LA BIOLOGIA SPERIMENTALE: DALLE MOLECOLE … · M. G. Bridelli - Università degli studi di Parma...

SIBS – SOCIETA’ ITALIANA DI BIOLOGIA SPERIMENTALE

85° CONVEGNO SIBS

LA BIOLOGIA SPERIMENTALE:

DALLE MOLECOLE ALL’ORGANISMO

Aula Magna dell’Università di Parma

29 - 30 novembre 2012

| 3

Con il patrocinio di:

Università degli studi di Parma

Accademia ligure di scienze e lettere

Museo di storia naturale di Parma

Provincia di Parma

Comune di Parma

Si ringraziano:

Stardea S.r.l.

Physik Instrumente (PI) S.r.l.

4 |

PRESIDENTE NAZIONALE

Emma Rabino Massa –Università degli studi di Torino

VICE PRESIDENTE

Proto Pippia – Università degli studi di Sassari

SEGRETARIO NAZIONALE

Giovanni Pizzuti – Università degli studi di Napoli Federico II

COMITATO ORGANIZZATORE

M. G. Bridelli - Università degli studi di Parma

R. Antolini - Università degli studi di Trento

M. Cocchi - Università degli studi di Bologna

M. A. Dessì - Università degli studi di Cagliari

L. Pane - Università degli studi di Genova

P. Pippia - Università degli studi di Sassari

G. Pizzuti - Università degli studi di Napoli Federico II

E. Rabino Massa - Università degli studi di Torino

COMITATO SCIENTIFICO

M. G. Bridelli

S. De Iasio

M. Miragoli

E. Polverini

M. Zaniboni

| 5

Sommario

PROGRAMMA .................................................................................................................................... 9

LETTURA MAGISTRALE SIBS “GAETANO QUAGLIARIELLO” ........................................ 13

Dal neurone al comportamento: il sistema mirror e la cognizione sociale .................................... 13

ABSTRACT ........................................................................................................................................ 15

Sindrome metabolica ......................................................................................................................... 17

Simmetrie e rotture di simmetrie tra biologia molecolare, disturbi dell’umore ed emergentismo

personalistico. .................................................................................................................................. 19

Sindrome metabolica e performance cognitiva nell’anziano ........................................................... 22

Sindrome metabolica ....................................................................................................................... 23

Metabolic syndrome and cardiovascular risk: contribution of ultrasonography .............................. 25

Fisiologia cardiaca .............................................................................................................................. 27

A protocol which combines current – and voltage-clamp provides a novel useful three-dimensional

representation of the cardiac action potential ................................................................................... 29

Spontaneous electrical activity of guinea pig sinoatrial cells under modulation of two different

pacemaker mechanisms.................................................................................................................... 32

Arrhythmia susceptibility in senescent rat hearts ............................................................................. 35

Single low-intensity premature stimuli can induce ventricular arrhythmias in the normal heart ..... 38

Antropologia ed evoluzione molecolare ............................................................................................ 41

Complementarietà di spettroscopia FT-IR ed analisi istologiche per lo studio del degrado della pelle

mummificata. ................................................................................................................................... 43

Stature estimation using mandibular morphometric parameters in Italian population: a preliminary

report ................................................................................................................................................ 46

Variabilità di marcatori uniparentali in popolazioni italiane a diverso grado di isolamento ............ 49

Ancient DNA studies: new perspectives on old samples ................................................................. 50

Mine, yours, ours? sharing data on human genetic variation ........................................................... 51

Metodologie e tecniche della biologia sperimentale......................................................................... 53

Synthesis and antimicrobial activity of new 1-R-3-(2-PIRiDYL)- 4-nitroso- 5-carboxiethyl-1H-

pyrazoles. ......................................................................................................................................... 55

Light regulated enzyme activities .................................................................................................... 57

Towards nano-physiology in mammalian cells: a multi-parametric analysis with scanning ion

conductance microscopy .................................................................................................................. 58

Biomolecular NMR, a versatile tool for the understanding of protein science; retinoid-binding

proteins as an example ..................................................................................................................... 60

Application of the multiuse encapsulator agent F-500 for environmental remediation ................... 62

A photochromic bacterial photoreceptor as a novel tool for super-resolution microscopy .............. 65

Study of the interaction of myelin basic protein with membranes by means of molecular dynamics

simulations ....................................................................................................................................... 67

Modulation of the photocycle of a flavin-based photoreceptor by site-directed mutagenesis ......... 69

Nuove metodologie per antichi rimedi: il caso del fungo di malta .................................................. 70

6 |

POSTER............................................................................................................................................... 73

Qualitative comparision of olive oil mediterranean .......................................................................... 75

Relationship between maximal fat oxidation and oxygen uptake: comparison between patients with

type 2 diabetes and healthy sedentary subjects ................................................................................. 77

The influence of hypocaloric diet, associated with moderate physical activity and cbt (cognitive

behavioral therapy), on self-esteem and self-efficacy and their modulator role on emotional eating.

.......................................................................................................................................................... 80

The control of abstinence in the treatment of alcohol dependence: the use of acamprosate in relapse

prevention. ........................................................................................................................................ 82

Cellular drug delivery system based on vaterite particles ................................................................ 85

Modelli biologici di stress ossidativo per lo studio delle proprietà antiossidanti del carciofo .......... 86

Micro-Raman mapping of bio-carbonates and polyenic pigments in corals and shells .................... 93

La popolazione del vergante attraverso lo studio dei cognomi ......................................................... 95

Ricerche sulla popolazione di Giaglione (TO) in epoca preunitaria ................................................. 96

Distribution and phylogeny/distance-trees of prokaryotic photoreactive domains ........................... 99

Biomarcatori per la diagnosi precoce del tumore al polmone ......................................................... 101

Comparative analysis of cytotoxic effects INDUCED BY N4-ethylmorpholine

citronellalthiosemicabazone complexes in different human cancer cell lines ................................. 104

Effetti citotossici degli ossidi di cobalto e di titanio su cellule A549. ............................................ 107

Enzimatic biomarkers in the gilthead seabream juveniles fed with graded concentrations of

alchylphenols .................................................................................................................................. 109

Hepatic activities in Sparus Aurata L. juveniles fed with bisphenol A enriched diet. .................... 111

K:D-Rib un inibitore della proliferazione delle cellule tumorali ed un promotore del folding di

DNAzima. ....................................................................................................................................... 113

Contenuto e mappa di distribuzione del magnesio intracellulare in cellule farmaco-resistenti e -

sensibili ........................................................................................................................................... 115

Modificazioni del contenuto intracellulare di magnesio durante l’apoptosi mitocondrio-mediata:

studi degli eventi precoci correlati al potenziale mitocondriale ...................................................... 117

Valutazione dell’efflusso di magnesio indotto da cAMP in cellule HL60 mediante un nuovo

chemosensore fluorescente derivato dall’8-idrossichinolina .......................................................... 119

Nuove prospettive nella determinazione del magnesio intracellulare ............................................. 121

La carenza di magnesio inibisce la progressione del ciclo cellulare in cellule di osteosarcoma

umano ............................................................................................................................................. 123

Cadmium contamination and sense of smell in Danio rerio ........................................................... 125

| 7

SESSIONI PLENARIE

29 NOVEMBRE 2012

Sindrome metabolica

Fisiologia cardiaca

30 NOVEMBRE 2012

Antropologia ed evoluzione molecolare

Metodologie e tecniche della Biologia Sperimentale

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PROGRAMMA GIOVEDI’ 29 NOVEMBRE

9.30 Saluto delle Autorità

9.45 Saluto del Presidente Emma Rabino Massa

10.00 Lettura magistrale “Gaetano Quagliariello”:

Leonardo Fogassi (Università di Parma)

Dal neurone al comportamento: il sistema mirror e la cognizione sociale.

11.15-13.00 SINDROMI METABOLICHE moderatore G. L. Mariottini

F. Gabrielli (Istituto “Paolo Sotgiu” per la ricerca in Psichiatria e Cardiologia

Quantitativa e Quantistica, L.U.de.S. University, Lugano)

Biologia ed emergentismo personalistico

M. Gualerzi (Prevenzione e Riabilitazione cardiovascolare, Don Gnocchi, Parma)

Sindrome Metabolica

M. Rinaldi (Università di Torino)

Sindrome metabolica e performance cognitiva nell’anziano

V.O. Palmieri (Università di Bari)

Metabolic syndrome and cardiovascular risk: contribution of ultrasonography

14.00-15.00 SESSIONE POSTER

15.00-16.30 METODOLOGIE E TECNICHE DELLA BIOLOGIA SPERIMENTALE

moderatore E. Polverini

S. Aiello (Università di Palermo)

Synthesis and antimicrobial activity of new 1-R-3-(2-piridyl)-4-nitroso-5-carboxiethyl-

1H-pyrazoles.

W. Gärtner (Max Planck Muelheim)

Light regulated enzyme activities

M. Miragoli (Humanitas Milano)

Towards nano-physiology in mammalian cells: a multi-parametric analysis with

scanning ion conductance microscopy

L. Franzoni (Università di Parma)

Biomolecular NMR, a versatile tool for the understanding of protein science;

retinoid-binding proteins as an example

G.L. Mariottini (Università di Genova)

Application of the multiuse encapsulator agent F-500 for environmental

remediation.

10 |

17.00 FISIOLOGIA CARDIACA moderatore R. Antolini

M. Zaniboni (Università di Parma)

A protocol which combines current- and voltage-clamp provides a novel usefull

three-dimensional representation of the cardiac action potential.

F. Cacciani (Università di Parma)

Spontaneous electrical activity of guinea pig sinoatrial cells under modulation of two

different pacemaker mechanisms.

S. Rossi (Università di Parma)

Arrhythmia susceptibility in senescent rat hearts.

E. Macchi (Università di Parma)

Single low-intensity premature stimuli can induce ventricular arrhythmias in the

normal heart.

