La donazione di cellule La donazione di cellule staminali emopoietichestaminali emopoietiche La donazione di cellule La donazione di cellule staminali emopoietichestaminali emopoietiche

Immunoematologia USL3 PistoiaImmunoematologia USL3 Pistoia

Commissione di Studio sull’utilizzo di Stem Cells per Commissione di Studio sull’utilizzo di Stem Cells per finalità terapeutichefinalità terapeutiche

Le cellule staminali sono cellule non Le cellule staminali sono cellule non

specializzate in grado di dividersi dando specializzate in grado di dividersi dando

origine contemporaneamente ad una origine contemporaneamente ad una

cellula staminale (uguale alla cellula madre)cellula staminale (uguale alla cellula madre)

e una cellula precursore di una progenie e una cellula precursore di una progenie

cellulare che alla fine darà origine a sua volta cellulare che alla fine darà origine a sua volta

a cellule terminalmente differenziate(mature). a cellule terminalmente differenziate(mature).

DEFINIZIONEDEFINIZIONE

CaratteristicheCaratteristiche

Sono cellule “ immature,generiche”, indifferenziate, Sono cellule “ immature,generiche”, indifferenziate, in grado di :in grado di :

– AutorinnovarsiAutorinnovarsi = dividersi per periodi = dividersi per periodi

indefiniti senza differenziarsi, generando indefiniti senza differenziarsi, generando

cellule che possiedono a loro volta capacità cellule che possiedono a loro volta capacità

staminalestaminale

– Differenziarsi Differenziarsi = dare origine a linee = dare origine a linee

differenziative che portano alla produzione dei differenziative che portano alla produzione dei

numerosi tipi di cellule specializzate che numerosi tipi di cellule specializzate che

costituiscono i tessuti costituiscono i tessuti

CaratteristicheCaratteristiche

Ogni cellula staminale ha perciò due Ogni cellula staminale ha perciò due

possibilità:possibilità:

– dividersi senza limite in tutto il ciclo vitale, dividersi senza limite in tutto il ciclo vitale,

rimanendo cellula staminalerimanendo cellula staminale

– differenziarsi irreversibilmente differenziarsi irreversibilmente

Le vie della cellula staminale…Le vie della cellula staminale…

Nell’ambito della popolazione delle cellule Nell’ambito della popolazione delle cellule staminali si possono distinguere:staminali si possono distinguere:

Cellule staminali Cellule staminali totipotentitotipotenti, cioè in grado di , cioè in grado di

generare tutte le cellule e i tessuti che compongono un generare tutte le cellule e i tessuti che compongono un

embrione e quello che supporta il suo sviluppo in uteroembrione e quello che supporta il suo sviluppo in utero

cellule staminali cellule staminali pluripotentipluripotenti in grado di generare solo in grado di generare solo

cellule appartenenti al loro strato germinativo cellule appartenenti al loro strato germinativo

(endoderma, mesoderma o ectoderma)(endoderma, mesoderma o ectoderma)

cellule cellule unipotentiunipotenti che si differenziano in una sola linea che si differenziano in una sola linea

I foglietti germinativiI foglietti germinativi

EctodermaEctoderma:: ectoderma superficiale (cute e ectoderma superficiale (cute e

organi di senso), neuroectodermaorgani di senso), neuroectoderma

EndodermaEndoderma:: epitelio del tratto gastro-epitelio del tratto gastro-

intestinale e delle vie respiratorie,vie urinarie, intestinale e delle vie respiratorie,vie urinarie,

tuba di Eustacchio, parenchima tonsille, tiroide, tuba di Eustacchio, parenchima tonsille, tiroide,

paratiroidi, timo, fegato, pancreasparatiroidi, timo, fegato, pancreas

MesodermaMesoderma: : sangue, vasi, cuore, sangue, vasi, cuore,

muscolatura liscia, milza, reni, scheletro….muscolatura liscia, milza, reni, scheletro….

