICA  ASSOCIATI  AL  PROCESSO  RIGENERATIVO ....................................................... 9  RIFLESSIONE  SUI  METODI  DELLA  RICERCA  ED  ESPOSIZIONE  DELLA  TECNICA  DI  CRYOINJURY ........................................12  

RIGENERAZIONE  DEL  TESSUTO  MUSCOLARE  CARDIACO  NEI  MAMMIFERI.........................................13  I  CARDIOMIOCITI  DI  RATTUS  NORVEGICUS  COLTIVATI  IN  VITRO  SI  DEDIFFERENZIANO.....................................................13  ANALISI  DELL’AVANZAMENTO  DEI  CARDIOMIOCITI  ATTRAVERSO  IL  CICLO  CELLULARE..................................................13  PROVE  CHE  LE  CELLULE  DERIVANTI  DAI  CARDIOMIOCITI  SI  DEDIFFERENZIANO  E  POI  RI-­‐DIFFERENZIANO .................14  STUDIO  EX  VIVO  DI  CARDIOMIOCITI  DI  R.  NORVEGICUS  MARCATI  GRAZIE  A  MODIFICHE  GENETICHE .............................15  IN  CUORI  UMANI  CHE  HANNO  SUBITO  UN  INFARTO  SONO  PRESENTI  CARDIOMIOCITI  IN  PROLIFERAZIONE .................16  NEI  CUORI  UMANI  È  PRESENTE  UN  CONTINUO  TURNOVER  DI  CARDIOMIOCITI ..................................................................18  

CONCLUSIONE ..........................................................................................................................................................20  APPENDICE  –  TECNICHE  DI  LABORATORIO ...................................................................................................21  1  -­‐  BROMODEOSSIURIDINA  COME  MARCATORE  DELLE  CELLULE  CHE  SVOLGONO  LA  MITOSI ..........................................21  2  -­‐  MICROARRAY ...........................................................................................................................................................................21  3  -­‐  REVERSE  TRANSCRIPTASE-­‐POLYMERASE  CHAIN  REACTION  (RT-­‐PCR).......................................................................21  4  -­‐  IBRIDAZIONE  IN  SITU ..............................................................................................................................................................21  

BIBLIOGRAFIA  E  SITOGRAFIA.............................................................................................................................22  ARTICOLI  SCIENTIFICI  E  LIBRI.....................................................................................................................................................22  PAGINE  WEB...................................................................................................................................................................................23  

                               Immagini  in  copertina  da:    -­‐  Jopling  et  al.  2010  (Supplementary  Material)  -­‐  Poss  et  al.  2002  (Supporting  Online  Material:  http://www.sciencemag.org/content/suppl/2002/12/12/298.5601.2188.DC1.html)  -­‐  http://medic2010.webs.com/infarction.htm  

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Premessa    Scegliere   il   tema   del   mio   LAM   di   biologia   non   è   stato   facile,   dal   momento   che   i   fenomeni  interessanti  che  si  possono  prendere  in  considerazione  per  sviluppare  uno  studio  nel  campo  della  biologia  marina,  o  più   in  generale   in  quello  del  mondo  subacqueo,  sono  talmente  tanti  che,   volendo   essere   sicuro   di   scegliere   il   tema   maggiormente   stimolante   e   più   capace   di  mantenere   alto   il   mio   impegno   lungo   i   diversi   mesi   a   disposizione   per   questo   lavoro,   ho  preferito  lasciar  passare  qualche  settimana  prima  di  decidere  in  maniera  definitiva.    Infine  ho   capito   che   il   tema   che  mi   affascinava  maggiormente  era   la   rigenerazione,   e   il  mio  primo   pensiero   è   quindi   stato   di   scegliere   l’organismo   per   trattare   questo   soggetto   fra   gli  echinodermi,  probabilmente  gli  animali  più  famosi  per  le  loro  capacità  rigenerative.  Gli   elementi   di   tale   phylum   animale   che   mostrano   incredibili   capacità   di   rigenerare   vaste  porzioni  del  proprio  corpo  sono  molti,  ma  al  momento  di  raccogliere  e  consultare  il  materiale  a  disposizione  mi   sono   reso   conto   che  negli   articoli   scientifici   venivano  analizzati   fenomeni  particolari  in  maniera  molto  specifica,  e  mentre  notavo  che  collegare  studi  riguardanti  specie  differenti   sarebbe   stato   difficile,   mi   accorgevo   anche   che   sarebbe   stato   altrettanto   arduo  utilizzare  tale  materiale  per  tracciare  un  quadro  complessivo  del  fenomeno  rigenerativo  così  come  si  manifesta  in  uno  di  tali  organismi.      Capito  questo,  ho  quindi  scartato  tale  opzione  e  mi  sono  rimesso  alla  ricerca  di  altri  organismi  interessanti  per  le  loro  capacità  rigenerative,  ed  è  stato  a  quel  punto  che  mi  sono  imbattuto  in  un  recente  articolo  che  analizza  la  capacità  del  pesce  zebra  di  rigenerare  parte  del  suo  cuore,  e  che   in   particolare   si   occupa   di   stabilire   quale   sia   l’origine   delle   nuove   cellule   che   vanno   a  sostituire   il   tessuto   danneggiato.   Ho   trovato   tale   articolo  molto   interessante   e   mi   è   subito  apparsa   la  possibilità  di   collegare  uno   studio   approfondito  di   tale   fenomeno   con  quelle   che  sono  invece  le  capacità  dell’uomo  di  rispondere  ad  un  danno  all’organo  cardiaco.  Non  appena  ho  scoperto  fra  gli  articoli  che  citano  tale  studio  un  articolo  nel  quale  si  descrive  un  fenomeno  analogo  che  si  manifesta  nei  cardiomiociti  di  ratto  coltivati  in  vitro  ed  ex  vivo  ed  ho  notato  che  al  primo  articolo  sul  pesce  zebra  se  ne  accompagnano  molti  altri  che  analizzano  l’interessante  capacità  di  tale  pesce  tanto  a  livello  istologico  quanto  dal  punto  di  vista  genetico,  ho  capito  che  la  decisione  era  definitiva.    Per  cui  ciò  che  intendo  approfondire  nelle  pagine  di  questo  LAM  è  una  ricerca  che  consenta  una   buona   comprensione   del   fenomeno   rigenerativo   così   come   avviene   nel   pesce   zebra  quando  tale  organismo  deve  rigenerare  parte  del  tessuto  miocardico,  nonché  un  analisi  degli  articoli  che  trattano  di  fenomeni  analoghi  osservati  in  condizioni  particolari  nei  mammiferi  e  di   quelli   che   cercano   di   comprendere   se   determinate   caratteristiche   di   tali   fenomeni   sono  osservabili  anche  nella  risposta  al  danno  cardiaco  che  si  osserva  nell’organismo  umano,  allo  scopo  di  individuare  eventuali  corrispondenze  fra  i  diversi  meccanismi  biologici  che  in  specie  differenti  si  attivano  in  risposta  ad  un  problema  analogo.    Si   tratta   perciò   anche   di   approfondire   il   legame   esistente   fra   la   ricerca   condotta   su   specie  anche   molto   lontane   da   quella   umana   e   gli   studi   che   mirano   invece   ad   una   migliore  comprensione  di  come  funziona  il  nostro  organismo  nonché  alla  risoluzione  dei  problemi  che  si  sviluppano  al  suo  interno  all’insorgere  di  varie  malattie.  Lo  studio  della  rigenerazione  cardiaca  nel  pesce  zebra  ci  è  utile  a  comprendere  meglio  alcuni  fenomeni  biologici  che  osserviamo  nell’uomo?  Ci  è  d’aiuto  per  sviluppare  nuove  terapie  per  la  cura  di  patologie  cardiache  quali  l’infarto  del  miocardio?  Nello  sviluppare  il  mio  LAM  proverò  a  rispondere  a  queste  domande  attraverso  l’analisi  del  contenuto  di  diversi  articoli  scientifici.  

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Introduzione    Prima  di   iniziare   con   lo   studio   vero   e   proprio   del   contenuto  degli   articoli   scientifici   che   ho  scelto  per  approfondire  il  tema  di  questo  LAM,  è  utile  una  breve  introduzione  alla  specie  sulla  quale   tali   studi   (perlomeno   i   primi   che   prenderò   in   esame)   sono   stati   condotti,   nonché   al  processo  rigenerativo,  che  poi  analizzerò  nei  casi  particolari,  e  alle  caratteristiche  del  tessuto  muscolare      cardiaco,    utili    per    avere    dei    riferimenti    al    momento    dell’analisi    dei      fenomeni  biologici  che  si  svolgono  all’interno  di  questo  tipo  di  tessuto.    

Pesce  zebra  (Danio  rerio)    Oltre  a  essere  molto  diffuso  in  acquariofilia,  questo  piccolo  pesce  d’acqua  dolce  membro  della  famiglia   dei   Ciprinidi   è   un   organismo   modello   molto   studiato   in   ambito   scientifico,   in  particolare  nel  campo  della  biologia  dello  sviluppo  e   in  quello  genetico;  è   inoltre  conosciuto  per  le  sue  capacità  rigenerative.    Descrizione    

Il  pesce  zebra  deve  il  suo  nome  alle  cinque  bande  blu   (fortemente   contrastanti   con   la   base   chiara,  argentea  o  dorata)  che  attraversano  il  suo  corpo  estendendosi  fino  alla  pinna  caudale.  È  lungo  mediamente  sei  centimetri,  ha  un  corpo  fusiforme   schiacciato   lateralmente   e   la   bocca  rivolta  verso   l’alto.   In  cattività  vive  mediamente  fra  i  due  e  i  tre  anni.    Alimentazione    Si   tratta   di   una   specie   onnivora,   che   si   nutre   prevalentemente   di   insetti,   zooplancton   e  fitoplancton,  ma  anche  di  vermi  e  piccoli  crostacei.    Habitat  e  comportamento    Il   pesce   zebra   è  presente   in  Asia   (più  precisamente   in   India,  Nepal,   Pakistan   e  Bangladesh)  dove  popola   acque   correnti   e   ferme   come   corsi   d'acqua,   stagni   e   risaie;  molto   attivo,   nuota  normalmente   in   superficie   e   vive   in   banchi   che   solitamente   superano   la   quindicina   di  esemplari.    Dimorfismo  sessuale  e  riproduzione    Le   femmine,   generalmente   meno   snelle,   un   po’   meno   colorate   e   più   lunghe   dei   maschi,  depongono  fino  a  400  uova  da  3  a  4  volte  all’anno,  le  quali  saranno  in  seguito  fecondate  da  un  maschio  per  poi  schiudersi  2-­‐3  giorni  più  tardi.                