18,00 ASSEMBLEA DEI SOCI

VENERDI’ 30 NOVEMBRE

9.00-11.00 ANTROPOLOGIA ED EVOLUZIONE MOLECOLARE

moderatore E. Rabino Massa

C. Stani (Università di Parma)

Complementarietà di spettroscopia FTIR ed analisi istologiche per lo studio del

degrado della pelle mummificata.

C. Milani (Università di Torino)

Stature extimation using mandibular morphometric parameters in italian

population: a preliminary report.

A. Boattini S. Sarno (Università di Bologna)

Variabilità di marcatori uniparentali in popolazioni italiane di diverso grado di

isolamento.

D. Caramelli (Università di Firenze)

Ancient DNA studies: new perspectives on old samples.

P. Anagnostou (Università di Roma “La Sapienza”)

Mine, yours, ours? Sharing data on human genetic variation.

| 11

11.30 – 13.00 METODOLOGIE E TECNICHE DELLA BIOLOGIA SPERIMENTALE

Moderatore S. Abbruzzetti

C. Mandalari (Università di Parma)

A photochromic bacterial photoreceptor as a novel tool for super-resolution

microscopy

E. Polverini (Università di Parma)

Study of the interaction of myelin basic protein with membranes by means of

molecular dynamics simulations.

A. Losi (Università di Parma)

Modulation of the photocycle of a flavin-based photoreceptor by site-directed

mutagenesis

14.00 – 15.30 VISITA AL MUSEO BOTTEGO

Assistenza culturale Prof. C. Modonesi

15.30 – 16.30 PROSEGUE TAVOLA ROTONDA

Moderatore E. Polverini

P. Zizzi (Università di Pavia)

Aspetti non-algoritmici della biologia quantistica

E. Pessa (Università di Pavia)

Verso un modello generale della dinamica del citoscheletro.

A. Rosa (Università di Cagliari)

Nuove metodologie per antichi rimedi: il caso del fungo di Malta.

17.00 PREMIO SIBS

SALUTO CONCLUSIVO DEL PRESIDENTE SIBS

| 13

LETTURA MAGISTRALE SIBS “Gaetano Quagliariello”

Dal neurone al comportamento: il sistema mirror e la cognizione

sociale

Leonardo Fogassi

Dipartimento di Neuroscienze, Università di Parma

Nella concezione classica si considerava che le funzioni cognitive fossero il risultato

di un livello superiore di elaborazione sensoriale, lasciando alla corteccia motoria un

ruolo prevalentemente esecutivo. Gli studi neuroanatomici e neurofisiologici delle

ultime due decadi hanno rivoluzionato questo concetto, portando al riconoscimento

che dal sistema motorio possano emergere numerose capacità cognitive. Un ottimo

esempio di tali capacità è il sistema dei neuroni mirror, originariamente scoperti nella

corteccia premotoria della scimmia. Questi neuroni si attivano sia quando una

scimmia esegue un atto motorio finalizzato (ad esempio afferrare un oggetto) sia

quando osservano un altro individuo svolgere lo stesso atto. Tale funzione è resa

possibile dal fatto che la corteccia motoria contiene le rappresentazioni degli atti

motori contenuti nel repertorio della specie. Confrontando quindi l’atto svolto da un

altro individuo con la rappresentazione motoria dello stesso atto è possibile

comprendere automaticamente lo scopo del comportamento altrui. Se nella scimmia

la comprensione degli atti altrui è probabilmente la funzione preminente del sistema

mirror, nell’uomo un sistema omologo, dimostrato nella corteccia parieto-frontale,

sottostà verosimilmente a svariate funzioni sociali. Tra le funzioni proposte vi sono

l’imitazione, la comprensione dell’intenzione altrui, la comprensione del linguaggio

e l’empatia. Numerosi studi ormai hanno dimostrato la presenza del sistema mirror

nell’uomo e il suo coinvolgimento nelle funzioni suddette. Per il futuro, tre nuovi

sviluppi della ricerca su tale sistema neuronale sembrano essere promettenti. Uno è

l’investigazione di come la funzione di “rispecchiamento” si sviluppi nel bambino e

quale ne possa essere il ruolo. Studi comportamentali, neurofisiologici e di

neuroimmagine suggeriscono che il sistema mirror sia già presente precocemente

nell’ontogenesi e abbia un ruolo importante nello sviluppo della comprensione

dell’azione e, verosimilmente, nell’intersoggettività. Un secondo sviluppo riguarda lo

studio delle sindromi che possono coinvolgere il sistema mirror, quali, ad esempio,

l’autismo. Negli ultimi anni svariati lavori convergono nel proporre che un’anomalia

nell’organizzazione del sistema mirror o del sistema motorio ad esso soggiacente,

possano spiegare alcuni degli aspetti sociali di tale sindrome. Il terzo sviluppo

rappresenta la possibilità di utilizzare le proprietà del sistema mirror per riabilitare

adulti e bambini con deficit motori, basandosi su terapie osservazionali. Alcuni studi

di questi ultimi anni sembrano suggerire un effetto positivo di queste terapie, in

parallelo a modificazioni plastiche delle aree contenenti il sistema mirror.

ABSTRACT COMUNICAZIONI ORALI

Sindrome metabolica

S I N D R O M E M E T A B O L I C A | 19

Simmetrie e rotture di simmetrie tra biologia molecolare, disturbi

dell’umore ed emergentismo personalistico.

1,2

Massimo Cocchi, 1Fabio Gabrielli

1Istituto “Paolo Sotgiu” per la ricerca in Psichiatria e Cardiologia Quantitativa e Quantistica

2Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie

Il ruolo della membrana cellulare (neurone e piastrina)

La membrana delle cellule del cervello sembra offrire una via promettente verso una

migliore comprensione della psicopatologia nei suoi differenti aspetti: Depressione

Maggiore, Disturbo Bipolare e le loro conseguenze sul deficit cognitivo. Diversi

approcci hanno fornito elementi di prova a proposito di quest’argomento. In

particolare, un'ampia letteratura scientifica supporta il suggerimento del gruppo di

Rasenick, cioè, che le piastrine umane servano come marcatori biologici per la

depressione.

Altri autori, vale a dire Cocchi e Tonello (1, 2, 3) hanno studiato le membrane delle

piastrine di soggetti depressi, evidenziando i profili degli acidi grassi come possibile

misura dello stato di membrana.

In particolare, hanno confrontato il profilo delle piastrine degli acidi grassi di

membrana di un gruppo di soggetti clinicamente depressi contro un gruppo di

soggetti sani. I risultati ottenuti con l’impiego di una Rete Neurale Artificiale, nei

due gruppi, hanno evidenziato la possibilità di classificare i Disordini dell’Umore

dalla cosiddetta normalità e, all’interno dei Disordini dell’Umore, di distinguere i

soggetti con Depressione Maggiore da quelli con Disordine Bipolare. I risultati,

inoltre, degli esperimenti degli autori sembrano molto coerenti con quelli ottenuti

sulle proteine-G e sulle zattere lipidiche di membrana delineati dal gruppo di

Rasenick.

La membrana cellulare vive, dunque, in una costante condizione di mobilità e,

quando le oscillazioni degli acidi grassi varcano gli intervalli di tolleranza della

membrana, possono essere espressi fenomeni patologici.

“The mechanical factors of membrane lipids constitute lipid dependent factors that

can dramatically affect protein functions or protein-protein interactions (4). In realtà

la costante condizione di mobilità della membrana, sia per livelli fisiologici sia

sconfinando in conseguenze patologiche, si traduce in una deformazione della stessa

a diversi livelli d’intensità con conseguenze che coinvolgono il raft lipidico di

membrana, la proteina Gsα e il citoscheletro (5).

Adhesion between membrane and cytoskeleton is influenced by a number of factors,

including the lipid composition, cytoskeleton density and distribution, membrane

surface area–to-volume ratio, and internal cellular pressure (6).

In letteratura sono state ampiamente descritte le risposte alle modificazioni indotte

sul citoscheletro da forze di tipo meccanico (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14) esercitate sulla

20 | S I N D R O M E M E T A B O L I C A

membrana.

Tutte le conoscenze acquisite, lo studio delle ipotesi quantistiche della coscienza,

l’opportunità del dialogo che si è aperto all’interno del Quantum Paradigm

Psychopathology Group (QPP), tutto questo ha certamente contribuito alla

costruzione di un nuovo tentativo d’ipotesi che parrebbe potere conciliare quelle

precedenti le quali, in realtà, sono solamente frutto di modi diversi di guardare allo

stesso fenomeno.

Lo stato di continuo rinnovo e scambio di acidi grassi da parte della membrana con

conseguente deformazione del bilayer lipidico, può essere pensato nei termini di una

forza meccanica, sia in condizioni fisiologiche sia patologiche, che si esercita sul

citoscheletro con carattere di continuità consentendo, quando sussistano condizioni

fisiologiche per la membrana, periodi di decoerenza dei microtubuli (500ms), che

danno origine alla manifestazione cosciente che si tradurrà in coscienza classica,

neurocorrelata.

Il problema che si pone è di comprendere come, nelle diverse condizioni dei

disordini dell’umore, la decoerenza possa modificarsi allungando o accorciando il

periodo (< o > di 500ms).

Avendo avuto la possibilità di comprendere che una maggiore mobilità della

membrana caratterizza la DM e una minore il DB, si è percepito che esistono

condizioni patologiche di deformazione della membrana che possono esercitare

differenti forze meccaniche sul citoscheletro dall’interno della stessa membrana e

che potrebbero compromettere il fisiologico fenomeno di superposition dei

microtubuli e conseguentemente il periodo di oscillazione.

Nel caso del DB ci sarebbe un accorciamento del periodo di decoerenza mentre nel

caso della DM un allungamento.

A questa eventualità potrebbero corrispondere, in casi di estrema criticità dei tempi

di decoerenza, profonde e decisive modificazioni dello stato cosciente.

Avendo dimostrato che fra DM e DB esiste una rottura di simmetria, tenendo sempre

presenti le caratteristiche di mobilità della membrana, che esiste un”domain wall”

governata da forze elettromagnetiche che sono verosimilmente l’unica forma di

comunicazione fra i due fenomeni (DM e DB) e che l’unica cosa, pertanto, che può

accumunare le due condizioni è il suicidio, sembra coerente pensare che tal evento

possa realizzarsi per condizioni critiche dell’allungamento o accorciamento dei

periodi di decoerenza, quindi della capacità di coscienza.

Questa forza, che nel caso del neurone potrebbe essere definita “neuromeccanica”,

rappresenterebbe, di fatto, l’elemento condizionante la cabina di regia dei

microtubuli e condizionante il loro rapporto di criticità con le sinapsi, la corteccia e

la serotonina (15).

L’accostamento ai processi di coscienza, nelle loro dinamiche normali e patologiche,

non puó, tuttavia, fissarsi su elementi e piani isolati, osservabili da un osservatore

privilegiato e distaccato, bensì pensando, e agendo operativamente, per connessioni,

relazioni, reti. Il tutto, sempre nella convinzione che la scienza è narrazione di un


mondo espressivo di stati emergenti - per questo mai riducibile alla semplice somma

dei suoi ingredienti elementari - e in cui le rotture di simmetria garantiscono

molteplicità, creatività, vitalità, nel segno dell’autorganizzazione naturale,

dell’evolversi dei sistemi, grazie alle rotture spontanee di simmetrie, verso stati

vieppiú complessi e imprevedibili, tra cui la persona come relazione emergente.

Bibliografia

1. Cocchi M, Tonello L (2010). Bio molecular considerations in Major Depression and

Ischemic Cardiovascular Disease. Central Nervous System Agents in Medicinal

Chemistry.10: 2, 97-107.

2. Cocchi M, Tonello L, Rasenick Mark M (2010) Human depression: a new approach in

quantitative psychiatry. Annals of General Psychiatry. 9:25.

3. Tonello L, Cocchi M. (2010). The Cell Membrane: Is it a Bridge from Psychiatry to

Quantum Consciousness? NeuroQuantology. 8: 1, 54-60.

4. McIntosh TJ, Simon SA (2006) Roles of bilayer material properties in function and

distribution of membrane proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36:177–98.

5. Cocchi M, Gabrielli F, Tonello L, Pregnolato M (2010) The Interactome Hypothesis of

Depression. NeuroQuantology, 4: 603-613).

6. Sheetz MP, Sable JE and Döbereiner HG (2006) Continuous Membrane-Cytoskeleton

Adhesion Requires Continuous Accommodation to Lipid and Cytoskeleton Dynamics.

Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35:417–34.

7. Chifflet S and Hernandez JA (2011) The PlasmaMembrane Potential and the Organization of

the Actin Cytoskeleton of Epithelial Cells, International Journal of Cell Biology Volume

2012 Article ID 121424, 13 pages, doi:10.1155/2012/121424.

8. Sun M, Northup N, Marga F, Huber T, Byfiel dFJ, Levitan I and Forgacs G (2007) The effect

of cellular cholesterol on membrane cytoskeleton adhesion, J Cell Sci 120: 2223-31.

9. Yap B, Kamm RD (2005) Cytoskeletal remodeling and cellular activation during

deformation of neutrophils into narrow channels. J Appl Physiol 99: 2323–2330.

10. Hoover RL, Fujiwara K, Klausner RD, Bhalla DK, Tucker R, Karnovsky MJ (1981) Effects

of Free Fatty Acids on the Organization of Cytoskeletal Elements in Lymphocytes,

MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY 10: 939-948.

11. Apodaca G (2002) Modulation of membrane traffic by mechanical stimuli. AJP-Renal

Physiol 282: F179-F190.

12. Namikoshi M, Suzuki S, Meguro S, Kobayashi H, Mine Y and Kasuga I (2002) Inhibitors of

Microtubule Assembly Produced by the Marine Fungus Strain TUF 98F139 Collected in

Palau. Journal of Tokyo University of Fisheries 88: 1-6.

13. Janmey P. (1995) Cell Membranes and the Cytoskeleton, Chapter 17, Handbook of

Biological Physics, Volume 1, edited by R. Lipowsky and E. Sackmann, Elsevier Science

B.V.

14. Janmey PA, and McCulloch CA (2007) Cell Mechanics: Integrating Cell Responses to

Mechanical Stimuli, Annu. Rev. Biomed. Eng 9:1–34.

15. Cocchi M, Tonello L, Gabrielli F, Pregnolato M. & Pessa E. (2011). Quantum Human &

Animal Consciousness: A Concept Embracing Philosophy, Quantitative Molecular Biology

& Mathematics. Journal of Consciousness Exploration & Research, 2: 547-574).

Corresponding Author: Massimo Cocchi e-mail [email protected]

mailto:[email protected]


Sindrome metabolica e performance cognitiva nell’anziano

Marianna Rinaldi (1)

, Giuseppe Graffi (2)

, Salvatore Gallone (3)

, Emma Rabino

Massa.(1)

(1)

Laboratorio di Antropologia, Dipartimento di Biologia Animale e dell’Uomo, Università degli

Studi di Torino, Via Accademia Albertina 13, 10123 Torino. (2)

ASL TO3, Distretto di Susa, piazza San Francesco 4, 10059, Susa (TO). (3)

Laboratorio di Neurogenetica, Dipartimento di Neuroscienze, Via Cherasco 15, 10126 Torino.

La Sindrome Metabolica (MetS) è un insieme di alterazioni ognuna delle quali

rappresenta di per sé un fattore di rischio cardiovascolare (obesità di tipo centrale,

iperglicemia, dislipidemia ed ipertensione). In diversi studi recenti la MetS è stata

correlata ad un accelerato declino cognitivo in età senile. Il nostro studio si è

proposto di analizzare la relazione tra MetS e performance cognitiva in un gruppo di

anziani appartenenti ad alcune comunità rurali della Val Cenischia (Piemonte).

È stato reclutato un campione di 199 persone (111 donne e 88 uomini) di età

superiore ai 60 anni in cui è stata valutata la presenza di MetS secondo i criteri

diagnostici previsti dal NCEP ATP III aggiornato (2004). Inoltre ad ogni paziente è

stato somministrato il Mini Mental State Examination (MMSE) per valutarne lo stato

cognitivo.

La prevalenza della MetS nel campione esaminato è pari al 50,3% (donne: 49,5%;

uomini: 51,3%). I dati relativi al MMSE rivelano un declino cognitivo nel 10,1% del

campione (MMSE 23,9). Il 6,6% del campione presenta risultati borderline (MMSE

tra 24,0 e 24,9), mentre l’83,3% ottiene un punteggio normale (MMSE 25,0).

I risultati confermano il legame esistente tra sindrome metabolica e peggiori

performance cognitive nell’anziano in quanto dall’elaborazione dei dati emerge che

esiste una associazione significativa tra punteggi borderline al test MMSE e presenza

di sindrome metabolica (OR=3,78; IC95%: 1,0-14,3).

La ricerca ha ricevuto l’approvazione del Comitato di Bioetica d’Ateneo

dell’Università di Torino.

Corresponding Author: Marianna Rinaldi e-mail [email protected]



Sindrome metabolica

Massimo Gualerzi

Fondazione Don Gnocchi - Parma

Il termine “sindrome metabolica” descrive un insieme di fattori di rischio metabolici

che aumentano la possibilità di sviluppare malattie cardiache, ictus e diabete. La

causa della sindrome metabolica risiede principalmente nelle cattive abitudini di

vitacee a loro volta conducono all’affermarsi di quelle condizioni che

determineranno la sindrome stessa come l’ipertensione la dislipidemia l’obesita e il

diabete. Tra i fattori acquisiti predisponesti quello di maggiore interesse è presenza

di una eccessiva quantità di grasso corporeo, specie a livello dell’addome,

determinata dalle cattive abitudini alimentari e dallo scarso esercizio fisico.

La sindrome metabolica viene diagnosticata quando sono presenti tre o più dei

seguenti fattori di rischio:

elevata quantità di tessuto adiposo addominale (valutata mediante la

misurazione della circonferenza della vita): sono considerati patologici valori

superiori a 94 cm nell’ uomo e superiori a 80 cm nella donna)

basso colesterolo HDL (il cosiddetto “colesterolo buono”): meno di 40 mg/dl

nell’uomo e meno di 50 mg/dL nella donna)

elevati livelli di trigliceridi: valori superiori a 150 mg/dL

elevati valori di pressione arteriosa: superiore a 135/85 mmHg o qualora sia

già in corso una terapia antipertensiva)

elevati livelli di glicemia: glicemia a digiuno superiore a 100 mg/dL.

La presenza di tre o più di questi fattori di rischio è un segno che l’organismo è

resistente all’azione dell’ insulina, un importante ormone prodotto dal pancreas.

Quando è presente una condizione di resistenza all’insulina è necessaria una quantità

di insulina maggiore rispetto alla norma per mantenere normali livelli di glicemia. Il

riscontro di valori elevati di insulina nel sangue a fronte di valori normali di glicemia

rappresenta un indice indiretto di tale condizione.

Chi corre il rischio di sviluppare la sindrome metabolica?

La sindrome metabolica è molto frequente nella popolazione, e il rischio di

sviluppare la sindrome cresce con l’aumentare dell’età.

Una persona può considerarsi a rischio per lo sviluppo della sindrome metabolica se

non svolge attività fisica e se:

-è aumentato di peso, specie a livello della circonferenza della vita (questa semplice

misurazione è un indice di eccessiva espansione del tessuto adiposo viscerale, quello,

cioè, che si trova all’interno dell’addome e circonda i visceri)


-ha una storia di diabete

-ha elevati livelli di trigliceridi nel sangue

-ha elevati valori di pressione arteriosa

La maggior parte delle persone che ha la sindrome metabolica si sente bene e

frequentemente non presenta sintomi; tuttavia queste persone hanno un rischio

maggiore di sviluppare in futuro malattie gravi come diabete e patologie

cardiovascolari, soprattutto in presenza di familiarità positiva e sono chiamate quindi

a modificare fortemente le proprie abitudini alimentari e iniziare un trattamento.

Come si cura la sindrome metabolica?

Il modo migliore per curare la sindrome metabolica è aumentare l’attività fisica e

ridurre il peso corporeo; è oggi inoltre possibile agire associando alla dieta

nutraceutici, prodotti che, sfruttando l’effetto, noto, di alcune componenti naturali,

agiscono in modo deciso e sostanziale in associazione alla modifica dello stile di vita

nel ridurre il rischio e nel riequilibrare le alterazioni biochimiche presenti. Stiamo

parlando principalmente degli Omega 3 e del riso rosso fermentato Monascus

purpureus come elementi in grado di sfiammare, ridurre i trigliceridi il colesterolo e

quindi di ridurre notevolmente il rischio cardiometabolico.

Conclusioni

Ricordare che la perdita di peso e l’attività fisica sono le armi migliori per prevenire

e trattare la sindrome metabolica; è importante sapere se si è affetti o meno dalla

sindrome metabolica per poter mettere in atto cambiamenti nello stile e iniziare ad

assumere adiuvanti nutraceutici prima che compaiano severe complicazioni.

Corresponding Author: Massimo Gualerzi

Specialista in Cardiologia

U.O. Prevenzione e Riabilitazione Cardiovascolare

Fondazione Don Gnocchi - Parma


Metabolic syndrome and cardiovascular risk: contribution of

ultrasonography

Santovito D, Graziano G(*), Moschetta A, Minerva F, Sacco C, Pontrelli D,

Palmieri V.O., Palasciano G

Clinica Medica “A. Murri” – Dipartimento di Scienze Biomediche ed Oncologia Umana – Università

degli Studi di Bari

(*) Istituto Mario Negri Sud - Chieti

Background and aims: Metabolic syndrome (MetS) is a term used to explain the co-

occurrence of several conditions related to central obesity and insulin resistance that

also includes impaired glucose metabolism, dyslipidemia, and high blood pressure.

The presence of MetS increases the cardiovascular risk. The distribution of regional

fat as well as the presence and the severity of steatosis and the intima media

thickness are believed to have a specific role as cardiovascular risk factors.

Ultrasonography may play a unique role in this context since it allows to evaluate in

a single clinical session most of these factors and therefore to give specific

information on the prognosis of patients affected by MetS and diabetes.

The aim of this work is therefore to evaluate the contribution of ultrasonograpghy to

the study of MetS and the cardiovascular risk.

Patients and methods: we enclosed in the study 404 patients (F 203, mean age 56,9;

M 201, mean age 53,6) admitted in our department for the evaluation of MetS. The

diagnosis of MetS on the basis of the NCEP ATP III criteria (2001) was confirmed in

309 patients (F 165, mean age 57,3, M 144, mean age 53,8). All patients underwent a

complete clinical and biochemical standard evaluation for each component of MetS;

abdominal ultrasonography was performed and the presence and severity of steatosis

as well as the thickness of subcutaneous, preperitoneal and visceral fat were

recorded; the cardiac ultrasonography revealed ventricular mass and interventricular

septum thickness; intima media thickness was finally evaluated. Data are expressed

as M+SD. Comparison between means and frequency and multivariate logistic

analysis were ruled out for the statistical evaluation.

Results: Patients with and without MetS differed for ALT [53.71 (26.26)vs50.98

(29.33)], BMI [32.93 (5.75)vs30.36 (6.70)], waist circumference [110.62

(11.71)vs102.78 (13.14)], HDL chol [40.61 (9.69)vs52.35 (11.10)], GGT [53.98

(50.60)vs42.89 (43.44)], glycemia [119.88 (41.68)vs95.22 (21.15)], steatosis grade

[1.27 (0.69)vs0.92 (0.74)], US visceral fat (mm) [84.60 (85.07)vs64.71 (28.81)],

HbA1C [6.56 (1.53)vs5.90 (1.33)], HOMA test [7.55 (6.42)vs3.43 (2.99)], insulin

[26.87 (19.39)vs15.48 (14.14)], microalbuminuria [74.62 (277.64)vs24.94 (51.14)],

systolic pressure [136.53 (15.65)vs130.18 (15.99)], cardiovascular risk (PROCAM)


[16.47 (16.39)vs8.24 (7.66)], tryglicerides [185.62 (163.61)vs101.92 (39.37)].

Patients with (n=368) and without (n=36) steatosis differed for BMI [32.76

(5.98)vs27.86 (5.32)], waist circumference [109.88 (12.02)vs97.46 (11.73)], HDL

chol [42.64 (10.42)vs50.83 (15.56)], LDL chol [131.12 (35.10)vs110.06 (33.77)],

GGT [52.97 (50.77)vs34.53 (21.00)], glycemia [115.90 (39.93)vs95.53 (25.68)], US

preperitoneal fat [14.46 (13.24)vs12.01 (6.19)], US subcutaneous fat [17.17

(12.83)vs13.60 (4.73)], US visceral fat [82.85 (78.86)vs50.51 (26.24)], HOMA test

[6.93 (6.13)vs1.86 (1.42)], n criteria MetS [3.30 (1.11)vs2.14 (1.17)], tryglicerides

[171.51 (153.21)vs109.03 (67.05)].Patients with (n=107) or without (n=297)

microalbuminuria differed for ALT [54.58 (24.77)vs52.53 (27.77)], HDL chol [40.60

(10.00)vs44.34 (11.44)], Ejection fraction [56.73 (2.85)vs57.36 (3.03)], GGT [58.17

(40.42)vs48.96 (51.85)], glycemia [129.43 (44.16)vs108.64 (35.91)], US steatosis

grade [1.38 (0.72)vs1.11 (0.70)], US visceral fat [81.07 (25.63)vs79.57 (87.48)],

HOMA test [8.81 (7.25)vs5.80 (5.37)], n. criteria for MetS [3.50 (1.05)vs3.09

(1.19)], systolic pressure [138.50 (17.74)vs133.79 (15.08)], PROCAM risk [19.00

(16.87)vs12.95 (14.28)], tryglicerides [189.03 (198.88)vs157.62 (125.06)],

visceral/subcutaneous ratio [6.08 (3.30)vs5.05 (2.62)]. Multivariate logistic analysis

(O.R., 95% OR CI) showed for: MetS a correlation with systolic pressure (1.04,

1.01-1.06), PROCAM risk (1.06, 1.02-1.11), glycemia (1.04, 1.02-1.07),

tryglicerides (1.01, 1.01-1.02), HDL chol (0.92, 0.88-0.95); steatosis a correlation

with HDL chol (0.96, 0.92-1.00), LDL chol (1.03, 1.01-1.05), US visceral fat (1.03,

1.01-1.06), insulin levels (1.14, 1.04-1.24); microalbuminuria a correlation with

RCV PROCAM (1.02, 1.00-1.03) and the diagnosis of MetS (1); cardiovascular

risk a correlation with HDL chol (0.91, 0.88-0.94), LDL chol (1.02, 1.01-1.03), age

(1.15, 1.10-1.19), smoking (1.06, 1.04-1.09), subcutaneous fat (0.91, 0.86-0.96),

diabetes (4.80, 2.52-9.14).

Conclusions: a complete evaluation of MetS and of the related cardiovascular risk

seems to need the execution of ultrasonography not only for the detection of well

known conditions associated to the MetS (e.g. biliary litiasis, steatosis, PCOS) but

also in order to gain important information for the prognosis of this syndrome. Our

data show that US regional fat distribution study has a predictive value for steatosis,

microalbuminuria and cardiovascular risk higher than the waist circumference in

patients with MetS.

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Fisiologia cardiaca

28 | F I S I O L O G I A C A R D I A C A

F I S I O L O G I A C A R D I A C A P a g . | 29

A protocol which combines current – and voltage-clamp provides a

novel useful three-dimensional representation of the cardiac action

potential

Massimiliano Zaniboni*#, Francesca Cacciani

*

* Department of Biosciences, University of Parma, Italy

# Center of Excellence for Toxicological Research, University of Parma, Italy

The cardiac cellular action potential (AP) describes the electrical activity of heart

cells by means of a function (membrane potential Vm) of a single variable (time).

Though invaluable for the study of cardiac electrophysiology, this type of

representation is intrinsically limited by the fact that substantially different

membranes can display very similar or even identical APs (1,2), endowed with quite

different dynamical properties. A compact representation of cardiac AP properties in

terms of current source, would be beneficial for cardiac electrophysiological

research.

Based on previous patch clamp (3) and modelling (1,4-6) studies, we present here a

protocol which combines current- and voltage-clamp in order to measure

instantaneous current-voltage relationships during AP repolarization, and generates

three-dimensional time-voltage-current surfaces, which compactly describe several

key dynamic features of the corresponding membrane.

A preliminary and incomplete version of the

procedure has been applied on real

enzymatically isolated guinea pig cardiac

ventricular myocytes (Figure 1). During the

repolarization of an electrically elicited

(current clamp) AP, and at different time

delays after AP overshoot (see arrows in

Figure 1), the membrane was voltage

clamped for 50 ms at the Vm occupied by AP

trajectory at that time (Vmt), and, in

subsequent runs, at Vmt -10 mV, and at Vmt

+10 mV. The ion current (Iion) flowing

during each step was recorded (bottom panel

of Figure 1) and allowed to draw

instantaneous current-voltage relations at

each repolarization time. The “in silico”

version of the protocol allows higher time and voltage (and therefore current) –

resolution, and is applied here on a human ventricular AP model (7). Voltage clamp


steps were applied every 1 ms during AP repolarization (only 5 representative

examples are reported in Figure 2A), and Vm clamped, at each time, every 1 mV

starting from - 120 mV up to + 40 mV. From the Iion density generated by the models

equation system during each step (Figure

2B), the Iion value (measured 1 ms after

the onset of the step) was taken to

construct an instantaneous Iion-Vm curve

at any given time of AP repolarization

(Figure 2C). Furthermore, the capacitive

current (IC) density (-dV/dt), flowing at

each time during AP repolarization, was

added to Iion for each Iion-Vm curve,

leading to a collection of Im-Vm curves,

where Im is membrane current (Im = IC +

Iion) density. The collection of Im-Vm

plots (see representative examples in

panel D) generates a 3D surface (panel

E) where x is time, y is Vm and z is Im.

The AP profile lies on the region where

such surface intersects the Im = 0 plane.

The model was recompiled in its Matlab

version by means of COR facility at

“http://cor.physiol.ox.ac.uk”. The three-

dimensional AP representation allows to easily estimate membrane resistance (the

inverse of the slope of Im-Vm slices) during repolarization, which is a key factor

involved in its electrotonic modulation. The 3D surface also shows that, during late

repolarization phase, membrane conductance becomes negative (white arrow in

figure 2E), which leads to the novel finding that, at this time, repolarization is auto-

regenerative, i.e. the ventricular membrane acts as a repolarizing source of current.

An additional number of relevant features concerning repolarization dynamics are

compactly contained in the 3D AP representation that we present here, and which we

propose therefore as a new useful tool for both in vivo and in silico cardiac cellular

electrophysiological investigations.

Reference

1. M. Zaniboni, I. Riva, F. Cacciani, and M. Groppi, “How different two almost identical action

potentials can be: a model study on cardiac repolarization”, Math. Biosci. vol. 228(1), pp. 56-70.

2010.

2. E.M. Cherry and F.H. Fenton, “A tale of two dogs: analyzing two models of canine ventricular

electrophysiology.” Am J Physiol Heart Circ Physiol. vol. 292:H43-55, 2007.

3. M. Zaniboni, A.E. Pollard, L. Yang, and K.W. Spitzer, “Beat-to-beat repolarization variability in

ventricular myocytes and its suppression by electrical coupling”, Am J Physiol Heart Circ

Physiol. vol. 278, pp. H677-87, 2000.


4. M. Zaniboni, “3D current-voltage-time surfaces unveil critical repolarization differences

underlying similar cardiac action potentials: A model study”, Math Biosci. Vol. 233, pp.98-110.

2011.

5. M. Zaniboni, “Late phase of repolarization is autoregenerative and scales linearly with action

potential duration in mammals ventricular myocytes: a model study” IEEE Trans Biomed Eng

2012 Jan;59(1):226-33.

6. M. Zaniboni, “Heterogeneity of Intrinsic Repolarization Properties within the Human Heart: New

Insights from Simulated Three-Dimensional Current Surfaces” IEEE Trans Biomed Eng. 2012

Jun 15. in press.

7. L. Priebe and D.J. Beuckelmann, “Simulation study of cellular electric properties in heart

failure”. Circ Res. vol. 82, pp. 1206-23, 1998.

Corresponding Author: Dott. Massimiliano Zaniboni – Dipartimento di Bioscienze,

Università degli Studi di Parma, Tel 0521 905623

e-mail: [email protected]

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9633920



Spontaneous electrical activity of guinea pig sinoatrial cells under

modulation of two different pacemaker mechanisms

Massimiliano Zaniboni*#, Francesca Cacciani

*

* Department of Biosciences, University of Parma, Italy

# Center of Excellence for Toxicological Research, University of Parma, Italy

Spontaneous electrical activity of cardiac pacemaker cells is caused by two main

mechanisms (1): one related to voltage-gated membrane channels, mainly the

hyperpolarization-activated cationic current If (2), the other linked to the

intracellular calcium handling via the Na+/Ca

2+ exchanger, which, activated by the

release of calcium by sarcoplasmic reticulum, provides a cyclic source of inward

current (3). The relative contribution of these two mechanisms to cardiac

pacemaking is still object of debate, and their regulation is of great clinic and

pharmacological interest. The aim of our study was to compare the effect of 3µM

Ivabradine (specific If blocker (4)) and of the same concentration of Ryanodine

(blocker of sarcoplamic calcium release channels (5)) on action potential (AP)

parameters of single cells isolated from guinea-pig sinoatrial node. Analogous

studies have been performed previously on different species (6).

Sinoatrial pacemaker cells, enzimatically isolated from guinea-pig hearts (male

Dunkin Harley weighing 300-400 gr) (2) were transferred in the cell chamber of an

inverted microscope, and perfused in physiological Normal Tyrode (NT) solution at

36°C. Only cells displaying spontaneous and regular contractions were brought in

patch-clamp whole cell configuration, and underwent membrane potential

recordings.

For each of these cells, a sequence of spontaneous APs was recorded for 2-3 minutes,

until a steady-state AP waveform was reached; perfusion solution was then rapidly

switched, by means of an electrovalve, to Ivabradine solution (IVA), and

spontaneous APs recorded until a new steady-state was gained (usually 3 to 5

minutes), then again to NT until recovery of the starting intrinsic configuration. This

protocol was applied on 20 cells; on seven of these, the whole cell patch clamp

configuration lasted enough time to allow testing of Ryanodine solution (RYA) as

well.

Data analysis was performed by means of a dedicated software (Scaldyn), which we

developed in collaboration with the University of Utah (7). The software

automatically calculates, for each beat, the following parameters: maximum diastolic

potential (MDP, mV), AP peak (Vpeak, mV), AP amplitude (APA, mV) and duration

(APD, ms), take-off potential (TOP, mV), and the diastolic depolarization rate

(DDR, V/s). Also, cycle length (the inverse of the pacing frequency, CL, ms) and its


coefficient of variability (CV, %) are calculated. Fig. 1 shows representative

examples of the effect of IVA (top) and RYA (bottom) on APs (left column) and on

CL (right column). Though the time taken to reach the new steady state is quite

different in the examples shown, no stastical difference in this parameter was found

between IVA and RYA.

IVA significantly changed all parameters of AP (n = 20), increasing CL, CV and

APD, depolarizing MDP and TOP and decreasing Vpeak, APA and DDR. On the 7

cells treated with both IVA and RYA, blockers displayed, with respect to NT,

comparable effects on every AP parameter (as shown in the hystogram in Fig. 2). In

particular, both blockers increased CL (by 27 and 30% respectively), and APD (by

31 e 26%), decreased DDR (by 34 and 42%), depolarized TOP (by 7 and 10%). The

only difference recorded was that IVA increased CV of CL much more than RYA

(+59% and +16% respectively). These results, though incomplete, suggest a possible

interest in new pharmacological modulators of cardiac sinus rhythm, which could be

used in addition or as substitutes of the molecules (e.g. Ivabradine, β-blockers)

presently in use.

Fig.1 Fig.2

Fig. 1: Left column: representative examples of the effect of Ivabradine (top) and Ryanodine (bottom)

on steady state AP sequences of guinea-pig sinoatrial cells; controls in black, and blockers in red.

Right column: representative example of time-course of changes of CL secondary to blockers

application.

Fig. 2: Hystogram of the overall effects of blockers on action potential parameters. Data are

normalized to the mean value in NT.


References:

1) Eisner DA & Cerbai E (2009). Beating to time: calcium clocks, voltage clocks, and cardiac

pacemaker activity. Am J Physiol Heart Circ Physiol 296, H561-H562.

2) DiFrancesco D, Ferroni A, Mazzanti M, & Tromba C (1986). Properties of the hyperpolarizing-

activated current (If) in cells isolated from the rabbit sino-atrial node. J Physiol 377, 61–88.

3) Bogdanov KY, Vinogradova TM & Lakatta EG (2001). Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor

and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circ Res 88, 1254-

1258.

4) Bucchi A, Baruscotti M & DiFrancesco D (2002). Current-dependent block of rabbit sino-atrial

node If channels by Ivabradine. J Gen Physiol 120, 1-13.

5) Rousseau E, Smith JS & Meissner G (1987). Ryanodine modifies conductance and gating

behavior of single Ca2+ release channel. Am J Physiol 253, C364-C368.

6) Bucchi A, Baruscotti M, Robinson RB, & DiFrancesco D (2007). Modulation of rate by

autonomic agonists in SAN cells involves changes in diastolic depolarization and the pacemaker

current. J Mol Cell Cardiol 43, 39-48.

7) Lux RL & Ershler PR (2003). Cycle length sequence dependent repolarization dynamics. J

Electrocardiol 36, Suppl:205-208.

Corresponding Author: Dott.ssa Francesca Cacciani – Dip. Bioscienze, Università

degli Studi di Parma Tel 0521 906119 e-mail [email protected]

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=









Arrhythmia susceptibility in senescent rat hearts

Stefano Rossi1, Silvana Baruffi

1, Domenico Corradi

2,3, Sergio Callegari

4, Ezio

Musso1, Andrea Sgoifo

5, Luca Carnevali

5 Michele Miragoli

3 and Emilio Macchi

1,3

1 Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi, Parma;

2 Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali, Università degli Studi,

Parma; 3 Centro di Eccellenza di Ricerca Tossicologica, Università degli Studi, Parma;

4 Reparto di Cardiologia, Ospedale di Vaio, Fidenza;

5 Dipartimento di Neuroscienze, Università degli Studi, Parma.

Background.

Cardiovascular disease increases with age. Significant alterations of cardiac

electrophysiological properties occur during the normal aging process as a result of

structural remodeling of the extracellular matrix, modifications of cell-to-cell

connection between neighboring cardiac myocytes (gap junctions) and changes in

active membrane properties. Even if advanced age appears to be a risk factor for

increased susceptibility to ventricular arrhythmia, a detailed knowledge about

changes in cardiac electrophysiology relevant to arrhythmogenesis in the elderly is

relatively lacking.

Objective.

Thus the aim of the study was to determine specific age-related changes in

electrophysiological properties and myocardial structure of the ventricles which can

be related to a structural-functional arrhythmogenic substrate.

Methods.

Multiple epicardial electrograms were recorded on the ventricular surface of in vivo

control (10 months) and aged (24 months) rats during normal sinus rhythm and

ventricular pacing. Arrhythmia inducibility was tested by premature stimulation and

burst pacing. Fiber architecture, connexin43 (Cx43), connexin40 (Cx40), interstitial

fibrosis and tissue collagen content were determined by (immune)histology, while

proteins content was performed by Western blotting.

Results.

Spontaneous supraventricular and ventricular rhythm disturbances were frequently

observed in aged hearts1. Ectopic beats during premature stimulation and sustained

ventricular arrhythmias during burst pacing were frequently induced in aged hearts

but not in control hearts (Fig.1). Electrophysiological analysis in aged hearts


revealed that PQ duration and total ventricular activation time (QRS duration) were

significantly delayed as compared to control hearts while anisotropic conduction

velocity did not change significantly2. Ventricular activation patterns displayed

variable number, location and time of appearance of epicardial breakthrough points1.

Morphological analysis in aged hearts revealed that heart weight and myocyte

transverse diameter increased significantly, scattered microfoci of interstitial fibrosis

were mostly present in the ventricular subendocardium and gap junction Cx43 and

Cx40 expression decreased significantly in ventricular myocardium, as compared to

controls2.

Fig.1 Different cycles of arrhythmia events in aged heart characterized either by slow propagating

wavefronts circulating around a functionally refractory region or by multiple wavefronts (A).

Subsequent cycles of the arrhythmia were characterized by slow circus movement of reentrant

activation sequences around the same region of functional block or by focal activation spreading with

slow anisotropic conduction velocity (B). Subsequently some of the cycles displayed the same focal

origin as in previous arrhythmic episodes and interestingly the focal activation is localized in the same

point of the BTP during sinus rhythm (C). The arrhythmia terminated with a 5 Hz monomorphic

sequence characterized by wavefronts circulating counter-clockwise around an obstacle in the lower

right area of the electrode array (D). Arrhythmia terminates with spontaneous ventricular activation

characterized by low heart rate (E). During a II episode of VT few beats of focal activation spreading

with slow anisotropic conduction velocity were observed (F).

Conclusion.

Delayed QRS duration, abnormal activation patterns and unchanged ventricular


conduction velocity in aged hearts suggest the occurrence of impaired impulse

conduction through the Purkinje system leading to uncoordinated myocardial

excitation despite structural changes. Impaired interaction between Purkinje system

and ventricular myocardium might create a potential reentry substrate, contributing

to higher vulnerability to ventricular arrhythmias observed in aged hearts. This is

consistent with the occurrence of intermittent focal anisotropic activations, possibly

originating from Purkinje-ventricular junctions, among sequences of wide wavefront

circus movements around a functionally refractory region.

References

1 Rossi S, Baruffi S, Bertuzzi A, Mastorci F, Sgoifo A, Musso E, Corradi D, Maestri R, Brisinda D,

Fenici R, Macchi E. Susceptibility to ventricular arrhythmias in aged hearts. Conf Proc IEEE Eng

Med Biol Soc. 2007; 2007: 410-414.

2 Rossi S, Baruffi S, Bertuzzi A, Miragoli M, Corradi D, Maestri R, Alinovi R, Mutti A, Musso E,

Sgoifo A, Brisinda D, Fenici R, Macchi E. Ventricular activation is impaired in aged rat hearts. Am J

Physiol Heart Circ Physiol. 2008; 295: H2336-2347.

Corresponding Author: Stefano Rossi; Address: Dipartimento di Bioscienze, Parco

Area delle Scienze 11/A, 43124, Parma; Tel Number: 0521905621; e-mail:

[email protected]


Single low-intensity premature stimuli can induce ventricular

arrhythmias in the normal heart

Stefano Rossi1, Silvana Baruffi

1, Sergio Callegari

2, Luca Carnevali

3, Domenico

Corradi4,5

, Michele Miragoli5, Ezio Musso

1, Andrea Sgoifo

3, Mimosa Trombini

1,

Emilio Macchi1,5

1) Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi, Parma

2) Reparto di Cardiologia, Ospedale di Vaio, Fidenza

3) Dipartimento di Neuroscienze, Università degli Studi, Parma

4) Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali, Università degli Studi,

Parma

5) Centro di Eccellenza di Ricerca Tossicologica, INAIL, ex-ISPESL, Università degli Studi, Parma

Background

It is very unusual for single low-intensity premature stimuli to induce ventricular

arrhythmias in the normal heart, even when delivered in succession, whereas strong

electrical stimuli, when properly timed, usually do [1, 2, 3]. Still, we observed that a

single low-intensity premature stimulus could occasionally induce ectopic beats in

normal rat hearts. Surprisingly, by repeating the premature stimulation at the same

ventricular location and with the same coupling interval, the ectopic beats were

consistently induced. Based on these observations, possible hypothesis for the

arrhythmogenesis is that the premature beat can encounter a zone of unidirectional

conduction block to initiate reentry [4]. However, enhanced dispersion of

refractoriness, a necessary condition for initiation of reentry, is unlikely to be present

in normal myocardium [5, 6, 7]. Accordingly, the mechanisms underlying the origin

of the ectopic beats induced by single low-intensity premature stimuli are not

definitely manifest.

Objective

The main objective of the present study was to characterize pacing sites and

critical premature intervals which can induce ectopic beats in the normal heart and to

identify their arrhytmogenic substrate. Therefore we performed high spatial

resolution potential mapping while pacing numerous epicardial sites in normal rats

with a view to identify temporal and spatial properties of possible reentrant

excitations. To evaluate whether spatial dispersion in recovery of excitability might

be important for the occurrence of unidirectional block, we also measured the

effective refractory period (ERP) at each pacing site. These measurements were then

related with the spread of excitation during the onset of the arrhythmia.

Methods


Unipolar electrograms (EGs) were recorded from the anterior ventricular surface

of 20 in vivo adult rats using a 8x8, 1 mm resolution, epicardial electrode array

during sinus rhythm (SR) and premature stimulation. At 18 evenly distributed array

electrodes, regular trains of low-intensity stimuli (two times diastolic threshold) were

followed by a premature stimulus (eight times diastolic threshold) at progressively

shorter coupling intervals, until ERP was reached.

Results

Gradual increase in stimulus prematurity determined a corresponding increase in

latency in impulse initiation as well as decrease in anisotropic conduction velocity.

Ectopic beats were induced when pacing was performed at well-defined sites of right

(RV) and left ventricle (LV) and the premature intervals were almost equal to ERP

values. Ectopic activation patterns were characterized by the appearance on the

paced ventricle of epicardial breakthrough points (BTPs) which gave rise to

wavefronts rapidly propagating in all directions. The location of BTPs was either

coincident with SR BTPs or new BTPs could appear. When the pacing sites were

located on the epicardial projection of the septum, BTPs appeared, in the proximity

of the pacing sites, either on the RV or LV. Regions of critical degree of conduction

and reentry were not observed on the epicardial surface, consistent with the measured

uniform ERP spatial distribution.

Conclusion

The appearance of BTPs during the ectopic activation patterns is the epicardial

manifestation of wavefronts originating from underlying Purkinje fiber-ventricular

muscle junctions (PVJs). Thus, our findings suggest that a critically premature beat

can encounter an appropriate substrate for unidirectional block and reentrant

excitation at underlying PVJs where intrinsically different action potential durations

are normally present at the two sides of the PVJ due to appreciably longer

repolarization time of Purkinje fibers [8, 9].

Exactly the same issue would face a local spontaneous excitation in normal

myocardium, such as a premature ventricular complex eventually caused by an early

afterdepolarization, originating at a critical time during the repolarization phase of a

sinus beat. Although in the normal myocardium ventricular arrhythmias rarely occur

spontaneously, their incidence might be favored by the presence of reentrant ectopic

beats especially when dispersion of refractoriness is increased, such as during

enhanced activity of the sympathetic nervous system [10].

References

1) Winfree AT. Electrical instability in cardiac muscle: phase singularities and rotors. J Theor Biol.

1989; 138: 353-405.


2) Gotoh M, Uchida T, Mandel WJ, Fishbein MC, Chen PS, Karagueuzian HS. Cellular graded

responses and ventricular vulnerability to reentry by a premature stimulus in isolated canine

ventricle. Circulation. 1997; 95: 2141–2154.

3) Janse MJ. Vulnerability to ventricular fibrillation. Chaos. 1998; 8: 149-156.

4) Kléber AG, Rudy Y. Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated

arrhythmias. Physiol Rev. 2004; 84: 431-88.

5) Allessie MA, Bonke FI, Schopman FJ. Circus movement in rabbit atrial muscle as a mechanism

of tachycardia. II. The role of nonuniform recovery of excitability in the occurrence of

unidirectional block, as studied with multiple microelectrodes. Circ Res. 1976; 39: 168-177.

6) Burton FL, Cobbe SM. Dispersion of ventricular repolarization and refractory period. Cardiovasc

Res. 2001; 50: 10-23.

7) Coronel R, Wilms-Schopman FJ, Opthof T, Janse MJ. Dispersion of repolarization and

arrhythmogenesis. Heart Rhythm. 2009; 6: 537-43.

8) Myerburg RJ, Stewart JW, Hoffman BF. Electrophysiological properties of the canine peripheral

A-V conducting system. Circ Res. 1970; 26: 361-378.

9) Mendez C, Mueller WJ, Merideth J, Moe GK. Interaction of transmembrane potentials in canine

Purkinje fibers and at Purkinje fiber–muscle functions. Circ Res 1969;24:361-372.

10) Schwartz PJ, Stone HL. The role of the autonomic nervous system in sudden coronary death. Ann

N Y Acad Sci. 1982; 382: 162-80.

Corresponding author: Emilio Macchi; address: Dipartimento di Bioscienze, Viale

Parco Area delle Scienze 11/A, Università degli Studi, Parma; telephone: 0521 906

116; e-mail: [email protected]

| 41

Antropologia ed

evoluzione molecolare

42 | A N T R O P O L O G I A E D E V O L U Z I O N E M O L E C O L A R E

A N T R O P O L O G I A E D E V O L U Z I O N E M O L E C O L A R E | 43

Complementarietà di spettroscopia FT-IR ed analisi istologiche per

lo studio del degrado della pelle mummificata.

Mariachiara Stani1, Andrea Baraldi

1, Rosa Boano

2, Rosangela Cinquetti

3, Maria

Grazia Bridelli1

1.Dipartimento di Fisica e Scienze della Terra, Università di Parma.

2.Dipartimento di Biologia Animale ed Umana, Università di Torino.

3.Dipartimento di Bioscienze, Università di Parma.

La collezione di mummie egiziane del museo di Antropologia ed Etnografia

Giovanni Marro dell’Università degli Studi di Torino rappresenta un patrimonio di

informazioni preziosissime per poter comprendere quali fossero le antiche tecniche

di mummificazione. La presenza sia di mummie naturali (di epoca predinastica) che

di mummie sottoposte a procedimenti di imbalsamazione (tipici delle epoche

dinastiche) permette, utilizzando specifiche tecniche diagnostiche, di stabilire quale

sia lo stato di conservazione di questi reperti sia in riferimento al diverso

procedimento di mummificazione subito, sia in relazione alle diverse condizioni di

seppellimento a cui furono sottoposte. E’ inoltre possibile monitorarne costantemente

i processi di invecchiamento e di deterioramento da parte di fattori endogeni ed

esogeni al fine di stilare specifici protocolli di conservazione. Le tecniche utilizzate

in questo studio sono state la Spettroscopia Infrarossa a Trasformata di Fourier (FT-

IR) e una serie di analisi istologiche. Tutti i campioni antichi sono stati messi a

confronto con campioni di riferimento di pelle moderna analizzati con le medesime

tecniche.

La pelle è costituita da una serie di strati che è possibile distinguere sommariamente

in epidermide, derma ed ipoderma. L’epidermide a sua volta è costituita da differenti

strati di cellule che si differenziano fra loro per un progressivo accumulo,

dall’interno verso l’esterno, di cheratina. Il derma è costituito invece

prevalentemente da fasci di fibre collagene, intervallati da sottili fibre elastiche, il

tutto immerso insieme ad una serie di altri elementi come ghiandole e bulbi piliferi in

una matrice di glicosaminoglicani. Infine l’ipoderma è costituito prevalentemente da

tessuto adiposo.

Dallo spettro infrarosso della pelle è possibile ottenere informazioni che riguardano

tutte le classi di composti che costituiscono questo tessuto ma in particolare le

proteine. Nell’intervallo di frequenze compreso tra 1650 cm-1

e 1550 cm-1

infatti si

riscontrano gli assorbimenti della banda Amide I, dovuta allo stretching del legame

C=O, e della banda Amide II dovuta al bending del legame N-H ed allo stretching

del legame peptidico C-N (1). Attraverso un procedimento di curve fitting iterativo

eseguito sulla banda Amide I, si possono ottenere informazioni sulla struttura

secondaria delle proteine. Il risultato generale delle misure suggerisce una

diminuzione del quantitativo di struttura ad alfa elica a favore di un incremento della


struttura beta (2, 3), con notevole variabilità da un campione all’altro, in dipendenza

dal trattamento di imbalsamazione subito. Questo dato è indicativo di una

modificazione conformazionale delle proteine presenti dovuta a fenomeni di degrado

occorsi nel tempo. Le informazioni ottenute dall’analisi degli spettri FTIR possono

essere correlate alle diverse classi di proteine della pelle quali cheratina, elastina e

collagene, mediante studi istologici dei campioni. L’analisi istologica ha permesso

l’osservazione morfologica dei tessuti mummificati, l’identificazione dei diversi

strati costituenti la pelle e il loro stato di conservazione. È stato infatti possibile

notare che, oltre alla totale assenza dell’epidermide, sono presenti sostanziali

differenze fra reperti sottoposti ai due differenti processi di mummificazione,

evidenziabili in particolare nel diverso aspetto morfologico e livello di conservazione

delle fibre collagene (4-5).

L’accostamento delle due tecniche di indagine, in conclusione, si è rivelato

estremamente utile perché è stato possibile confrontare i dati ottenuti separatamente

mediante le due metodologie e constatare che questi risultano complementari ed

integrativi gli uni degli altri.

Bibliografia:

1. Torii, H., Tasumi, M. (1996). Theoretical analyses of the Amide I infrared bands of globular

proteins, in Infrared Spectroscopy of Biomolecules. H. H. Mantsch and D. Chapman eds., J.

Wiley & sons, inc. NY. Pp. 1-18.

2. Byler, D. M., and Susi, H. (1986). Examination of the secondary structure of proteins by

deconvolved FTIR spectra. Biopolymers, 25(3): 469 – 487.

3. Bridelli, M. G., Dell’Anna, A., Stani, C., Baraldi, A., Boano, R., De Iasio, S. FT-IR spectroscopy

and microspectroscopy of ancient Egyptian embalmed heads from the Museum of Anthropology

and Ethnography of the University of Turin. 2nd Bolzano Mummy Congress – Mummies from

the ice (Bolzano, Italy, 20 – 22 October 2011). Proceedings pp. 51.

4. Byung Soo Chang, Chang Sub Uhm, Chang Hyun Park et al. (2006). Preserved skin structure of a

recently found fifteenth-century mummy in Daejeon, Korea. Journal of Anatomy 209: 671- 680.

5. Montes, G.S., Kriszta´n, R.M., Junqueira, L.C., (1985). Preservation of elastic system fibers and

of collagen molecular arrangement and stainability in an Egyptian mummy. Histochemistry

83:117–119.


FIG. 1: a – Confronto spettri FT-IR delle pelle moderna e della pelle di mummia predinastica; b –

Fitting della banda Amide I della pelle moderna; c – Fitting della banda Amide I della pelle di

mummia predinastica; Tabella: Confronto tra le percentuali delle strutture secondarie.

FIG 2: a – Immagine al microscopio ottico della pelle di mummia predinastica; b – Immagine al

microscopio ottico della pelle di mummia imbalsamata.


Stature estimation using mandibular morphometric parameters in

Italian population: a preliminary report

Chantal Milani, Rolando Milani, Gian Luigi Panattoni.

Department of Neurosciences, University of Turin.

INTRODUCTION

Stature estimation is one of the most important parameters in personal identification.

Physical and forensic anthropologists can extimate stature from human remains in

order to define a general profile of the victims [1-5]. It often occurs that fragmented

or incomplete human remains are found by investigators. In literature, anatomical

methods based on measurements of the whole skeleton or mathematical methods

based on measurements of single bones, have been developed. By these methods

regression formulae for calculating the stature were obtained. Since abnormal

development of the mandible is involved in growth disorders [6-8], we investigated

possible correlations between some mandibular morphometric parameters and stature

in normal subjects of Italian population in relation to personal identification in

anthropologic or forensic practice.

MATERIALS AND METHODS

Measures were acquired in 41 individuals of both sexes (31 males ranging from 20 to

56 years old, 10 females ranging from 20 to 61 years old) from Caucasian Italian

population (born in Italy and with Italian parents). Stature and distances between the

following cephalometric landmarks of both mandibular sides were measured: co-co

(bicondylar distance); go-go (bigonial distance); co-go (condylion-gonion distance);

go-gn (gonion-gnathion distance). The stature of the subjects was measured in

standing position to the vertex by using a non-stretch, retractable anthropometric

tape. The mandibular parameters were measured by a digital anthropometric head

caliper. Mandible dimension (MD) were considered as the sum of the co-go-gn

distances of both sides. The possible statistical relationships between MD and the

measured living stature (MLS) were investigated by Pearson correlation analysis (r

coefficient) in order to obtain the estimated living stature (ELS).


RESULTS

Mean age and MLS of the specimens are reported in Table 1.

MEAN AGE

(in years)

MEAN MLS

(in cm)

MALES 30.5 176

FEMALES 29.8 161.6

Table 1. Mean age and MLS of the observed specimens.

In the whole sample, ELS is expressed by the regression formula:

ELS= 2.6965 x P + 89.879

with Standard Deviation = 4% and Standard Error = 5%.

The r coefficient between MD and MLS is 0.63.

DISCUSSION

As the estimated living stature obtained by mathematical method is population-

specific, in this preliminary report we examined in particular a sample of Caucasian

Italian population. We choose the sum of bilateral co-go-gn distances as a reference

dimension of the mandible because these values seem to be the most significant for

representing mandibular growth. In fact, the mandible grows with a progressive

posterior increase in length of the body and in height of the rami. In literature, some

researches [9-11] show a very low correlation between mandibular morphometry and

stature, while in other works [12] the correlation is moderate like the one showed by

our data; these differences could be due to the various factors that affect the

mandibular growth (e.g., orthodontic treatments).

References:

1) Fully G., Pineau H. Détermination de la stature au moyen du squelette. Ann. Med. Leg., 1960, 40:

145–154.

2) Raxter M.H., Auerbach B.M., Ruff C.B. Revision of the Fully technique for estimating statures.

Am. J. Phys. Anthropol., 2006,130: 374-84.

3) Krogman W.M., İşcan M.Y. Calculation of stature. In: Human skeleton in forensic medicine

(W.M. Krogman, M.Y. İşcan, Eds.), Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, U.S.A., 1986, 302–

351.

4) Trotter M., Gleser G. A re-evaluation of estimation of stature based on measurements of stature

taken during life and of long bones after death. Am. J. Phys. Anthropol., 1958, 16: 79-123.

5) Wilson R.J., Herrmann N.P., Jantz L.M. Evaluation of stature estimation from the database for


forensic anthropology. J. Forensic Sci., 2010, 55: 684-689.

6) Takakura M., Kuroda T. Morphologic analysis of dentofacial structure in patients with

acromegaly. Int. J. Adult Orthodon. Orthognath. Surg., 1998, 13: 277-288.

7) Dostálová s., Sonka K., Amahel Z., Weiss v., Marek J. Cephalometric assessment of cranial

abnormalities in patients with acromegaly. J. Craniomaxillofac Surg., 2003, 31: 80-87.

8) Kjellberg H, Wikland K.A. A longitudinal study of craniofacial growth in idiopathic short stature

and growth hormone-deficient boys treated with growth hormone. Eur. J. Orthod., 2007, 29: 243-

250.

9) Agnihotri A.K., Kachhwaha S., Googoolye K., Allock A. Estimation of stature from cephalo-

facial dimensions by regression analysis in Indo-Mauritian population. J. Forensic Leg. Med.,

2011, 18: 167-172.

10) Pelin C., Zağyapan R., Yazici C., Kürkçüoğlu A. Body height estimation from head and face

dimensions: a different method. J. Forensic Sci. 2010, 55: 1326-1330.

11) Sahni D., Sanjeev, Sharma P., Harjeet, Kaur G., Aggarwal A. Estimation of stature from facial

measurements in northwest Indians. Leg. Med., 2010, 12: 23-27.

12) Kalia S., Shetty S.K., Patil K., Mahima V.G. Stature estimation using odontometry and skull

anthropometry. Indian J. Dent. Res., 2008, 19: 150:154.

Corresponding author: Gian Luigi Panattoni. Dipartimento di Neuroscienze,

Università di Torino, Corso M. D’Azeglio 52, 10126 – Torino. Tel: 011-6707726 /

333-3825517. E-mail: [email protected]


Variabilità di marcatori uniparentali in popolazioni italiane a

diverso grado di isolamento

Alessio Boattini, Stefania Sarno, Donata Luiselli, Davide Pettener

Dipartimento di Scienze Biologiche, Geologiche e Ambientali, Laboratorio di Antropologia

Molecolare, Università di Bologna,

Lo studio di marcatori uniparentali del cromosoma Y – accoppiato ad una adeguata

strategia di campionamento basata su variabili biodemografiche (ad es. cognomi) –

consente di ricostruire strutture genetiche di popolazioni umane rivelatrici dei

processi storici che hanno condotto alla situazione attuale. Presentiamo alcuni

risultati preliminari di ricerche di antropologia molecolare in corso presso il nostro

laboratorio. Il caso della Partecipanza di S. Giovanni in Persiceto – un peculiare

isolato socio-culturale di origine medioevale legato all'eredità patrilineare della terra

– è di particolare interesse in quanto consente di effettuare inferenze sulla storia del

popolamento dell'area padana e di ricostruire tassi di mutazione per alcuni marcatori

all'interno di genealogie documentate. Uno studio che coinvolge popolazioni non

isolate dell'intero territorio italiano ha invece rivelato la presenza di discontinuità

genetiche (legate alla geografia) la cui origine risale probabilmente al tardo Neolitico

e alle successive Età dei Metalli.


Ancient DNA studies: new perspectives on old samples

David Caramelli

Dipartimento di Biologia Evoluzionistica, Università di Firenze, Firenze, Italy

In spite of past controversies, the field of ancient DNA is now a reliable research

area due to recent methodological improvements. A series of recent large-scale

studies have revealed the true potential of ancient DNA samples to study the

processes of evolution and to test models and assumptions commonly used to

reconstruct patterns of evolution and to analyze population genetics and

palaeoecological changes. Recent advances in DNA technologies, such as next-

generation sequencing make it possible to recover DNA information from

archaeological and paleontological remains allowing us to go back in time and study

the genetic relationships between extinct organisms and their contemporary relatives.

With the next-generation sequencing methodologies, DNA sequences can be

retrieved even from samples (for example human remains) for which the technical

pitfalls of classical methodologies required stringent criteria to guaranty the

reliability of the results. In this paper, we review the methodologies applied to

ancient DNA analysis and the perspectives that next-generation sequencing

applications provide in this field.


Mine, yours, ours? sharing data on human genetic variation

Nicola Milia1,3, Alessandra Congiu1,3, Paolo Anagnostou1,2, Francesco

Montinaro2, Marco Capocasa2, Emanuele Sanna3 and Giovanni Destro Bisol1,2

1 Università di Roma “La Sapienza”, Dipartimento di Biologia Ambientale, Roma Italy

2 Istituto Italiano di Antropologia, Roma, Italy

3 Università di Cagliari, Dipartimento di Biologia Sperimentale, Cagliari, Italy

The achievement of a robust, effective and responsible form of data sharing is currently

regarded as a priority for biological and bio-medical research. However, it has been

argued that its possible advantages in terms of better exploitation of data and optimized

use of resources may be counteracted by the time and economic costs required, by

underlying ethical concerns, and conflicts of interest with patenting discoveries. In this

contrasting scenario, empirical evaluations of data sharing may be regarded as an

indispensable first step in the identification of critical aspects and the development of

strategies aimed at increasing availability of research data for the scientific community

as a whole. Research concerning human genetic variation represents a potential

forerunner in the establishment of widespread sharing of primary datasets. However, no

specific analysis has been conducted to date in order to ascertain whether the sharing of

primary datasets is common-practice in this research field. To this aim, we analyzed a

total of 543 mitochondrial and Y chromosomal datasets reported in 508 papers indexed

in the Pubmed database from 2008 to 2011. A substantial portion of datasets (21.9%)

was found to have been withheld, while neither strong editorial policies nor high impact

factor proved to be effective in increasing the sharing rate beyond the current figure of

80.5%. Disaggregating datasets for research fields, we could observe a substantially

lower sharing in medical than evolutionary and forensic genetics, more evident for

whole mtDNA sequences (15.0% vs 99.6%). The low rate of positive responses to e-

mail requests sent to corresponding authors of withheld datasets (28.6%) suggests that

sharing should be regarded as a prerequisite for final paper acceptance, while making

authors deposit their results in open online databases which provide data quality control

seems to provide the best-practice standard. Finally, we estimated that 29.8% to 32.9%

of total resources are used to generate withheld datasets, implying that an important

portion of research funding does not produce shared knowledge. By making the

scientific community and the public aware of this important aspect, we may help

popularize a more effective culture of data sharing.

| 53

Metodologie

e tecniche

della biologia

sperimentale

54 | M E T O D O L O G I E E T E C N I C H E D E L L A B I O L O G I A S P E R I M E N T A L E

| 55

Synthesis and antimicrobial activity of new 1-R-3-(2-PIRiDYL)- 4-

nitroso- 5-carboxiethyl-1H-pyrazoles.

Stefania Aielloa, Carmelo Massimo Maida

b, Fabio Venturella

b, Diego

Planeta,cMarco Giammanco

d, M.Milici

b

a Dipartimento di Scienze e Tecnologie Molecolari e Biomolecolari, Università degli Studi di Palermo

bDipartimento di Scienze per la Promozione della Salute

G. D’ Alessandro, Università degli Studi di

Palermo cDipartimento dei Sistemi Agro-Abientali,Università degli Studi di Palermo

d Dipartimednto di Studi Giuridici, Economici, Biomedici e Psicosociopedagogici delle Scienze

Motorie e Sportive, Università degli Studi di Palermo

In recent years, epidemiological studies confirm the significant impact on human

health by infections caused by pathogenic fungi. In fact, although the Candida genus

is commensal and a constituent of the normal gut flora, it is responsible for

opportunistic infections and can become pathogenic secondary to predisposing

factors related to the host, like a comprimised immune system (AIDS, anti-cancer

therapy, transplants), excessive prophylaxis with antimicrobial agents, and use of

invasive catheters. Large-scale surveillance for fungal infections has demonstrated an

increasing incidence of drug-resistant fungal pathogens. As a matter of fact, a

significant number of fungi species (especially Candida glabrata and Candida krusei)

exhibited primary resistance to Fluconazole or were less susceptible to Amphotericin

B.

Furthermore, as a consequence of the toxicity of the currently used polyene

antifungal drugs, which leads to interrupt the therapy, and the emergence of Candida

species resistance to azole-based agents, there is an urgent need for developing

alternative drug therapies.

In our previous study we have disclosed the synthesis and antifungal activity of a

series of 4-nitrosopyrazoles that mainly displayed in vitro potent antifungal activity

at no cytotoxic concentrations and that some of these compounds were 4 times more

potent than Amphotericine B and Fluconazole respectively against Cryptococcus

neoformans and Candida Krusei [1-4]

As part of our Structure Activity Relationships studies, we were interested in

learning the influence of the steric and electronic effects of the substituent in position

5 of the 4-nitrosopyrazoles which had already showed powerful antimycotic activity.

Therefore, we synthetized title compounds and evaluated their antimycotic activity

(fig1).

56 | P O S T E R

N

NN

COOC2H5ON

R

R: a=H, b= CH3,

c=C2H5

Fig 1. Synthetized compounds

The 5-carboxiethylester group has made the antimycotic actity dramatically decay, confirming the

necessity, for a good antimicotic activity, of derivatives in which the position 5 is free or substituted

with little groups as a methyl shown the best antifungal activity.

Bibliography

[1] E. Aiello, S. Aiello, F. Mingoia, A. