I nuovi approcci biomolecolari e l'analisi del rischio in sicurezza alimentare: quali

problemi e quali prospettive

La genomica funzionale comeapproccio innovativo nella definizione

della qualità degli alimenti e nellostudio della risposta a stress

ambientali

Genomica funzionale: la Tecnologia Microarray

Profili globali di espressione genica senza limitazione ad un singolo end-pointPossibilità di analizzare fenomeni biologici complessiApproccio funzionale innovativo che consente di aumentare i campi di indagine e il numero di informazioni ottenibili

Microarray: il principio

capacità che ogni acido nucleico a singolo filamento ha di appaiarsi alla sequenza complementare, rispettando le regole di base A-T C-G.

L’RNA, estratto dai campioni di interesse, viene ibridizzato, previa marcatura con opportuni fluorocromi, alle sequenze rappresentative dei geni in esame, che possono essere deposte su supporto di varia natura.

La lettura del microarray si realizza impiegando uno scanner dotato di laser in grado di eccitare i fluorocromi e misurarne l’intensità della fluorescenza, fornendo quindi una analisi della relativa modulazione genica

Microarray, aspetti della sperimentazione

Definizione degli obiettivi sperimentaliStudio del disegno sperimentale e della dimensione del campione Familiarita’ con le procedure sperimentaliAnalisi statistica dei datiInterpretazione biologica dei dati

Nutrigenomica e trascrittomica

Nell’ambito della nutrigenomica, che include diversi approcci tipo “omics” in scienze dell’ alimentazione, la trascrittomica costituisce uno strumento efficace oggetto di molteplici studi in costante aumento.

Restrizione caloricaObesitàAttività di vitamine, minerali e fibreEffetto di catechine, flavonoidi ed erbe

Kato et al., Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care, 8:516-522, 2005

Microarray e qualità alimentare

Verifica rischi legati ai contaminanti

Individuazione proprietà nutrizionali

Identificazione effetti preventivi e protettivi per la salute umana.

Microarray e qualità alimentare

Caratteristiche di qualitàPalatabilitàProfumo, StagionalitàPotere nutrizionale Effetti sulla salute dell’alimento consumato.

Caratteristiche di qualità di importanza sanitariaSicurezza alimentare

contaminanti naturali o di origine antropicacatena di produzione e distribuzione

Caratteristiche di qualità di importanza economicaProvenienzaCaratterizzazione di alimenti interessanti per la rappresentatività nell’alimentazione italiana e per i possibili rischi/benefici sulla salute

Piattaforma AgilentUn laser SHG-YAG (532nm) e un laser a Elio-neon (633nm), per eccitare i fluorocromi Cy3 e Cy5.

Carosello a 48 posizioni

Sistema distintivo di continua messa a fuoco automatica dei laser sul piano esatto del campione durante la scansione

Software di Feature Extraction

Feature Extractor

Localizzazione di tutti gli spot sull’array (Find Spot Algorithm), provvedendo poi allo scarto dei pixel outlier(con intensità troppo alta o troppo bassa rispetto a una statistica di popolazione dell’intero array).

Segnalate le feature saturate (più del 50% dei suoi pixel ha un’intensità oltre 65502), non uniformi e con background (BG) non uniforme che, possono poi essere eliminate nella successiva filtrazione dei dati.

Normalizzazione, con il metodo LOWESS (locally weighted linear regression curve fit).

Calcolo della log(ratio) dei segnali nel rosso e nel verde associando, ad ogni valore, un errore che verrà utilizzato per calcolare un p-value finale, PVlog(ratio), che testa l’ipotesi che il valore delle log(ratio) non sia differente da zero (ipotesi nulla).

Normalizzazione

Rendere confrontabili i campioni etichettati con Cy3 e Cy5 ed ibridati congiuntamente su un singolo microarray. Eliminare errori sistematici dovuti a:

diversa quantità di mRNA associata ad ogni marcatore diversa efficienza di incorporazione dei due marcatori diversa intensità di radiazione emessa dai due marcatori differentemente misurata dal tubo fotomoltiplicatore differenti intensità misurate in diverse parti del microarraya causa del posizionamento non perfettamente orizzontale del microarray rispetto al laser dello scannerdifferenze tra gruppi di spot creati da differenti penne

L’algoritmo si basa sull’ipotesi che la mediana del rapporto delle intensità di tutte le feature sia zero.

Interferenti Endocrini : Tamoxifen

L'antiestrogeno non steroideo tamoxifen(TAM), utilizzato da una ventina d'anni nella terapia adiuvante e palliativa del tumore della mammella.

Effetti collaterali della molecola con insorgenza di tumori dell'endometrio ed evidenze sperimentali nell'animale e in vitro a sostegno di una attività mutagena e di effetti promoventi esercitati da questo antiestrogeno.

Studio degli effetti di TAM sulle U87 Glioblastoma-Astrocitoma GRADO III

Studi funzionali:

Test di vitalitàCurva di proliferazione Crescita in agarTest di apoptosiE-screenEspressione ER

Studio preliminare di espressione genica:

Analisi in microarray:NTvsTAM 9µM (GI50)NTvsTAM 15µM (TGI)

Esperimento preliminare microarraySono stati utilizzati vetrini Agilent Human 1A Oligo DNA Microarrays. Ogni array comprende 22.575 oligonucleotidi 60-merrappresentativi di 17.803 geni umani appartenenti al Genomics Foundation Database della Incyte

NTvsTAM 9µM (GI50) - NTvsTAM 15µM (TGI)

Solo i geni ottenuti dalla Feeature Extraction con un significatività per la log(ratio) minore di 0,01 sono stati selezionati per la successiva analisi

GoMiner, un tool di interpretazione biologica dei dati di microarray, disponibile in rete. Questo programma organizza la lista di geni modulati nel contesto di Gene Ontology (GO), un database che contiene una classificazione dei geni in categorie gerarchiche basate su processo biologico, funzione molecolare e compartimento cellulare. GoMiner opera confrontando due liste di geni, e una che riporta i geni significativamente modulati

Classi di geni modulati dal trattamento con TAM 9µM

*

*******

012345

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Re

Biological process

Cellular component

Molecular Function

Fattore arricchimento

Re = (geni variati in una classe/geni totali nella classe)

(geni variati nel chip/geni totali nel chip)

Classi di geni modulati dal trattamento con TAM 15µM

Fattore arricchimento

Re = (geni variati in una classe/geni totali nella classe)

(geni variati nel chip/geni totali nel chip)

***

0

1

2

3

4

5

Extracellular Obsolete TransporterActivity

Re

Cellular component

Molecular Function

Time-course tamoxifen:disegno sperimentale

T0

2 h

4 h

6 h

16 h

24 h

30’U87

TAM 20µM

Vetrini Agilent Human 1A (V2) oligo DNA microarray

Package Maanova di RUna tipica analisi di dati che utilizza gli strumenti

disponibili nel package può essere suddivisa in quattro fasi principali:

I. operazioni di prefiltraggio dei geni: (spot saturati e di controllo)II. elaborazione preliminare dei dati grezzi: (operazioni di trasformazione utili alla normalizzazione interna dei microarray e quella necessaria a rendere i dati adatti ad un modello lineare) III. fit del modello lineare ai dati: nel modello l’effetto d’interesse è l’interazione tra la varietà (nel nostro caso le varietà sono sei cioè i tempi di trattamento) e il geneIV. test statistici: (nel package sono disponibili quattro diversi test statistici. Questi test differiscono sulla base di come viene stimata la varianza associabile al livello di espressione di ciascun gene di una data varietà)

Geni modulati da TAM in cellule U87

Regolazione delle interazioni cellula-matriceAlterazione delle componenti citoscheletricheControllo del ciclo cellulare: fase G1/SControllo del ciclo cellulare: fase G2/MControllo della trascrizioneControllo dei sistemi di riparo del DNAControllo dell’apoptosi

Considerazioni finali

La maggior parte dei geni differentemente espressi indotti dal trattamento con tamoxifen, fino ad ora analizzati, ha interessato elementi coinvolti in vari pathway biologici fra cui il controllo del ciclo cellulare (checkpoint in G1/S e G2/M), la regolazione trascrizionale, il processo apoptico e le interazioni cellula-matriceL’alterata espressione genica, valutata nell’esperimento di time-course, ha individuato alcuni dei probabili geni candidati biomarkersche sottendono la risposta a tamoxifen nel nostro sistema cellulare di astrocitoma-glioblastoma

estratti da matrice

caratterizzazione chimica

valutazione biologica

batteri cellule

caratterizzazione molecolare

genomica funzionale proteomica

PCB

diossine triazoli

micotossine

PROGETTO MITICATriennaleMulticentricoDifferenti matriciContaminanti

PCBDiossineTriazoliMicotossine

TecnologieLC/MSMicroarrayProteomica

Suolo

Fonte

estratto

Caratterizzazione chimica

Test biologici e molecolari

Acqua estratto

Caratterizzazione chimica

Test biologici e molecolari

Crostacei estratto

Caratterizzazione chimica

Test biologici e molecolari

Mitili estratto

Caratterizzazione chimica

Test biologici e molecolari

PCB Metalli Pesanti Biotossine

PCB

PROGETTO ARCADEBiennaleARPA-ERDifferenti matriciContaminanti

PCBMetalli PesantiDiossine

TecnologieLC/MSTrasformazione cellulareComunicazioni GJMicroarray

Fattori ormonali potrebbero essere

necessari per mediare gli effetti antiossidanti del

licopene

Licopene

ac. clorogenico

ac. p-cumarico

falcarindiolo

vaniglina

rutinalanosterolo

kempferolo

quercetina

naringenina

ac. gentisico 24-metilenecicloartenolo

eugenolo

falcarinolo

FATTORI AMBIENTALI

Principi Attivi

Principi Attivi

GENOMICA FUNZIONALE

GENOMICA FUNZIONALE

TEST BIOLOGICI

TEST BIOLOGICI

VALUTAZIONE RISCHIO-BENEFICIO

Genomica&QualitàARPA ERAUSL BO