Figura  1  –  Esemplare  di  Danio  rerio  (http://it.wikipedia.org/wiki/File:Zebrafisch.jpg)  

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Rigenerazione  negli  animali    Con   il   termine   “rigenerazione”   si   fa   generalmente   riferimento   in  biologia   ad  un  processo  di  nuova   generazione   di   una   determinata   forma   e   struttura   corporea   a   sostituzione   di   quella  originale   che   è   stata   in   qualche  modo   danneggiata.   La   capacità   di   svolgere   tale   processo   è  l’emblema  della  plasticità  fenotipica  dei  tessuti  degli  organismi  pluricellulari  e  permette  a  tali  organismi   di   ristabilire   e   mantenere   il   loro   stato   fisiologico   e   morfologico   naturale.    In  tal  modo  quindi  un  organismo  potrebbe  per  esempio  essere  in  grado,  nel  rimediare  a  una  ferita   o   agli   effetti   di   una  malattia,   di   riformare   un   arto   o   una   porzione   di   un   determinato  organo  e  di  ripristinarne  l’originale  funzionalità.      Tale  capacità  è  normalmente  associata  al  regno  animale,  dove  essa  ci  colpisce  maggiormente,  pur   non   essendo   affatto   un’esclusiva   di   tali   organismi   (anzi,   nei   vegetali   è   estremamente  sviluppata  e  diffusa).  Ad  ogni  modo,  in  funzione  del  contenuto  delle  pagine  successive,  le  righe  seguenti  si  limiteranno  alla  spiegazione  del  fenomeno  così  come  avviene  nelle  specie  animali.    È   possibile   definire   sostanzialmente   due   procedimenti   attraverso   i   quali   gli   animali  rigenerano   una   parte   danneggiata   del   proprio   corpo,   uno   dei   quali   si   compie   grazie  all’impiego   di   tessuto   indifferenziato,   mentre   l’altro   ha   luogo   a   partire   dal   tessuto  differenziato  adiacente  a  quello  perso.  Il  primo,  detto  epimorfosi,  coinvolge  cellule  staminali  adulte   capaci   di   differenziarsi   nei   tipi   cellulari   contenuti   nel   tessuto   danneggiato,   le   quali  raggiungono  la  parte  danneggiata,  proliferano,  si  differenziano  e  sostituiscono  le  cellule  perse.  Il   secondo,   chiamato   morfallassi,   prevede   una   riorganizzazione   delle   cellule   adiacenti   al  tessuto   danneggiato   (le   cellule   residue),   le   quali   dopo   essersi   dedifferenziate   e   magari  moltiplicate   (in   questo   processo   la   proliferazione   è   meno   tipica   e   accentuata   rispetto   che  nell’epimorfosi),  ri-­‐differenziano  nei  vari  tipi  cellulari  che  devono  sostituire.    La   formazione   del   pattern   (cioè   l’acquisizione,   da   parte   delle   cellule   che   andranno   a  ricostruire   il   tessuto  danneggiato,  di   forme  e   funzioni   specifiche  distinte)  nella  morfogenesi  (ossia  mentre   l’insieme   delle   cellule   sta   acquisendo   forma   e   struttura)   durante   il   processo  rigenerativo,   così   come  durante   lo   sviluppo  embrionale,   è   impostata  e  gestita  da   fattori   che  regolano   l’attività   genica,   i   quali   quindi   determinano   l’attivazione   di   determinati   geni,   e   di  conseguenza  il  cambiamento  dell’attività  e  del  comportamento  delle  cellule;  molti  dei  geni  che  vengono   attivati   sono   gli   stessi   che   erano   attivi   quando   il   tessuto   si   è   originato   durante   lo  sviluppo  dell’embrione.    Il   processo   di   differenziazione   cellulare   porta   una   cellula   a   specializzarsi,   acquisendo  competenze   e   funzioni   specifiche,   e  perdendo   (in   alcuni   casi   definitivamente)   la   capacità  di  trasformarsi  in  determinati  altri  tipi  cellulari  e  quindi  di  svolgere  altre  funzioni  specifiche.  I   cambiamenti   di   forma,   dimensione,   attività  metabolica   e   risposta   ai   segnali   che   la   cellula  intraprende   differenziandosi   sono   a   loro   volta   dovuti   a   delle   modifiche   controllate   che  avvengono  a  livello  di  espressione  genica.    Viceversa,   il   processo   di   dedifferenziamento   consiste   nel   ritorno   ad   uno   stadio   di   sviluppo  precedente   da   parte   di   una   cellula   completamente   o   parzialmente   differenziata,   la   quale  riacquista  così  la  possibilità  di  proliferare  e  di  differenziare  in  più  tipi  cellulari  diversi.      

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Cuore,  miocardio  e  cardiomiociti    Il   cuore   è   l’organo   cavo   presente   in   ogni   organismo   animale   possedente   l’apparato  circolatorio,   che   contraendosi   ritmicamente   funge   da   pompa   facendo   circolare   il   sangue  attraverso  i  vasi  sanguigni  dell’organismo  in  questione.    Esso   è   avvolto   dal   pericardio,   una   sottile   membrana   costituita   da   due   strati   (pericardio  fibroso  e  sieroso)  che  protegge  il  cuore,  lo  mantiene  fisso  al  suo  posto  e  ne  favorisce  il  corretto  funzionamento  concedendogli  una  certa  mobilità.    Le  pareti  cardiache  sono  formate  da  tre  tonache:  l’epicardio,  più  esterno,  costituito  da  tessuto  connettivo   e   ospitante   fibre   nervose   nonché   capillari   sanguigni   e   linfatici;   il   miocardio,  composto  dalle   fibre  muscolari   cardiache;   l’endocardio,   costituito   da   cellule   endoteliali,   che  agevola  lo  scorrimento  del  sangue  all’interno  del  cuore.    Il  miocardio  è   la   tonaca  che  costituisce   in  maniera  nettamente  preponderante   il   cuore,  ed  è  composto   di   cardiomiociti.   Possiede   delle   proprietà   intermedie   rispetto   a   quelle   dei   tessuti  muscolari  scheletrico  e  liscio,  in  quanto  presenta  le  striature  tipiche  del  primo  e  come  questo  garantisce  un’azione  rapida  e  potente,  ma,  come  il  secondo,  non  è  controllato  volontariamente,  è   resistente   allo   sforzo   prolungato   e   reagisce   allo   stimolo   elettrico   contraendosi   come  un’unica   fibra   (pur   non   essendolo   anatomicamente).   Le   cellule   del   miocardio   specifico  formano   il   sistema   di   conduzione   elettrica   del   cuore,   che   causa   e   conduce   la   stimolazione  elettrica   del   miocardio.   L’infarto   del   miocardio,   normalmente   dovuto   all’ostruzione   di  un’arteria   coronaria   (che   costituisce   la   via   per   il   trasporto   di   sangue   al   cuore),   porta   alla  necrosi  (morte)  di  parte  del  tessuto  miocardico  causata  dalla  carenza  di  ossigeno.    I   cardiomiociti,   ricoperti   da   una   particolare   membrana   estensibile   detta   sarcolemma,  contengono  molti  mitocondri,   indispensabili   per   fornire   alla   cellula   l’energia  necessaria   alla  contrazione   muscolare,   come   pure   le   catene   molecolari   che   permettono   tecnicamente   la  contrazione   stessa,   le   miofibrille,   la   cui   unità   fondamentale   è   il   sarcomero.    Esse   sono   formate   principalmente   da   due   tipi   di   proteine,   l’actina   (costituisce   i   filamenti  sottili)  e  la  miosina  (costituisce  i  filamenti  spessi),  le  quali  scorrono  l’una  sull’altra  durante  la  contrazione  muscolare,  causando  l’accorciamento  delle  miofibrille  e  quindi  del  muscolo  stesso.      

 

 

   

     

Figura  2  –  Porzione  di  miofibrilla  suddivisa  in  due  sarcomeri  delimitati  dalle  linee  Z,  rappresentata  tridimensionalmente  (in  alto),  mostrandone  una  sezione  (in  mezzo)  e  schematizzandone  la  catena  molecolare  che  la  costituisce  (in  basso)  (http://www.physioweb.org/muscular/sk_muscle.html)  

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Rigenerazione  del  tessuto  muscolare  cardiaco  nel  pesce  zebra  

Analisi  istologica  e  primi  indizi  sull’origine  delle  nuove  cellule    

Studi   che   risalgono   fino   a   quindici   anni   fa   riportano   della   capacità   del   pesce   zebra   di  rigenerare  varie  parti  del  suo  corpo,  mentre  da  almeno  dieci  anni  si  conosce  la  sua  capacità  di  rigenerare  fino  ad  un  quinto  del  tessuto  muscolare  cardiaco.  È  perciò  utile  iniziare  lo  studio  di  questo   fenomeno   biologico   riprendendo   il   contenuto   dell’articolo   del   2002   (Heart  regeneration   in   Zebrafish,   Poss   et   al.)   nel   quale   si   trova   la   prima   descrizione   di   tutto   il  processo   rigenerativo   analizzato   attraverso   numerose   osservazioni   istologiche   al  microscopio,  condotte  su  cuori  di  vari  individui  a  diversi  giorni  di  distanza  dall’amputazione  di  parte  (circa  il  20%)  del  ventricolo.      Tale   esperimento   è   stato   effettuato   su   esemplari   di   pesce   zebra   di   uno   o   due   anni   (quindi  relativamente  vecchi  e  perciò  già  oltre  la  fase  di  crescita),  ai  quali  è  stato  inciso  l’addome  e  poi  asportato  circa  un  quinto  del  ventricolo,  dopodiché  i  pesci  sono  stati  rimessi   in  acqua  senza  suturare  la  ferita.  Al  momento  di  studiare  gli  sviluppi  su  un  dato  esemplare,  si  è  proceduto  a  preparare  l’organo  all’analisi,  e  sono  state  poi  effettuare  diverse  sezioni  dell’intero  ventricolo.    Ad  un  giorno  dall’amputazione  si  osserva  un   coagulo   di   eritrociti   a   chiusura   della  ferita,   i  quali  nei  giorni  seguenti  vengono  gradualmente   sostituiti   da   fibrina,   che   è  massimamente   presente   attorno   ai   7-­‐9  giorni   di   distanza   dall’amputazione.                  In  questi  primi  giorni  gli  individui  operati  appaiono   meno   attivi   e   coordinati   nel  nuotare   rispetto   agli   organismi   di  controllo,   ma   tali   differenze   scompaiono  dopo  una  settimana  di  recupero.      Fra   il   nono   e   il   trentesimo   giorno   a   seguito   dell’amputazione   si   può   notare   invece   come   il  coagulo  di  fibrina  venga  progressivamente  sostituito  da  fibre  muscolari,  ed  arrivi  in  molti  casi  a   scomparire   entro   il   sessantesimo   giorno,   mentre   la   grandezza   e   la   forma   del   ventricolo  raggiungono   i   livelli   originali   e   il   muscolo   cardiaco   nel   suo   complesso   recupera  completamente  la  sua  normale  capacità  di  contrarsi.  

 Nello  stesso  studio  si   indaga  anche  sull’origine  delle  cellule  che  vanno  a  sostituire   il   tessuto  muscolare   andato   perso,   e   il   risultato   è   che   pare   siano   i   cardiomiociti   (cellule   del   cuore  completamente   differenziate)   ad   avere   la   straordinaria   capacità   di   proliferare   e   quindi  rigenerare  il  tessuto  muscolare  cardiaco.    L’esperimento   che   in   questo   studio   ha   portato   a   tale   risultato   ha   previsto   l’utilizzo   della  bromodeossiuridina   (BrdU)   come   marcatore   della   sintesi   di   DNA1   per   verificare   se   i  cardiomiociti   fossero   capaci   di   entrare   nuovamente   nel   ciclo   cellulare   e   fare   la   mitosi.    È  quindi  apparso  che  in  effetti,  dopo  sette  giorni  di  trattamento,  nei  cuori  in  rigenerazione  una  percentuale  più  alta  di  cardiomiociti  rispetto  a  quella  (bassissima)  registrata  per  gli  individui  di  controllo  incorpora  BrdU  nel  proprio  nucleo,  dimostrando  che  tali  cardiomiociti  svolgono  la  mitosi  (fatto  verificato  anche  osservando  la  presenza  di  uno  specifico  marcatore  della  mitosi),  e  che  quindi  potrebbero  proprio  essere  queste  cellule  all’origine  del  processo  rigenerativo.                                                                                                                  1  Vedi  il  primo  punto  dell’appendice  “Tecniche  di  laboratorio”  sulla  BrdU  come  marcatore  delle  cellule  in  mitosi  

Figura  3  –  Sezione  del  cuore  prima  e  dopo  l’amputazione  (Poss  et  al.  2002)  

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Uno  studio  del  2010   (Zebrafish  heart   regeneration  occurs  by   cardiomyocyte  dedifferentiation  and  proliferation,   Jopling  et  al.)   sembra  confermare   in  pieno   tale   ipotesi.  La   spiegazione  del  fenomeno  a  cui  giungono  gli  autori  prevede  che  le  nuove  cellule  provengano  da  cardiomiociti  che,  in  risposta  al  trauma  subito,  avrebbero  la  capacità  di  dedifferenziarsi,  proliferare  e  poi  ri-­‐differenziarsi  in  cellule  del  tessuto  muscolare  cardiaco.    Nei   prossimi   paragrafi   mi   riferirò   a   tale   recente   studio,   che   analizza   diversi   interessanti  aspetti  riguardanti  il  processo  rigenerativo  nel  pesce  zebra.  

I  cardiomiociti  rigenerati  derivano  da  altri  cardiomiociti    Con   lo  scopo  di  comprendere   in  quale  misura   i  cardiomiociti  completamente  differenziati  contribuiscano  alla  rigenerazione  del   tessuto   andato   perduto,   sono   stati   effettuati   degli  esperimenti   di   amputazione   su  degli   individui  di  Danio   rerio  nei   quali   i   cardiomiociti   erano   stati   marcati   geneticamente,  così   da   poter   osservare   se   questi   proliferino   o   meno    (tali   individui  appartenevano  a   linee  transgeniche  nelle  quali  un  complesso  processo  che  portava  alla  ricombinazione  genica  era   posto   sotto   il   controllo   di   un   promotore   specifico   dei  cardiomiociti,   e   ciò   faceva   sì   che   solo   tali   cellule   apparissero  evidenziate  dopo  la  ricombinazione  genica).    Dopo   aver   rimosso   circa   il   20   %   del   ventricolo,   è   stato  verificato   il   procedere  della   rigenerazione   cardiaca   a   7,   14   e  30  giorni  di  distanza  dall’amputazione:  mentre  dopo  7  giorni  il   tessuto   rimosso   appare   sostituito   da   un   coagulo   di  fibrina/collagene,   a   14   giorni   di   distanza   buona   parte   del  processo   rigenerativo  ha   avuto   luogo   e   i   nuovi   cardiomiociti  appaiono   tutti   marcati   geneticamente;   la   stessa   cosa   la   si  osserva   anche   30   giorni   dopo   l’amputazione,   quando   la  rigenerazione  è  completa  (Figura  4,  tratteggio  =  taglio).          Ciò  sembra  dimostrare  che  i  nuovi  cardiomiociti  hanno  tutti  avuto  origine  da  cardiomiociti  già  presenti  e   farebbe  escludere  altre  fonti  (cadono  le   ipotesi  che  facevano  riferimento  a  cellule  staminali);  resta  da  comprendere  in  che  modo  questo  processo  avvenga.      Per   verificare   tale   risultato,   anche   in   questo   studio   è   stato   effettuato   un   esperimento  utilizzando  la  bromodeossiuridina,  svolto  in  maniera  ancora  più  efficace  grazie  al  fatto  di  aver  potuto  marcare   i   cardiomiociti   come   nell’esperimento   appena   descritto:   i   pesci   zebra   i   cui  cardiomiociti   erano   stati  marcati   geneticamente   sono   stati   trattati   con   bromodeossiuridina  (BrdU)  per  7  giorni  dopo  l’amputazione,  e  a  14  giorni  dall’amputazione  è  stato  osservato  un  notevole   aumento   dei   cardiomiociti   marcati   geneticamente   e   contenenti   BrdU   rispetto   che  negli  organismi  di  controllo  non  amputati.  Questo  dimostra  che  i  cardiomiociti  sono  rientrati  nel   ciclo   cellulare   e   svolgono   la   replicazione   del   DNA,   e   che   quindi   sono   all’origine   del  processo  rigenerativo.    Inoltre   si   è   osservato   che   i   cardiomiociti  marcati   con   BrdU,   pur   trovandosi   principalmente  attorno  alla  regione  amputata,  si  possono  ritrovare  anche  in  altre  aree  del  cuore,  suggerendo  che  il  processo  rigenerativo  potrebbe  coinvolgere  tale  organo  nel  suo  complesso.  

Figura  4  -­  Anche  i  nuovi  cardiomiociti  sono  marcati  geneticamente  (Jopling  et  al.  2010)  

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Dedifferenziandosi  i  cardiomiociti  si  separano  e  al  loro  interno  i  sarcomeri  si  disorganizzano    Un  primo  tentativo  di  comprendere  il  meccanismo  di   dedifferenziazione   dei   cardiomiociti  (necessario  perché  questi  possano  poi  proliferare  e   andare   a   ricostituire   il   tessuto   danneggiato)   è  stato   effettuato   osservando   il   processo  rigenerativo  al  microscopio  elettronico.  Mentre  in  situazioni   normali   (in   cuori   sani)   i   cardiomiociti  mostrano   una   sistemazione   ordinata   di  mitocondri   e   sarcomeri   con   linee   Z   ben   visibili   e  definite,   nei   cardiomiociti   dei   cuori   che   si   stanno  rigenerando   si   osserva   che   le   strutture   dei  sarcomeri  si  sono  disorganizzate  e  non  si  possono  più   individuare   le   linee   Z,   inoltre   gli   stessi  cardiomiociti   si   separano   l’uno   dall’altro   e   si  rendono   visibili   ampi   spazi   intercellulari.   In  questo   modo   è   stato   anche   possibile   contare   il  numero  di   cardiomiociti   nei  quali   avvenivano   tali  modifiche   strutturali   ed   è   stato   constatato   un  picco   attorno   al   settimo   giorno   a   seguito  del’amputazione.      Inoltre   la   distribuzione   dei   cardiomiociti   che   stanno   dedifferenziandosi   assomiglia  molto   a  quella  dei  cardiomiociti  marcati  con  BrdU  (cioè  quelli  che  erano  rientrati  nel  ciclo  cellulare).      Un   altro   esperimento   nello   stesso   studio   ha   permesso   di   verificare   definitivamente   che   nei  cardiomiociti   in   duplicazione   (cioè   quelli   che   prolifereranno)   le   strutture   sarcomeriche   si  disorganizzano.  Ciò  è  stato  osservato  in  due  modi  diversi:  in  un  caso  utilizzando  un  marcatore  di  cellule  che  intraprendono  la  mitosi  e  nell’altro  un  marcatore  di  cellule  in  proliferazione.    In  entrambi  i  casi  le  cellule  marcate  risultavano  prive  di  strutture  sarcomeriche  organizzate.  

Cambiamenti  nell’espressione  genica  associati  al  processo  rigenerativo    L’ultimo   ambito   di   ricerca   esplorato   nello   studio   di   Jopling   et   al.   è   quello   dell’espressione  genica  (la  cui  analisi  permette  generalmente  di  comprendere  meglio  ogni  fenomeno  biologico  che  avviene  in  un  organismo).  In  particolare  è  stata  analizzata  l’espressione  dell’enzima  polo  like  kinase  1   (plk1),  un  regolatore  del   ciclo  cellulare  per   il  quale  era  già   stato  constatato  un  aumento  dell’espressione  durante   il   processo   rigenerativo.   Tale   aumento  dell’espressione   è  stato  confermato  da  questo  studio,  il  quale  per  determinare  il  ruolo  di  questo  enzima  durante  la  rigenerazione  del  cuore  nel  pesce  zebra  ha  previsto  ulteriori  esperimenti.      Tali  esperimenti,  svolti  sia  su  embrioni  nei  quali  erano  stati  eliminati  tutti  i  cardiomiociti  che  su  individui  adulti  di  Danio  rerio  ai  quali  era  stata  asportata  parte  del  cuore,  hanno  mostrato  che   questi   organismi   in   presenza   di   un   inibitore   dell’enzima   plk1   riescono   a   rigenerare  normalmente   il  muscolo   cardiaco   danneggiato   solamente   nel   17%   dei   casi,   contro   un   67%  risultante   in   assenza   di   tale   inibitore   (le   cifre   si   riferiscono   in   particolare   all’esperimento  svolto  sugli  embrioni  di  pesce  zebra).  Questi  risultati  indicano  che  l’enzima  plk1  ha  un  ruolo  fondamentale  durante  la  rigenerazione  del  cuore  nel  pesce  zebra.  

Figura  5  -­  La  presenza  nello  stesso  cardiomiocita  di  fibre  di  miosina  che  lo  percorrono  sia  longitudinalmente  che  trasversalmente  sono  indice  di  disorganizzazione  e  mancanza  di  struttura  (Jopling  et  al.  2010)  

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Poiché   altri   studi   hanno   esaminato   in   maniera   più   ampia   e   sistematica   i   cambiamenti  nell’espressione   genica   durante   la   rigenerazione   del  muscolo   cardiaco   nel   pesce   zebra,   per  avere  un  quadro  più  completo  a  riguardo  di  questo  complicato  processo,  del  quale  molti  aspetti  devono  ancora  essere  chiariti,  riporto  i  risultati  ottenuti  da  uno  di  questi  studi  in  particolare,  risalente  al  2006  (Gene  Expression  Analysis  of  Zebrafish  Heart  Regeneration,  Lien  et  al.).      In  tale  studio  è  stata  utilizzata  la  tecnica  del  microarray2  per  ottenere  i  profili  dell’espressione  genica  di  cuori  in  rigenerazione  a  3,  7  e  14  giorni  di  distanza  dall’amputazione.  Fra  le  migliaia  di  trascritti  individuati,  ne  sono  stati  identificati  662  che  venivano  espressi  in  maniera  diversa   (cioè   in  modo  maggiore  o  minore)   in  almeno  uno  dei   tre  momenti  presi   in  esame.   Successivamente   questi   662   geni   espressi   in  modo   variabile   sono   stati   suddivisi   in  base  a  quella   che  si   crede  essere   la   loro   funzione  ed  al  periodo  nel  quale  vengono  espressi,  così  da  riassumere  ed  ordinare   i  vari  meccanismi  che  compongono   il  processo  rigenerativo.      

Il   quadro   che   ne   risulta   è   il  seguente:   i   geni   responsabili   della  reazione   al   ferimento   e   della  risposta   infiammatoria   vengono  espressi  presto  durante  il  processo  rigenerativo;   l’espressione   di   una  serie  di  proteine  secrete  si  osserva  già   3   giorni   dopo   l’amputazione   e  raggiunge   il   picco   altri   4   giorni  dopo;   diversi   geni   che   codificano  per   fattori   di   crescita   e   proteine  secrete  sono  fortemente  espressi  a  3   giorni   dall’amputazione   e  probabilmente   sono   collegati   al  processo  di  guarigione  della  ferita,  e   i   dati   che   riguardano  l’espressione   di   alcuni   di   essi  ottenuti   con   l’analisi   microarray    sono   stati   confermati   attraverso  RT-­‐PCR3,  mettendo   in   evidenza   in  particolare   la   forte   espressione    dei   geni   apoEb,   vegfc   e   granulin   A    a   3   giorni   di   distanza  dall’amputazione;   altri   geni  codificanti   per   molecole   coinvolte  nella   regolazione   della   matrice  extracellulare   vengono   espressi   a  partire   da   7   giorni   dopo  l’amputazione   e   sono   ancora  espressi  7  giorni  dopo,  suggerendo  che   un   rimodellamento   estensivo  del   tessuto   avviene   in   stadi   più  tardivi   del   processo   rigenerativo.    

                                                                                                               2  Vedi  il  secondo  punto  dell’appendice  “Tecniche  di  laboratorio”    3  Vedi  il  terzo  punto  dell’appendice  “Tecniche  di  laboratorio”    

Figura  6  –  Raggruppamento  di  vari  geni  in  base  al  modo  in  cui  la  loro  espressione  cambiava  lungo  il  periodo  rigenerativo  (A,  rosso  e  verde  indicano  rispettivamente  forte  e  debole  espressione);  tendenza  generale  dell’evoluzione  dell’espressione  per  i  tre  diversi  gruppi  (B);  risultati  di  una  RT-­PCR  per  un  sottogruppo  di  geni  codificanti  per  fattori  di  crescita  e  proteine  secrete,  che  confermano  quelli  ottenuti  tramite  analisi  microarray  (C)  (Lien  et  al.  2006)  

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È  stato  poi  effettuato  un  confronto  fra  i  profili  dell’espressione  genica  della  rigenerazione  del  cuore  e  della  pinna  nel  pesce  zebra  per  ricercare  possibili  meccanismi  comuni  ai  due  processi:  132  dei  662  geni  espressi  in  maniera  variabile  durante  la  rigenerazione  del  muscolo  cardiaco  appaiono  espressi  ugualmente  in  modo  variabile  nel  corso  della  rigenerazione  della  pinna  (fra  di   essi   c’è   il   gene   mps1,   che   codifica   per   una   proteina   appartenente   ad   una   famiglia   di  regolatori  della  mitosi,  del  quale  durante  entrambi  i  processi  viene  aumentata  la  trascrizione,  cosa   che   conferma   le   precedenti   osservazioni   che   vedevano   degli   organismi   mutanti   per  questo   gene   fallire   in   ambedue   i   processi   di   rigenerazione);   fra   questi   132   geni,   hanno   un  ruolo   importante   quelli   che   regolano   la   matrice   extracellulare   e   quelli   che   codificano   per  molecole  di   adesione,   indicando   che   il   rimodellamento  del   tessuto  e   la  migrazione   cellulare  sono   meccanismi   importanti   in   entrambi   i   processi   rigenerativi;   molto   più   numerosi   sono  invece   i   trascritti   variabilmente   espressi   solamente   durante   uno   dei   due   processi   di  rigenerazione,  dato  che,  unito  ai  precedenti,   fa  pensare  che  oltre  ad  un   insieme  di  molecole  regolate   similarmente   durante   i   due   processi   rigenerativi   e   quindi   comuni   ad   entrambi   vi  siano  anche  molti   fattori  tessuto-­‐specifici  che  entrano  in  gioco  solo  nell’uno  o  nell’altro  caso  (fatto  per  nulla  sorprendente,  dato  che   i   tipi  di  cellule  coinvolti   sono  molto  differenti  e  che,  mentre  a   livello  cardiaco   la  rigenerazione  ha  origine  a  partire  da  cardiomiociti  differenziati,  nella  pinna  è  un  ammasso  di  cellule  staminali  pluripotenti  a  dare  il  via  a  tale  processo).    Per   investigare   l’origine   del   processo   rigenerativo   sono   stati   individuati   alcuni   geni   che  codificano  per  proteine  secrete  e  fattori  di  crescita  che  presentano  un’aumentata  espressione  nei  primi  giorni  seguenti  l’amputazione  e  ne  è  stata  studiata  l’espressione  spaziale  attraverso  l’ibridazione   in   situ4.     Molti   cardiomiociti   in   proliferazione   sono   osservabili   attorno   alla  regione   dell’amputazione,   ed   in   effetti   è   proprio   in   questa   zona   che   è   stata   osservata  l’espressione   di   tali   geni,   i   quali   potrebbero   quindi   essere   coinvolti   nel   meccanismo   di  iniziazione  del  processo  rigenerativo  (soprattutto  vista   la  natura  dei  prodotti  di   tali  geni,   in  quanto   tale   fase   di   inizio   deve   prevedere   con   ogni   probabilità   la   produzione   di   fattori   di  crescita  e  proteine  segnale  atte  alla  comunicazione  fra  le  cellule).    Allo  scopo  di  determinare   la   funzione  di  alcuni   fattori   secreti   identificati  attraverso   l’analisi  dell’espressione  genica  a  livello  cellulare  si  è  lavorato  anche  su  cardiomiociti  coltivati  in  vitro,  e  si  è  osservato  che  essi  in  coltura  attraversano  una  fase  di  dedifferenziamento  caratterizzata  dalla  disorganizzazione  delle  strutture  sarcomeriche  al  loro  interno.  È  stato  sperimentato  per  diversi  fattori  l’effetto  che  essi  hanno  nell’indurre  sintesi  di  DNA  nei  cardiomiociti.  L’unico  di  questi   fattori   a   determinare   un   certo   aumento   nell’incorporazione   di   BrdU   da   parte   dei  cardiomiociti   (fatto   che   indica   appunto   una   maggiore   sintesi   di   DNA)   è   stato   il   PDGF-­‐BB  (proteina   che   nell’uomo   ha   proprio   il   ruolo   di   fattore   di   crescita),   anche   se   non   è   stata  individuata  attività  mitotica  fra  i  cardiomiociti  trattati  con  tale  proteina.    Per  comprendere  il  ruolo  di  tale  fattore  durante  la  rigenerazione  del  muscolo  cardiaco  in  vivo  è   stato   sperimentato   l’effetto   che   l’AG1295,   una   molecola   che   inibisce   selettivamente   una  particolare  attività  del  PDGFR  (recettore  dei  PDGF),  ha  sulla  sintesi  di  DNA  nei  cardiomiociti.  Individui   trattati   con   tale   inibitore   a  partire  dal   secondo  giorno  dopo   l’amputazione  per  12  giorni,  mostrano  il  16  %  in  meno  di  cellule  BrdU  positive  rispetto  agli  organismi  di  controllo;  quindi  una  buona  porzione  di  cardiomiociti  non  ha  potuto  svolgere  la  sintesi  del  DNA  a  causa  dell’inibizione   del   recettore   dei   PDGF.   Ciò   indica   che   la   segnalazione   attraverso   PDGF   è  necessaria   per   la   proliferazione   di   almeno   una   parte   dei   cardiomiociti   durante   la  rigenerazione  cardiaca.  

                                                                                                               4  Vedi  il  quarto  punto  dell’appendice  “Tecniche  di  laboratorio”    

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Riflessione  sui  metodi  della  ricerca  ed  esposizione  della  tecnica  di  cryoinjury    Gli   ultimi   dati   e   relativi   risultati,   come   un   po’   tutta   la   parte   riguardante   i   cambiamenti  nell’espressione   genica   associati   al   processo   rigenerativo,   mostrano   come   la   ricerca   debba  muoversi  passo  dopo  passo,  processando  un’enorme  quantità  di  dati  ed  eseguendo  numerosi  esperimenti  per  determinare  per  esempio  il  ruolo  di  ogni  singola  molecola.  La  formulazione  di  ipotesi   intelligenti  può  consentire  allo   studio  di  avanzare  più  velocemente,  ma   la  verifica  di  ognuna  di  queste   ipotesi   richiede   comunque  esperimenti   specifici   che  devono  dare   risultati  chiari   (la   cui   interpretazione   deve   essere   oggettiva   e   incontestabile),   e   data   la   loro  numerosità,  la  loro  esecuzione  richiede  molto  tempo,  oltre  che  mezzi  tecnologici  avanzati.      A  questo  proposito  è  utile  rilevare  che  una  grande  importanza  in  questo  senso  è  rivestita  dai  metodi   utilizzati   negli   studi   biologici   (e   ovviamente  non   solo   in   questi).   Rimanendo   al   caso  specifico  degli  studi  sulla  capacità  del  pesce  zebra  di  rigenerare  parte  del  muscolo  cardiaco,  considerando  come  regola  generale  che  gli  esperimenti  devono  essere  comparabili  fra  loro  e  riprodurre  situazioni  il  più  possibile  simili  a  quelle  che  si  creano  in  natura,  è  stato  proposto  da  più   parti   di   sostituire   la   tecnica   dell’amputazione   del   ventricolo   con   quella   di   cryoinjury,   e  quindi  di  riprodurre  in  maniera  più  fedele  le  lesioni  conseguenti  ad  un  infarto  del  miocardio  congelando  e  poi  scongelando  rapidamente  la  determinata  porzione  di  ventricolo,  ottenendo  in   tal  modo  risultati  più  significativi  e   facilmente  comparabili   con  quelli  ottenuti  dagli   studi  sui   mammiferi.   In   particolare,   un   articolo   di   quest’anno   (2012)   di   due   ricercatori  dell’università   di   Friburgo   (Induction   of   Myocardial   Infarction   in   Adult   Zebrafish   Using  Cryoinjury,  Chablais  and  Jaźwińska)  propone  in  maniera  molto  accurata  delle  precise  modalità  secondo  le  quali  utilizzare  tale  tecnica,  illustrando  in  seguito  che  tipi  di  studio  possono  essere  effettuati   sui   cuori   di   pesce   zebra  danneggiati   criogenicamente,   e   sostenendo  per   l’appunto  che   l’utilizzo   di   tale  metodo   porta   a   risultati   sotto   certi   punti   di   vista   più   attendibili   e   più  facilmente  confrontabili  con  quelli  che  si  hanno  per  gli  esperimenti  analoghi  sui  mammiferi.  Gli  stessi  autori,  parallelamente  ad  altri  gruppi  di  ricercatori,  avevano  mostrato  già  un  anno  fa  che   anche   i   pesci   zebra   ai   quali   viene  danneggiato   il   ventricolo   criogenicamente   riescono   a  rigenerare   la   parte   danneggiata,   dimostrando   in   maniera   ancora   più   efficace   che   una  rigenerazione  del  muscolo  cardiaco  a  seguito  di  un  fenomeno  molto  simile  ad  un  infarto  del  miocardio  è  possibile  nel  pesce  zebra.    Ad   ogni   modo   la   ricerca   dovrà   procedere   ancora   a   lungo   perché   si   riesca   a   svelare   ogni  particolare  riguardante  il  processo  di  rigenerazione  del  muscolo  cardiaco  nel  pesce  zebra  e  a  ottenere   così   tutti   i   tasselli   che   compongono   questo   complesso  mosaico,   il   quale   potrebbe  apparirci  più  chiaro  in  ogni  sua  parte  solo  una  volta  completo.  Nonostante  ciò,  ho  cercato  di  dare   una   visione   d’insieme   completa   a   grandi   linee   riguardo   a   ciò   che   si   è   scoperto   finora,  scendendo   più   nel   dettaglio   di   tanto   in   tanto   per  mostrare   la  mole   di   lavoro   necessaria   ad  arrivare  a  determinati  risultati  e  caratterizzare  un  po’  meglio  le  modalità  secondo  le  quali  la  ricerca  viene  condotta.                

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Rigenerazione  del  tessuto  muscolare  cardiaco  nei  mammiferi    Dopo  aver  presentato   il   contenuto  di  alcuni  articoli   scientifici   che  affrontano   lo  studio  della  capacità   rigenerativa  del  pesce  zebra,  nella   seconda  parte  di  questo  LAM  descriverò   i  primi  recenti   studi   condotti   allo   scopo   di   comprendere   se   in   situazioni   particolari   anche   nei  mammiferi  sia  possibile  che  lo  stesso  fenomeno  rigenerativo  abbia  luogo  e  se  in  qualche  modo  esso  possa  essere   indotto.   In  particolare  comincerò  esponendo  un  esperimento  condotto  su  cardiomiociti   di   Rattus   norvegicus,   contenuto   in   un   articolo   pubblicato   nel   2010  (Dedifferentiation   and   Proliferation   of   Mammalian   Cardiomyocytes,   Zhang   et   al.)   di   poco  successivo   a   quello   di   Jopling   et   al.   che   descrive   la   dedifferenziazione   e   seguente  proliferazione   dei   cardiomiociti   nel   pesce   zebra;   quest’ultimo   articolo   viene   infatti   citato  nell’introduzione  e  nella  parte  di  discussione  di  quello  che  esporrò  nei  prossimi  paragrafi.  

I  cardiomiociti  di  Rattus  norvegicus  coltivati  in  vitro  si  dedifferenziano      Per  poter  studiare   in  vitro   in  maniera  specifica  lo  sviluppo  dei  cardiomiociti  di  R.  norvegicus  senza   influenze   di   altri   tipi   cellulari,   la   prima   parte   di   questo   esperimento   ha   previsto   la  purificazione  dei  campioni  provenienti  dai  cuori  di  ratti  di  5-­‐8  settimane  così  da  conservarne  solamente   i   cardiomiociti.   Tali   campioni   sono   stati   poi   ulteriormente   analizzati   osservando  l’espressione  di  determinati  marcatori  di  tipo  cellulare,  in  modo  da  accertarne  la  purezza.      Tali   cardiomiociti   sono   poi   stati   coltivati   in   un  medio   ricco   di   una   sostanza  mitogena   (cioè  capace  di   indurre  la  mitosi).   Il  primo  risultato  è  stato  che  tali  cellule  hanno  cambiato  forma,  appiattendosi,   ed   hanno   perso   le   loro   peculiari   striature;   inoltre   entro   6-­‐8   giorni   hanno  iniziato  a  dividersi,  continuando  nel  frattempo  a  perdere  le  caratteristiche  fenotipiche  proprie  dei  cardiomiociti  e  procedendo  quindi  nel  percorso  di  dedifferenziazione.    

Analisi  dell’avanzamento  dei  cardiomiociti  attraverso  il  ciclo  cellulare    Studiando   l’espressione   dei  marcatori   Ki67   e   istone   H3   nonché   l’incorporazione   di   BrdU   è  stato  possibile  seguire  i  cardiomiociti  in  coltura  che  hanno  attraversato  il  ciclo  cellulare.  In  particolare,  dopo  due  giorni   in  coltura  è  stata  osservata   l’espressione  della  proteina  Ki67  (marcatrice   di   cellule   in   proliferazione)   nell’11%   circa   dei   cardiomiociti   atriali   esaminati,  contro  un  6%  in  quelli  ventricolari,  per  giungere  ad  un  picco  dell’80%  e  rispettivamente  del  46%   circa   dopo   11   giorni   in   coltura.   Per   quanto   riguarda   l’istone   H3,   utile   ad   individuare  cellule   che   attraversano   la   fase   M   (mitosi)   del   ciclo   cellulare,   e   l’incorporazione   di   BrdU,  indicante   l’attraversamento   della   fase   S   (di   duplicazione   del   DNA),   è   stato   osservato   un  aumento  progressivo  delle  cellule  positive  a  questi  due  marcatori  arrivando  ad  un  picco  dopo  una   settimana   in   coltura.   Anche   in   questo   caso,   il   rapporto   fra   cellule   positive   e   totali   è  risultato   più   alto   per   i   cardiomiociti   atriali   che   per   quelli   ventricolari.   Sono   state   inoltre  osservate  cellule  in  profase,  anafase  e  telofase.      Per  comprendere  più  a  fondo  il  fenomeno  e  le  differenze  fra  cardiomiociti  atriali  e  ventricolari,  è   stata   esaminata   l’espressione   di   diversi   importanti   regolatori   del   ciclo   cellulare   in  cardiomiociti  appena  isolati  e  in  altri  in  coltura  da  5  giorni.  In  ognuno  dei  casi  è  risultato  che  l’espressione   di   inibitori   del   ciclo   cellulare   nei   cardiomiociti   atriali   da   poco   isolati   era   più  bassa   che   in   quelli   ventricolari,   e   che   dopo   5   giorni   in   coltura   era   diminuita   nettamente   in  tutte  e  due  le  specie  cellulari.  Tali  dati  spiegano  il  maggior  numero  di  cardiomiociti  atriali  che  attraversano  il  ciclo  cellulare,  come  pure  l’aumentare  dei  cardiomiociti  in  proliferazione  con  il  procedere  del  processo  di  dedifferenziazione,  giorno  dopo  giorno.  

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Prove  che  le  cellule  derivanti  dai  cardiomiociti  si  dedifferenziano  e  poi  ri-­‐differenziano    Dato   che   le   cellule   originate   dai   cardiomiociti   in   coltura   proliferavano   e   assomigliavano   in  forma  e  dimensione  a  cellule  cardiache  progenitrici,   si  è   cercato  di   capire  se   fosse  possibile  individuare   in   loro   alcuni   elementi   caratteristici   di   tali   cellule,   ed   infatti   vari   elementi   in  comune   sono   stati   trovati.   In   particolare,   si   è   osservato   che   le   cellule   derivate   dai  cardiomiociti   non   esprimono   più   la   catena   α-­‐MHC,   caratteristica   dei   cardiomiociti   maturi,  mentre  esprimono  trascritti  di  CD90,  proprio  delle  cellule  staminali  mesenchimali  e  di  altre  specie   di   staminali.   Inoltre,   tali   cellule   sono   risultate   positive   per   il   marcatore   di   cellule  staminali   c-­‐kit,   non   presente   in   principio   in   alcuno   dei   cardiomiociti   originali   (era   fra   i  presupposti   perché   il   campione   fosse   definibile   puro).   Infine   si   è   osservato   che   in   una   fase  successiva  le  cellule  esprimono  nuovamente  i  trascritti  per  la  catena  proteica  α-­‐MHC,  mentre  cala  nettamente   l’espressione  di   c-­‐kit;   in   tale   fase,   che   sembra   corrispondere   a  quella  di   ri-­‐differenziazione  delle  cellule,  molte  di  esse  si  raggruppano  in  sfere.    In  aggiunta,   sono  stati   rilevati   importanti   cambiamenti  per  quanto  riguarda  certi  microRNA  regolatori,   in   quanto   il   livello   di   alcuni   di   essi,   cardiospecifici   oppure   che   reprimono   la  staminalità   o   il   ciclo   cellulare,   si   era   ridotto   di   parecchio   nelle   cellule   derivate   dai  cardiomiociti,  mentre  quello  di  altri,  necessari  alla  proliferazione,  è  aumentato  notevolmente.    Tutto   ciò   sembra   descrivere   con   linearità   il   percorso   di   queste   cellule   attraverso   la  dedifferenziazione,   lo   svolgimento   del   ciclo   cellulare   e   la   riacquisizione   del   fenotipo   di   una  cellula   progenitrice;   in   seguito,   come   già   accennato,   le   cellule   sembrano   ri-­‐differenziarsi  spontaneamente  mentre  si  raccolgono  in  sfere.    Il   passo   seguente   è   stato   lo   studio   più  approfondito   delle   sfere   nelle   quali   il   20-­‐40%  delle   cellule   derivate   dai   cardiomiociti   si  organizza  dopo  qualche  giorno  in  coltura  (7A).  Spesso   queste   si   contraggono   ritmicamente,  dimostrando  capacità  di  accoppiamento  eccito-­‐contrattile.   Inoltre   è   stata   osservata  l’espressione  non  solo  di  α-­‐MHC  (7B),  ma  anche  della   proteina   Cx43,   costituente   le   giunzioni  gap  cardiache,  nonché  del  marcatore  di   cellule  endoteliali  CD31  (7C).  È  perciò  rilevante  notare  come  una  fonte  di  soli  cardiomiociti  sia  stata  in  grado   di   generare,   in   aggiunta   a   nuovi  cardiomiociti,   anche   delle   cellule   endoteliali.    Ciò   testimonia   il   grande   potenziale   che   le  cellule   derivate   da   cardiomiociti   possiedono,  perlomeno  quando  coltivate  in  vitro,  anche  se  è  importante   rilevare   che   i   cardiomiociti   di  partenza   provengono   da   esemplari   molto  giovani,  e  che  le  loro  caratteristiche  potrebbero  modificarsi  negli  individui  adulti.      

Figura  7  -­  Sfere  di  cellule  derivate  dai  cardiomiociti  e  relative  proteine  espresse  (Zhang  et  al.  2010)  

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Studio  ex  vivo  di  cardiomiociti  di  R.  norvegicus  marcati  grazie  a  modifiche  genetiche    Un   ultimo   esperimento,   utile   a   confermare   le   ipotesi   fatte   fin   qui   togliendo   ogni   dubbio  riguardo   ad   una   possibile   contaminazione   dei   campioni   di   cardiomiociti   utilizzati   nei  precedenti   esperimenti,   ha   previsto   di   osservare   la   dedifferenziazione   dei   cardiomiociti   ex  vivo   (cioè  sempre   in  coltura,  ma  assieme  alle  altre  cellule  appartenenti  al   tessuto  muscolare  cardiaco),   coltivando   del   tessuto   appartenente   a   ratti   geneticamente  modificati   in  modo   da  poterne  riconoscere  inequivocabilmente  i  cardiomiociti  con  tecniche  di  immunofluorescenza.    È  stato  così  possibile  osservare  che,  nonostante  le  prime  cellule  che  si  sono  viste  proliferare  dopo  pochi  giorni  non  fossero  cardiomiociti,  dopo  10  giorni  in  coltura  anche  le  cellule  marcate  come   cardiomiociti   hanno   iniziato   a   moltiplicarsi,   e   dopo   3   settimane   in   coltura   molte   di  queste  avevano  originato  cellule  c-­‐kit  positive,  cioè  staminali.  Allo  stesso  tempo  si  sono  anche  osservate  nuove   cellule   c-­‐kit   +   non  marcate   come   cardiomiociti,   a   indicare   che  questi   ultimi  non  sono  l’unica  fonte  di  nuove  cellule  staminali  presente  nel  cuore.  

     

 

 

 

 

 

 

 

       Figura  8  -­  Cellule  di  origine  cardiomiocitica  (in  verde);          cellule  c-­kit+  (in  rosso);  cellule  di  origine  cardiomiocitica          c-­kit+  (in  giallo)  (Zhang  et  al.  2010)  

Tali   esperimenti   hanno   quindi   rivelato   una   capacità   non   conosciuta   dei   cardiomiociti   di  R.  norvegicus,  dimostrando  come  non  sia  valida  la  regola  che  voleva  i  mammiferi   incapaci  di  intraprendere   in   nessun   caso   un   processo   rigenerativo   a   livello   del   tessuto   muscolare  cardiaco.  Ovviamente   in  questi  esperimenti   tale   risultato  è  stato  ottenuto  solo   in  condizioni  artificiali   su   cellule   in   coltura   e   a   partire   da   cardiomiociti   appartenenti   a   individui   molto  giovani,  ma  è  molto  interessante  notare  la  grande  somiglianza  fra  il  processo  qui  osservato  e  quello   intrapreso   dai   cardiomiociti   del   pesce   zebra   a   seguito   dell’amputazione   di   parte   del  ventricolo,   i   quali   pure   si   dedifferenziano,   proliferano   e   poi   si   ri-­‐differenziano,   fatto   che  potrebbe   far   pensare   che   alcuni   aspetti   della   capacità   posseduta   dal   pesce   zebra   si   siano  conservati   negli   animali   più   complessi   quali   i  mammiferi,   anche   se   questi   non   appaiono   in  grado  di  svolgere  il  processo  rigenerativo  nella  sua  interezza.    Questi   risultati   danno   adito   a   speranze   per   quanto   riguarda   l’individuazione   di   possibili  “capacità  nascoste”  possedute  anche  dai  cardiomiociti  umani,  che  potrebbero  essere  sfruttate  per  sviluppare  nuove  terapie  per  guarire  i  pazienti  che  hanno  subito  un  infarto  del  miocardio.        Nel   prossimo   paragrafo   riporto   i   risultati   di   uno   studio   del   2001   (Evidence   That   Human  Cardiac  Myocytes  Divide  after  Myocardial   Infarction,  Beltrami  et  al.)  nel  quale  si  è  cercato  di  capire  se  dopo  un  infarto  i  cardiomiociti  iniziano  almeno  in  parte  a  moltiplicarsi.  

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In  cuori  umani  che  hanno  subito  un  infarto  sono  presenti  cardiomiociti  in  proliferazione    Per  questo  studio,  condotto  allo  scopo  di  capire  se  nei  cuori  umani  infartuati  una  porzione  più  alta  di  cardiomiociti  rispetto  al  normale  rientri  nel  ciclo  cellulare  per  moltiplicarsi,  sono  stati  utilizzati   tredici   cuori   provenienti   da   pazienti   morti   pochi   giorni   dopo   un   infarto   (sette  appartenenti  a  uomini  e  sei  a  donne,  la  cui  età  media  era  64  anni)  e  altri  dieci  provenienti  da  cinque   donne   e   cinque   uomini,   la   cui   età   media   era   61   anni,   morti   non   per   malattie  cardiovascolari,   utilizzati   come   controllo.   Nei   cuori   infartuati,   i   campioni   di   tessuto   da  analizzare  sono  stati  prelevati  sia  da  una  zona  prossima  al  tessuto  miocardico  necrotico  che  da   una   zona   del   ventricolo   distante   dalla   regione   danneggiata;   nei   cuori   impiegati   come  controllo  i  campioni  sono  stati  prelevati  da  regioni  comparabili.    La   preparazione   dei   campioni   prima   dell’osservazione   al  microscopio  ha  previsto  l’utilizzo  di   ioduro  di  propidio  per  evidenziare  il  DNA  (e  quindi  i  cromosomi)  di  ogni  cellula,  di  anticorpi  anti-­‐actina  α-­‐sarcomerica  per  colorare  in  maniera  specifica   i   cardiomiociti,   di   anticorpi   anti-­‐tubulina   per  l’individuazione   del   fuso   mitotico   e   di   anticorpi   contro  l’antigene   Ki-­‐67   per   evidenziare   le   cellule   Ki-­‐67+.   Ciò   ha  permesso  di  identificare  i  cardiomiociti,  di  osservare  quanti  di   questi   si   trovavano   in   una   delle   fasi   della   mitosi  (individuando   i   cardiomiociti   nei   quali   vi   era   il   fuso  mitotico,   il   quale   è   presente   nella   cellula   durante   tutta   la  mitosi,   oppure   riconoscendo   una   delle   fasi   del   processo  mitotico   dalla   configurazione   assunta   dai   cromosomi)   e   di  contare   le   cellule   esponenti   l’antigene   Ki-­‐67,   marcatore  delle  cellule  in  proliferazione.      È  stato  così  possibile  osservare  che  nei  cuori  infartuati  circa  il   4%   dei   cardiomiociti   prelevati   al   margine   del   tessuto  miocardico   deteriorato   presentava   l’antigene   Ki-­‐67,  percentuale   che   scende   attorno   all’1,5%   nei   cardiomiociti  prelevati  da  una  zona  del  ventricolo  distante  dalla   regione  danneggiata;   tali   percentuali   corrispondono   a   valori   84   e  rispettivamente  28  volte  maggiori   a  quello  osservato  per   i  cardiomiociti   provenienti   dai   cuori   non   infartuati   (per   i  quali   si   è   provveduto   a   calcolare   un   valore   unico,   dal  momento  che   le  percentuali  non  variavano  al  variare  della    regione  del  ventricolo  analizzata).      Per   quanto   riguarda   la   conta   dei   cardiomiociti   che   svolgevano   la  mitosi,   essi   sono   risultati  essere  quasi   lo  0,08%  di  quelli  provenienti  dalla   regione  al  margine  del   tessuto  necrotico  e  circa   lo   0,025%   di   quelli   provenienti   dalla   zona   più   distante,   valori   che   in   questo   caso  corrispondono  a  70  volte  e  rispettivamente  24  volte  quello  osservato  nei  cuori  non  infartuati.              

   Figura  9  -­  Cardiomiociti  umani  in        duplicazione  (cromosomi  in  verde)          (Beltrami  et  al.  2001)  

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Tali  dati  sono  in  contrasto  con  la  diffusa  teoria  secondo  la  quale  i  cardiomiociti  mammiferi,  e  nel   caso   specifico   quelli   dell’uomo,   sarebbero   incapaci   di   svolgere   la   mitosi,   e   sembrano  invece  indicare  che  il  nostro  cuore  possieda  una  subpopolazione  di  cardiomiociti  in  grado  di  rientrare  nel  ciclo  cellulare  e  quindi  di  moltiplicarsi  (a  questa  conclusione  giungono  gli  autori  dello   studio).   Il   fatto   che   la   proporzione   fra   cellule   Ki-­‐67+   (in   proliferazione)   e   cellule  osservate  in  mitosi  si  mantenga  attorno  ad  un  rapporto  di  50  a  1  sia  nelle  osservazioni  fatte  sui  cuori  infartuati  che  in  quelle  fatte  sui  cuori  di  controllo  sembra  provare  la  validità  dei  dati  e  può  essere  d’aiuto  per   stimare   la   lunghezza  del   ciclo   cellulare  dei   cardiomiociti;   infatti   se  consideriamo   30   minuti   come   tempo   medio   necessario   ad   una   cellula   per   completare   la  mitosi,  il  fatto  che  ad  un  dato  momento  se  ne  osservino  in  mitosi  un  cinquantesimo  di  quelle  marcate   come   in   proliferazione   indica   che   il   tempo   che   passa   fra   l’inizio   di   un   processo  mitotico  e  l’inizio  di  quello  successivo  (nella  stessa  cellula)  è  di  circa  50  x  30  min.  =  25  h.    Ma  se  almeno  parte  dei   cardiomiociti  umani  è   in  grado  di   rientrare  nel   ciclo   cellulare  e  poi  proliferare,   perché   il   nostro   organismo  non   è   in   grado  di   rigenerare   la   parte  del   ventricolo  danneggiata   in   seguito   ad   un   infarto?   L’ipotesi   formulata   dai   ricercatori   è   abbastanza  elementare,   e   spiega   semplicemente   che   i   cardiomiociti   non   sono   in   grado   di   ricostruire   il  tessuto  andato  danneggiato  “da  soli”,  bensì  sarebbe  necessario  che  altri  processi  avvenissero  contemporaneamente   alla   loro   moltiplicazione,   come   la   rimozione   del   tessuto   morto   o   la  creazione  di  strutture  fondamentali  quali  nuovi  vasi  sanguigni.      Rimane  quindi  da  valutare  se  un  indice  mitotico  pari  a  quello  osservato  nei  cuori  infartuati  sia  sufficientemente  alto  da  permettere  (in  teoria)  la  ricreazione  dei  cardiomiociti  andati  perduti.  Considerando   che   il   ventricolo   sinistro   di   un   cuore   sano   è   composto   in  media   da   5,5   x   109  cardiomiociti  e  che  mediamente  in  seguito  ad  un  infarto  ne  rimangono  3,8  x  109,  dato  l’indice  mitotico  calcolato  pari  a  circa  520  cardiomiociti  in  proliferazione  su  106  totali  (media  fra  i  775  su  106  trovati  nella  zona  marginale  e  i  264  su  106  trovati  nella  zona  più  distante  dalla  ferita),  è  possibile  stimare  per  estrapolazione  che  i  cardiomiociti  in  proliferazione  in  un  dato  momento  nel  ventricolo  sinistro   infartuato  siano  1˙976˙000,  e  che  se  tale   tasso  di  replicazione  rimane  stabile  gli  1,7  x  109  cardiomiociti  persi  possano  essere  rigenerati  in  18  giorni,  infatti:    

 1,98  x  106  x  48  x  18  =  1,7  x  109  

(cardiomiociti  in  replicazione  x  numero  di  cicli  mitotici  al  giorno  x  tot  di  giorni  =  cardiomiociti  rigenerati).    Tali  risultati  indicano  quindi  che  da  questo  punto  di  vista  non  è  così  inverosimile  pensare  al  nostro   cuore   che   rigenera  parte  di   sé   stesso  dopo   aver   subito  un   infarto,  ma   ciò  non  potrà  comunque  avvenire  se  parallelamente  non  si  producono  gli  altri  processi  biologici  necessari.    Questo  esperimento  mostra   anche   come  nel   cuore  umano   sia  presente  un   continuo,   seppur  poco   pronunciato,   turnover   dei   cardiomiociti,   dato   che   si   oppone   a   ciò   che   attualmente   la  comunità   scientifica   pensa   al   riguardo.   A   questo   proposito,   un   altro   interessante   articolo  scientifico  del  2009  (Evidence  for  Cardiomyocyte  Renewal   in  Humans,  Bergmann  et  al.)  porta  una  prova  consistente  di  questo  turnover,  perciò  ad  esso  dedicherò  il  prossimo  paragrafo.              

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Nei  cuori  umani  è  presente  un  continuo  turnover  di  cardiomiociti      In   questo   studio   è   stata   sfruttata   la   concentrazione   relativamente   abbondante   e   piuttosto  stabile  di  14C  (isotopo  radioattivo  del  carbonio)  nell’atmosfera  durante  la  Guerra  Fredda  per  stabilire   la   percentuale   di   nuovi   cardiomiociti   formatisi   in   quegli   anni   nei   cuori   di   diverse  persone  di  varia  età.  Ciò  è  stato  possibile  dal  momento  che  il  14C  che  si  disperse  a  quel  tempo  nell’atmosfera   a   causa   delle   esplosioni   nucleari   (al   tempo   furono   testate   molte   bombe  atomiche)  reagì  con  l’ossigeno  dell’aria  per  dare  14CO2,  il  quale  venne  incorporato  dalle  piante  tramite  la  fotosintesi,  e  quindi  dagli  uomini,  che  si  cibavano  direttamente  o  indirettamente  di  questi  vegetali.  Il  14C  è  stato  dunque  incorporato  anche  nel  DNA  delle  cellule  umane,  e  quindi  anche  nei  nuovi  cardiomiociti  che  si  sono  formati  in  quel  periodo  nelle  persone  vissute  allora,  testimoniando   con   la   sua   presenza   in   tali   cellule   la   capacità   della   popolazione   dei  cardiomiociti   umani   di   rinnovarsi   (in   quanto   un   cardiomiocita,   per   contenere   14C   in   alto  rapporto  rispetto  al  12C  normalmente  presente  nel  suo  DNA,  deve  essersi  formato  durante  il  periodo  nel  quale   tale   isotopo  del   carbonio  era  presente   in  quella  determinata   abbondanza  nell’atmosfera,  visto  che  il  materiale  genetico  di  una  cellula  non  viene  più  rinnovato  a  seguito  della  sua  ultima  duplicazione).    Innanzitutto   si   è   proceduto   a   datare   campioni   di   cellule   provenienti   dal   miocardio   del  ventricolo   sinistro   (quindi   sono   stati   presi   in   considerazione   altri   tipi   cellulari   oltre   ai  cardiomiociti)  attraverso  l’estrazione  del  DNA  dalle  cellule  e  la  determinazione  della  quantità  di  14C  contenuto  attraverso  la  spettrometria  di  massa  con  acceleratore  (tecnica  che  consente,  a   differenza   degli   altri   tipi   di   spettrometria   di   massa,   di   separare   tramite   un’altissima  accelerazione  del  campione  un  isotopo  raro  da  quelli  molto  più  abbondanti,  per  poi  procedere  all’analisi  del  campione  potendo  misurare  in  che  quantità  tale  isotopo  è  presente).  L’età  delle  cellule   può   essere   dedotta   con   buona   precisione   ricercando   in   che   periodo   era   presente  nell’atmosfera   lo   stesso   rapporto   di   14C   e   12C   misurato   nel   campione.   Tale   rapporto   negli  individui   nati   attorno   o   dopo   il   periodo   dei   test   di   bombe   nucleari   corrisponde   a   quello  presente   nell’atmosfera   diversi   anni   dopo   la   nascita   di   tali   individui,   indicando   che   almeno  alcune   delle   cellule   presenti   nel   campione   sono   frutto   di   una   proliferazione   posteriore   alla  nascita  del  soggetto.  In  tutti  i  casi  studiati  di  individui  nati  fino  a  22  anni  prima  dell’inizio  dei  test   nucleari,   la   concentrazione   di   14C   nel   campione   era   maggiore   di   quella   misurabile  nell’atmosfera  nel  periodo  che  precede  tali   test,  e  ciò   indica  chiaramente  che  ci  sono  cellule  nel  cuore  umano  che  si  rinnovano  anche  in  età  adulta.    Si   è  voluta  poi  ottenere  una  datazione   riguardante  unicamente   i   cardiomiociti,   e   si   è  perciò  proceduto  a  separare  questi  dagli  altri   tipi   cellulari  dopo  averli   identificati  utilizzando  degli  anticorpi  contro  specifici  marcatori  dei  nuclei  dei  cardiomiociti  (le  troponine  cardiache  T  e  I,  proteine   parte   del   complesso   troponina,   presente   specialmente   nel   tessuto   muscolare   e  fondamentale  per  la  contrazione  muscolare).  Analizzando  i  campioni  così  ottenuti  allo  stesso  modo   dei   campioni   precedenti,   si   è   potuto   osservare   anche   in   questo   caso   che   il   rapporto  misurato  in  tali  campioni  fra  i  due  diversi  isotopi  del  carbonio  corrisponde  a  quello  presente  nell’atmosfera   diversi   anni   dopo   la   nascita   dell’individuo   da   cui   sono   stati   prelevati   i  cardiomiociti,   indicando   che   anch’essi   si   rinnovano   dopo   la   nascita.   Tali   valori   sono   stati  corretti   dove   necessario   considerando   che   durante   l’infanzia   ci   può   essere   stata  un’incorporazione   di   14C   dovuta   alla   poliploidizzazione   del   DNA   dei   cardiomiociti   (legata  all’ipertrofia,  cioè  alla  crescita  del  volume  delle  cellule,  che  accompagna  la  crescita  del  cuore  in   quella   fase),   ed   anche   dopo   tale   correzione   la   datazione   indica   che   almeno   alcuni  cardiomiociti  sono  stati  in  grado  di  duplicarsi  in  età  adulta.    

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Questi  ultimi  dati,  riferiti  ai  cardiomiociti  prelevati  da  individui  nati  sia  prima  che  dopo  l’inizio  dei  test  nucleari  e  corretti  per  eliminare  l’influenza  della  poliploidizzazione  che  avviene  nella  fase   infantile,   sono   stati   modellizzati   matematicamente   per   ottenere   una   descrizione  approssimativa   della   percentuale   con   la   quale   avviene   annualmente   il   turnover   dei  cardiomiociti  nei  cuori  umani  a  dipendenza  dell’età  dell’individuo.  Il  risultato,  illustrato  nella  figura  10,  è  un  grafico  che  mostra  come  tale  percentuale  passi  da  un  1%  all’età  di  20  anni,  a  uno  0,3%  circa  all’età  di  75,  descrivendo  un  turnover  che  non  permette  di  rinnovare  la  totalità  dei  cardiomiociti  nemmeno  una  volta  lungo  l’arco  di  tutta  una  vita.    

         Figura  10  -­  Percentuale  di  turnover  annuale  dei  cardiomiociti  (Bergmann  et  al.  2009)  

 Tali   dati   indicano   una   capacità   sostanzialmente   inferiore   dei   cardiomiociti   di   rinnovarsi  rispetto  a  quella  risultante  per  le  altre  cellule  che  formano  il  miocardio.  Allo  stesso  tempo  essi  smentiscono   chi,   visti   i   risultati   di   esperimenti   di   altro   tipo,   asseriva   che   la   capacità   di  turnover   dei   cardiomiociti   era   tale   da   permettere   il   loro   totale   rinnovamento   ogni   5   anni  (conclusione  alla  quale  si  poteva  giungere  osservando  i  risultati,   in  particolare  quelli  relativi  ai   campioni   di   controllo,   dell’esperimento   che   ho   riportato   in   precedenza   riguardante   i  cardiomiociti   in   proliferazione   nei   cuori   umani   infartuati).   Si   tratta   comunque   di  un’importante  prova  della  capacità  dei  cardiomiociti  di  rinnovarsi,  che  modifica  il  modo  in  cui  dobbiamo   concepire   l’organo   cardiaco.   Tale   capacità,   così   come   viene   espressa,   non   è  sufficiente  da  consentire  la  rigenerazione  del  cuore  nel  caso  esso  venga  danneggiato,  ma  lascia  sperare   in   nuove   terapie   che,   potenziandola,   potrebbero   cambiare   le   cose   in   questo   senso.              

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Conclusione    In  questo  LAM,  attraverso  lo  studio  di  diversi  articoli  scientifici,  ho  avuto  modo  di  analizzare  i  meccanismi  biologici  che  si  attivano  nel  pesce  zebra  (e  in  parte  anche  nell’uomo)  in  risposta  ad  un  danneggiamento  del  tessuto  muscolare  cardiaco,  nonché  di  indagare  la  presenza  di  un  naturale  ricambio  dei  cardiomiociti  nel  cuore  umano,  con  lo  scopo  di  comprendere  se  il  nostro  organo  cardiaco  è  in  grado  di  rinnovarsi.  Ho  inoltre  potuto  osservare  quali  sono  le  modifiche  fenotipiche  che  i  cardiomiociti  di  ratto  incontrano  quando  coltivati  in  vitro  o  ex  vivo,  studiando  un   esperimento   ideato   per   comprendere   se   processi   analoghi   a   quelli   osservabili   nel   pesce  zebra  possono  avvenire  anche  nei  mammiferi,  il  quale  ha  fornito  indizi  preziosi  anche  per  lo  studio  della  situazione  nell’uomo,  sul  quale  lo  stesso  esperimento  non  può  essere  svolto.    Comparando  tali  studi  ho  potuto  innanzitutto  individuare  un’analogia  fra  la  risposta  del  pesce  zebra   all’asportazione   di   parte   del   ventricolo,   nella   quale   la   rigenerazione   della   parte  asportata   avviene   tramite   dedifferenziamento   e   seguente   proliferazione   dei   cardiomiociti,   i  quali  poi  si  ri-­‐differenziano  nei  diversi  tipi  cellulari  necessari  alla  ricostruzione  del  tessuto,  e  il  percorso  intrapreso  dai  cardiomiociti  di  ratto  coltivati  in  vitro,  i  quali  pure  si  dedifferenziano,  proliferano   e   sembrano   poi   ri-­‐differenziarsi   quando   si   raggruppano   in   sfere,   visto   che  esprimono   nuovamente   marcatori   di   cardiomiociti   maturi   (e   non   solo,   in   alcuni   casi   si   è  osservata  la  presenza  di  marcatori  delle  cellule  endoteliali).  Tale  interessante  somiglianza  fra  questi  due  processi  potrebbe  essere  interpretata  ipotizzando  l’esistenza  di  una  “parentela”  fra  tali  fenomeni,  e  cioè  sostenendo  che  derivino  entrambi  dal  fatto  che  un  antenato  comune  delle  due   specie   possedeva   una   capacità   simile,   che   si   è   poi   conservata   con   l’evoluzione   e   si   è  sviluppata  in  modo  diverso  nei  due  organismi,  ma  non  si  manifesta  comunque  nel  modo  più  efficace   nel   ratto,   che   di   fatto   non   riesce   a   sfruttarla   per   rigenerare   il   tessuto   muscolare  cardiaco   quando   questo   viene   danneggiato.   Ovviamente   questa   può   essere   al   massimo  un’ipotesi,   in   quanto  nessun  dato   ci   assicura   che   tali   fenomeni   (uno  dei   quali   è   osservabile  solamente   in   situazioni   artificiali)   non   si   siano   sviluppati   indipendentemente.   Tuttavia,   nel  caso  in  futuro  la  si  scoprisse  fondata,  potrebbe  dare  ragione  di  pensare  che  anche  nell’uomo  si  sia   conservata   qualche   capacità   rigenerativa   nascosta   che   aspetta   soltanto   di   essere  individuata  ed  attivata  con  i  giusti  condizionamenti.    L’osservazione  di  tale  interessante  parallelismo  mi  ha  portato  ad  interrogarmi  sulle  capacità  dei  cardiomiociti  umani,  e  sono  quindi  passato  all’analisi  di  due  studi  che  cercavano  di  capire  se  essi  fossero  in  grado  di  moltiplicarsi,  sia  a  seguito  di  un  infarto  che  in  condizioni  normali.    I   risultati   sono   stati   anche   qui   interessanti,   infatti   nei   cuori   umani   infartuati   sono   stati  osservati  un  buon  numero  di  cardiomiociti  che  svolgevano  la  mitosi  (lo  0,08%  o  lo  0,025%,  a  dipendenza  della  regione  del  ventricolo),  mentre  per  quanto  riguarda  il  calcolo  del  turnover  dei  cardiomiociti  che  avviene  nel  cuore  umano,  è  stato  possibile  stabilire  che  in  individui  di  20  anni   la   percentuale   di   turnover   annuale   si   aggira   attorno   all’1%,   e   che   tale   valore   scende  all’aumentare   dell’età.   Tali   risultati   contrastano   con   ciò   che   per   lunghissimo   tempo   la  comunità   scientifica   ha   sostenuto,   e   cioè   che   il   cuore   fosse   un   organo   statico   incapace   di  rinnovare   le   proprie   cellule,   e   per   questo   sono  molto   significativi,   anche   se   indicano   che   le  capacità   effettive   dei   cardiomiociti   umani   sono   comunque   limitate.   Essi   fanno   sperare   in  nuove  terapie  che  potrebbero  potenziare  tali  capacità  ed  implementarle  in  maniera  da  curare  alcune  gravi  patologie  cardiache,  ma  prima  di  arrivare  a  questo  saranno  certamente  necessari  molti  altri  studi.  Posso  concludere  affermando  che  gli  studi  sul  pesce  zebra  si  sono  rivelati  utili  anche  per  stimolare  la  ricerca  a  compiere  nuovi  studi  sull’uomo  in  tale  campo,  i  quali  hanno  portato  a  una  migliore  comprensione  dei  fenomeni  che  riguardano  il  nostro  cuore  e  quindi  a  gettare  nuove  basi  per  un  ulteriore  sviluppo  delle  terapie  mediche  applicate  a  tale  organo.  

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Appendice  –  Tecniche  di  laboratorio    In  questa  appendice  si  trovano  le  descrizioni  di  alcune  tecniche  di  laboratorio  citate  nel  testo.  Ho   preferito   spostare   tali   descrizioni   in   fondo   al   lavoro   per   rendere   più   agevole   la   lettura.    Per  alcune  di  esse  si  trovano  diversi  riferimenti  all’interno  del  testo,  ma  solo  la  prima  volta  è  presente  in  nota  il  rimando  a  questa  appendice.  

1  -­‐  Bromodeossiuridina  come  marcatore  delle  cellule  che  svolgono  la  mitosi    La   bromodeossiuridina   è   un   nucleoside   sintetico   analogo   alla   timidina,   che   può   sostituire  quest’ultima  nel  DNA  di  una  qualsiasi   cellula  nel  momento   in   cui  questa   svolge   la   sintesi  di  nuovo  DNA,  marcando  quindi   le  cellule  in  mitosi.  Tali  cellule  possono  poi  essere  individuate  con  tecniche  di  immunofluorescenza  (cioè  utilizzando  anticorpi  specifici  che  legano  la  BrdU  e  vengono  resi    visibili  al  microscopio  grazie  a  sistemi  di  rivelazione  enzimatici  o  fluorescenti).    

2  -­‐  Microarray    È  formato  da  un  supporto  sul  quale  vengono  disposti   in  modo  ordinato,  come  in  una  griglia,  diversi  brevi  segmenti  conosciuti  di  DNA,  fissati  in  maniera  che  in  ogni  posizione  della  griglia  si   trovi   unicamente,   in  molteplici   copie,   un   dato   segmento   conosciuto.   Una   volta   preparata  questa  griglia,   la  quale  potrebbe  ad  esempio  contenere   i   frammenti  di   tutto   il  genoma  di  un  dato   organismo,   è   possibile   studiare   l’espressione   genica   in   una   cellula   di   quell’organismo  isolandone   l’RNA,   ottenendone   i   corrispondenti   filamenti   di   DNA   complementare   (cDNA)  utilizzando   l’enzima   trascrittasi   inversa  e  dei  nucleotidi  marcati  con  coloranti   fluorescenti,  e  lasciando  infine  che  questi  segmenti  di  cDNA  possano  ibridarsi  con  i  corrispettivi  segmenti  di  DNA  contenuti  nella  griglia,  andando  quindi  ad   illuminare   le  celle  contenenti   i  geni  espressi  nella  cellula  che  si  è  voluta  studiare.    

3  -­‐  Reverse  transcriptase-­‐polymerase  chain  reaction  (RT-­‐PCR)    Tale  tecnica  aggiunge  alla  normale  reazione  a  catena  della  polimerasi  (PCR),  che  permette  di  amplificare  una  molecola  di  DNA  ottenendone  moltissime  copie,  un  processo  precedente  che  consente   di   ottenere   la  molecola   di   DNA   di   partenza   (o  meglio   un   singolo   filamento   detto  cDNA)   da   una  molecola   di   RNA   utilizzando   l’enzima   trascrittasi   inversa.   Con   tale   tecnica   è  perciò  possibile  ottenere  moltissime  copie  di  DNA  a  partire  da  un  segmento  di  RNA.    

4  -­‐  Ibridazione  in  situ    L’ibridazione   permette   di   determinare   la   presenza   di   specifiche   sequenze   di   DNA   o   RNA  attraverso   l’appaiamento   con   un   segmento   di   acido   nucleico   di   sequenza   complementare   a  quella   che   si   vuole   individuare   (o   ad   una   simile),   che   a   sua   volta   è  marcato   in  maniera   da  essere  facilmente  individuabile  (per  esempio  tramite  coloranti  fluorescenti).    La  locuzione  in  situ  si  riferisce  invece  al  fatto  che  tale  tecnica  viene  applicata  là  dove  si  trova  l’acido  nucleico  che  vogliamo  analizzare,  senza  rimuoverlo  dalla  sua  posizione  originale,  così  da  poterne  studiare  l’espressione  nelle  cellule  (se  si  trova  l’mRNA,  il  gene  è  espresso).        

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Bibliografia  e  sitografia  

Articoli  scientifici  e  libri    Articoli  scientifici:    Beltrami,  Antonio  P.,  Konrad  Urbanek,  Jan  Kajstura,  Shao-­‐Min  Yan,  Nicoletta  Finato,  Rossana  Bussani,  Bernardo  Nadal-­‐Ginard,  Furio  Silvestri,  Annarosa  Leri,  C.  Alberto  Beltrami,  and  Piero  Anversa.  2001.  Evidence  that  human  cardiac  myocytes  divide  after  myocardial  infarction.  New  England  Journal  of  Medicine  344,  no.  23  (June):  1750-­‐1757.    Bergmann,   Olaf,   Ratan   D.   Bhardwaj,   Samuel   Bernard,   Sofia   Zdunek,   Fanie   Barnabé-­‐Heider,  Stuart  Walsh,  Joel  Zupicich,  Kanar  Alkass,  Bruce  A.  Buchholz,  Henrik  Druid,  Stefan  Jovinge,  and  Jonas   Frisén.   2009.   Evidence   for   cardiomyocyte   renewal   in   humans.   Science   324,   no.   5923  (April):  98-­‐102.    Chablais,   Fabian,   and   Anna   Jaźwińska.   2012.   Induction   of   Myocardial   Infarction   in   Adult  Zebrafish  Using  Cryoinjury.  Journal  of  Visualized  Experiments  (62):  e3666.    Choi,   Wen-­‐Yee,   and   Kenneth   D.   Poss.   2012.   Cardiac   Regeneration.   Current   Topics   in  Developmental  Biology  100:319-­‐344.    Jopling,  Chris,  Eduard  Sleep,  Marina  Raya,  Mercè  Martí,  Angel  Raya,  and   Juan  Carlos   Izpisúa  Belmonte.  2010.  Zebrafish  heart  regeneration  occurs  by  cardiomyocyte  dedifferentiation  and  proliferation.  Nature  468,  no.  7288  (March):  606–609.    Lien,   Ching-­‐Ling,   Michael   Schebesta,   Shinji   Makino,   Gerhard   J  Weber,   and   Mark   T   Keating.  2006.  Gene  Expression  Analysis  of  Zebrafish  Heart  Regeneration.  PLoS  Biology  4(8):  e260.    Poss,  Kenneth  D.,  Lindsay  G.  Wilson,  Mark  T.  Keating.  2002.  Heart  Regeneration  in  Zebrafish.  Science  338,  no.  6103  (October):  101-­‐105.    Zhang,  Yiqiang,  Tao-­‐Sheng  Li,  Shuo-­‐Tsan  Lee,  Kolja  A.  Wawrowsky,  Ke  Cheng,  Giselle  Galang,  Konstantinos   Malliaras,   M.   Roselle   Abraham,   Charles   Wang,   and   Eduardo   Marbán.   2010.  Dedifferentiation  and  Proliferation  of  Mammalian  Cardiomyocytes.  PLoS  One  5(9):  e12559.      Libri:    Curtis,  Helena,  and  N.  Sue  Barnes.  2009.  Invito  alla  biologia.  Bologna:  Zanichelli.                      

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