La cellula staminale emopoieticaLa cellula staminale emopoieticaLa cellula staminale emopoieticaLa cellula staminale emopoietica

Di particolare interesse ai fini trapiantologici sono le Di particolare interesse ai fini trapiantologici sono le cellule staminali emopoietiche cellule staminali emopoietiche (CSE)(CSE)

La cellula staminale emopoietica La cellula staminale emopoietica è l’elemento è l’elemento primitivo dell’intero primitivo dell’intero sistema emopoieticosistema emopoietico Possiede i 3 aspetti fondamentali delle cellule staminali:Possiede i 3 aspetti fondamentali delle cellule staminali:– capacità di replicare indefinitamente senza differenziarsi capacità di replicare indefinitamente senza differenziarsi

(capacità di autorinnovamento)(capacità di autorinnovamento)– Non completa differenziazioneNon completa differenziazione– Sensibilità a stimoli in grado di differenziarla in una cellula Sensibilità a stimoli in grado di differenziarla in una cellula

specializzata,ossia di dare origine,in opportune condizioni,a specializzata,ossia di dare origine,in opportune condizioni,a cellule progenitrici da cui derivano linee cellulari differenziate.cellule progenitrici da cui derivano linee cellulari differenziate.

Fattori che mediano la proliferazione Fattori che mediano la proliferazione e la differenziazione della CSEe la differenziazione della CSE

Il processo proliferativo/differenziativo è Il processo proliferativo/differenziativo è

regolato da una serie di fattori:regolato da una serie di fattori:

IntrinseciIntrinseci: i più studiati sono i fattori di : i più studiati sono i fattori di

trascrizione, ossia proteine che regolano la trascrizione, ossia proteine che regolano la

trascrizione di geni importanti per la trascrizione di geni importanti per la

differenziazione ematopoietica differenziazione ematopoietica

EstrinseciEstrinseci: comprendono fattori di crescita ed : comprendono fattori di crescita ed

una complessa rete di interazioni cellula-cellula una complessa rete di interazioni cellula-cellula

tra i progenitori ematopoietici ed il tra i progenitori ematopoietici ed il

microambiente stromalemicroambiente stromale

EmopoiesiEmopoiesi

Le cellule del sangue (eritrociti, leucociti e Le cellule del sangue (eritrociti, leucociti e piastrine) hanno una durata di vita limitata piastrine) hanno una durata di vita limitata e devono essere rinnovate continuamentee devono essere rinnovate continuamente

Le tre filiere emopoietiche Le tre filiere emopoietiche producono giornalmente a livello midollare

3 x 103 x 1099 eritrociti/kg eritrociti/kg0,8 x 100,8 x 1088 leucociti/kg leucociti/kg 1,5 x 101,5 x 1099 piastrine/kg piastrine/kg

Cellule staminali ematopoieticheCellule staminali ematopoietiche

Hanno la capacità di autorinnovarsi e di proliferare ad un ritmo molto intenso differenziandosi in elementi cellulari maturi del sangue circolante: leucociti, eritrociti, piastrine

Dove si trovano?Nel midollo osseo (contenuto in bacino, coste, sterno, etc…), nel cordone ombelicale, in minima parte nel sangue periferico

Da dove vengono prelevate Da dove vengono prelevate le CSE per il trapianto?le CSE per il trapianto?

Le cellule staminali emopoietiche sono Le cellule staminali emopoietiche sono

localizzate principalmente nellocalizzate principalmente nel midollo osseo midollo osseo

ma è possibile reperirle anche nelma è possibile reperirle anche nel sangue sangue

circolantecircolante, , in seguito a regimi di mobilizzazionein seguito a regimi di mobilizzazione

Esse sono presenti anche nelEsse sono presenti anche nel sangue delsangue del

cordone ombelicalecordone ombelicale del neonato al momento del neonato al momento

del parto del parto

Cenni Cenni

sull’utilizzo trapiantologico sull’utilizzo trapiantologico

delle cellule staminalidelle cellule staminali

TRAPIANTO DI MIDOLLOTRAPIANTO DI MIDOLLOTRAPIANTO DI MIDOLLOTRAPIANTO DI MIDOLLO

Per Trapianto di Midollo Osseo (TMO)

si intende la sostituzione di un midollo

osseo malato o non funzionante, con

cellule staminali sane, in grado di

rigenerare tutte le cellule del sangue e

di ricostituire tutte le normali funzioni

ematologiche ed immunologiche

Per Trapianto di Midollo Osseo (TMO)

si intende la sostituzione di un midollo

osseo malato o non funzionante, con

cellule staminali sane, in grado di

rigenerare tutte le cellule del sangue e

di ricostituire tutte le normali funzioni

ematologiche ed immunologiche

TRAPIANTO DI MIDOLLOTRAPIANTO DI MIDOLLOTRAPIANTO DI MIDOLLOTRAPIANTO DI MIDOLLO

Il TMO rappresenta la terapia

di elezione in molte patologie,

congenite o neoplastiche.

Il trapianto viene distinto sulla base Il trapianto viene distinto sulla base dell’organo di provenienza….dell’organo di provenienza….

Midollo osseoMidollo osseo

Sangue perifericoSangue periferico

Cordone ombelicaleCordone ombelicale

...e a seconda del donatore...e a seconda del donatore

AutologoAutologo: le cellule staminali prelevate al : le cellule staminali prelevate al paziente vengono congelate e poi restituite al paziente vengono congelate e poi restituite al paziente dopo alte dosi di chemioterapiapaziente dopo alte dosi di chemioterapia

SingenicoSingenico: il donatore è un gemello identico: il donatore è un gemello identico

AllogenicoAllogenico: il midollo del paziente è ricostituito : il midollo del paziente è ricostituito mediante reinfusione di cellule da un donatore mediante reinfusione di cellule da un donatore sano compatibile (familiare o non familiare) sano compatibile (familiare o non familiare)

Trapianto di midollo osseo (TMO) autologo

TRAPIANTO AUTOLOGOTRAPIANTO AUTOLOGO

Applicazioni terapeuticheApplicazioni terapeutiche::

– Neoplasie ematologicheNeoplasie ematologiche (linfomi, mieloma (linfomi, mieloma

multiplo,leucemie mieloidi,leucemie linfatiche, multiplo,leucemie mieloidi,leucemie linfatiche, sindromi mielodisplastiche)sindromi mielodisplastiche)

– Tumori solidiTumori solidi ( (carcinoma mammario,ovarico, carcinoma mammario,ovarico,

microcitoma, neuroblastoma, altri tumori solidi)microcitoma, neuroblastoma, altri tumori solidi)

– Malattie autoimmuni severeMalattie autoimmuni severe, , non responsive non responsive

ai trattamenti con dosi convenzionali di ai trattamenti con dosi convenzionali di immunosoppressori (LES, sclerosi multipla, artrite immunosoppressori (LES, sclerosi multipla, artrite reumatoide, vasculiti sistemiche…)reumatoide, vasculiti sistemiche…)

Applicazioni terapeuticheApplicazioni terapeutiche::

– Neoplasie ematologicheNeoplasie ematologiche (linfomi, mieloma (linfomi, mieloma

multiplo,leucemie mieloidi,leucemie linfatiche, multiplo,leucemie mieloidi,leucemie linfatiche, sindromi mielodisplastiche)sindromi mielodisplastiche)

– Tumori solidiTumori solidi ( (carcinoma mammario,ovarico, carcinoma mammario,ovarico,

microcitoma, neuroblastoma, altri tumori solidi)microcitoma, neuroblastoma, altri tumori solidi)

– Malattie autoimmuni severeMalattie autoimmuni severe, , non responsive non responsive

ai trattamenti con dosi convenzionali di ai trattamenti con dosi convenzionali di immunosoppressori (LES, sclerosi multipla, artrite immunosoppressori (LES, sclerosi multipla, artrite reumatoide, vasculiti sistemiche…)reumatoide, vasculiti sistemiche…)

Trapianto di midollo osseo (TMO) allogenico

Prelievo di cellule staminali dal donatore compatibile e

successiva introduzione per via endovenosa in un malato

adeguatamente “condizionato” per riceverle

COSA VUOL DIRE ESSERE GENETICAMENTE COMPATIBILI ?

Ciascuno di noi possiede un patrimonio di geni, ereditati dai genitori, che, come le impronte digitali, ci caratterizza in maniera univoca.

Alcuni di questi controllano l'espressione di antigeni presenti sulla superficie di tutte le cellule del nostro corpo. Grazie a tali antigeni, caratteristici di un singolo individuo, il sistema immunitario riconosce le proprie cellule normali e reagisce contro quelle estranee o addirittura contro le proprie, se modificate.

Nell'uomo il gruppo di geni che controlla il "riconoscimento" dei vari tessuti dell' organismo è definito Sistema HLA

IL SISTEMA HLAIL SISTEMA HLA

HLA: Human Leucocyte AntigenHLA: Human Leucocyte Antigen è composto da una è composto da una serie di geni localizzati sul braccio corto del serie di geni localizzati sul braccio corto del cromosoma 6 cromosoma 6

MHC: Major Histocompatibility complexMHC: Major Histocompatibility complex comprende comprende geni, inclusi l’HLA, che sono essenziali per una geni, inclusi l’HLA, che sono essenziali per una corretta risposta immune.corretta risposta immune.

I loci HLAI loci HLA hanno un estremo polimorfismo e ciò fa si hanno un estremo polimorfismo e ciò fa si che solo pochi individui al di fuori della famiglia siano che solo pochi individui al di fuori della famiglia siano identici per questo sistema.identici per questo sistema.

La metodiche utilizzate per evidenziare gli antigeni La metodiche utilizzate per evidenziare gli antigeni HLA si chiamano “ HLA si chiamano “ Tipizzazione TissutaleTipizzazione Tissutale” poichè ” poichè questi antigeni si trovano su tutte le cellule del nostro questi antigeni si trovano su tutte le cellule del nostro corpo.corpo.

Dai geni Dai geni allealle molecole HLA molecole HLA

Sul braccio corto del cromosoma 6 si trovano i loci Sul braccio corto del cromosoma 6 si trovano i loci A, A, BB e e C C ( locus indica la posizione di un gene sul ( locus indica la posizione di un gene sul cromosoma) che codificano le molecole cromosoma) che codificano le molecole HLA di I HLA di I ClasseClasse ed i loci ed i loci DR,DR, DQ e DPDQ e DP che codificano le che codificano le molecole molecole HLA di II classeHLA di II classe..Tutti i geni HLA Tutti i geni HLA sono codominantisono codominanti e vengono e vengono ereditati secondo le leggi di Mendel.ereditati secondo le leggi di Mendel.Per ogni locusPer ogni locus possono esistere alternativamente possono esistere alternativamente molti diversi allelimolti diversi alleli. . Poiché ogni allele codifica una diversa molecola per il Poiché ogni allele codifica una diversa molecola per il locus A, per il B, per il C, per il DR e per il DQ, ciascun locus A, per il B, per il C, per il DR e per il DQ, ciascun individuo possiede due alleli per ciascun locus e di individuo possiede due alleli per ciascun locus e di conseguenza due molecole HLA per ogni locus, una di conseguenza due molecole HLA per ogni locus, una di origine paterna ed una di origine materna.origine paterna ed una di origine materna.

Gli antigeni HLA vengono ereditati Gli antigeni HLA vengono ereditati secondo le leggi di Mendelsecondo le leggi di Mendel

PADRE MADRE

FIGLI

Dai geni Dai geni allealle molecole HLA molecole HLA

Dato che per ogni locus esistono molti alleli diversi, le Dato che per ogni locus esistono molti alleli diversi, le combinazioni possibili sono moltissime combinazioni possibili sono moltissime

Per questa ragione la probabilità che due persone non Per questa ragione la probabilità che due persone non consanguinee siano HLA compatibili è estremamente consanguinee siano HLA compatibili è estremamente bassa 1:100.000bassa 1:100.000

Tra fratelli invece la probabilità teorica di trovare un Tra fratelli invece la probabilità teorica di trovare un donatore compatibile è del 25% donatore compatibile è del 25%

Per i pazienti che non dispongono di un familiare HLA “compatibile” è necessario reperire una

sorgente alternativa di progenitori emopoietici per poter beneficiare di un trattamento trapiantologico potenzialmente curativo

DONAZIONE DI CSEDONAZIONE DI CSE

Data l’enorme variabilità tra un individuo e Data l’enorme variabilità tra un individuo e

l’altro, perché chi ha necessità del trapianto l’altro, perché chi ha necessità del trapianto

riesca a trovare un donatore compatibile è riesca a trovare un donatore compatibile è

necessario un gran numero di donatori di necessario un gran numero di donatori di

midollo tipizzati per l’HLA o di unità di midollo tipizzati per l’HLA o di unità di

sangue funicolare disponibilisangue funicolare disponibili..

Da dove vengono prelevate Da dove vengono prelevate le CSE per il trapianto?le CSE per il trapianto?

daldal midollo osseo midollo osseo

daldal sangue periferico circolantesangue periferico circolante

mediante staminoaferesimediante staminoaferesi

daldal funicolofunicolo al momento del parto al momento del parto

Le CSE raccolte e purificate vengono Le CSE raccolte e purificate vengono

congelate e conservate in azoto liquido congelate e conservate in azoto liquido

a –196° mantenendo stabile la loro a –196° mantenendo stabile la loro

capacità emopoietica per oltre 10 anni.capacità emopoietica per oltre 10 anni.

Dose trapiantologica: 5 x 10Dose trapiantologica: 5 x 108 8 /Kg di /Kg di

peso corporeo del riceventepeso corporeo del ricevente

Le cellule staminali da donatore non consanguineo vengono prelevate dal midollo osseo mediante ripetutepunture delle creste iliache(ossa del bacino) in quantità pari a 15ml/Kg di peso del ricevente.

Come avviene il prelievo dal donatore ?

Trattandosi di punture ossee, è necessario che il prelievo venga eseguito in anestesia,

altrimenti risulta doloroso.  

Sangue perifericoSangue periferico

Dopo stimolazione con fattori di crescita è Dopo stimolazione con fattori di crescita è possibile ritrovare un numero elevato di possibile ritrovare un numero elevato di cellule staminali emopoietiche anche nel cellule staminali emopoietiche anche nel sangue perifericosangue periferico

Queste cellule staminali possono essere Queste cellule staminali possono essere raccolte mediante separatore cellulare e raccolte mediante separatore cellulare e congelate fino al loro utilizzocongelate fino al loro utilizzo

Sangue placentareSangue placentare

• Il sangue placentare (SP) contiene un buon numero di cellule staminali emopoietiche in grado di determinare la ricostituzione emopoietica dopo trattamento radio-chemioterapico ad alte dosi.

Vantaggi del sangue placentareVantaggi del sangue placentare

il SP è considerato materiale “a perdere”: eliminazione di tutte le problematiche relative al prelievo d’organorisorsa illimitata di cellule staminali emopoieticheil donatore non deve essere sottoposto ad anestesiale unità conservate permettono una più rapida disponibilità di CSEpossibilità di trovare un donatore per pazienti appartenenti a minoranze etniche poco rappresentate nei registri di donatori volontarila relativa immaturità immunologica delle cellule linfocitarie in esso contenute riduce il rischio di GVHD e consente il trapianto anche in presenza di compatibilità HLA non completaMinor rischio di trasmissione malattie infettive

Svantaggi del sangue placentareSvantaggi del sangue placentare

n° limitato di cellule staminali, sufficienti per n° limitato di cellule staminali, sufficienti per trapiantare pazienti con peso corporeo trapiantare pazienti con peso corporeo inferiore a 45-50 kg inferiore a 45-50 kg

Minore immunocompetenza Minore immunocompetenza minor rischio minor rischio di GvHD ma anche di Graft versus Leukemiadi GvHD ma anche di Graft versus Leukemia

Tempi di ricostituzione emopoietica più Tempi di ricostituzione emopoietica più lunghi (dato l’alto numero di elementi più lunghi (dato l’alto numero di elementi più immaturi)immaturi)

Maggior rischio di infezioniMaggior rischio di infezioni

Indicazioni al trapianto di CSEIndicazioni al trapianto di CSE

Malattie neoplasticheMalattie neoplastiche

Malattie da immunodeficienza o Malattie da immunodeficienza o da errori congenitida errori congeniti

Malattie neoplasticheMalattie neoplastiche

Leucemia acuta mieloide e linfoideLeucemia acuta mieloide e linfoide

Leucemia mieloide cronicaLeucemia mieloide cronica

Sindromi mielodisplastiche (leucemia refrattaria Sindromi mielodisplastiche (leucemia refrattaria

con eccesso di blasti; leucemia refrattaria con con eccesso di blasti; leucemia refrattaria con

eccesso di blasti in trasformazione, leucemia eccesso di blasti in trasformazione, leucemia

acuta mieloide secondaria) acuta mieloide secondaria)

Disordini linfoproliferativi (leucemia linfatica Disordini linfoproliferativi (leucemia linfatica

cronica, linfomi non Hodgkin, linfomi di Hodgkin, cronica, linfomi non Hodgkin, linfomi di Hodgkin,

mieloma multiplo). mieloma multiplo).

Malattie da immunodeficienza o Malattie da immunodeficienza o da errori congenitida errori congeniti

Sindrome da immunodeficienza severa Sindrome da immunodeficienza severa (SCID = Severe lmmunodeficiency (SCID = Severe lmmunodeficiency Disease) Disease)

Aplasia midollare severa Aplasia midollare severa

Talassemia Talassemia

Anemia emolitica falciforme Anemia emolitica falciforme

Anemia di Fanconi e anemia di Blackfan Anemia di Fanconi e anemia di Blackfan Diamond Diamond

Come avviene il trapianto ?

Il TMO allogenico consiste principalmente in due fasi:

la prima mirata alla distruzione delle cellule midollari del paziente con una chemio - radioterapia mieloablativa (fase di condizionamento) 

la seconda fase consiste nella ricostituzione del patrimonio midollare del paziente, tramite l’infusione ev delle cellule staminali prelevate dal donatore. Queste cellule riescono, infatti, a trovare da sole la strada per colonizzare la sede ossea di loro competenza e iniziare a produrre i normali elementi cellulari del sangue.

TRAPIANTO ALLOGENICOTRAPIANTO ALLOGENICO

AA AAA

A

RICEVENTE

FONTI DI CELLULE STAMINALI (HSC):-MIDOLLO OSSEO (BM) -SANGUE PERIFERICO (PBPC) -CORDONE OMBELICALE (CB) B

B

BBB

B

BBBB

DONATORE

CHIMERISMO COMPLETO

ATTECCHIMENTO STABILE

DELLE CELLULE STAMINALI

ALLOGENICHE

CONDIZIONAMENTO A DOSI MIELOABLATIVE ed IMMUNOSOPPRESSIVE

SCOPI:-ERADICAZIONE MALATTIA DI BASE-PREVENZIONE RIGETTO (HvG REACTION)

AGENTI IMMUNOSOPPRESSIVI:PREVENZIONE E CONTROLLOGvHD (GRAFT VERSUS HOST DISEASE)

Durante il periodo di ricostituzione del “nuovo” midollo il paziente viene ricoverato in una

camera sterileIn tutta la fase di aplasia e ipoplasia midollare

il paziente deve essere supportato con trasfusioni di emazie e piastrine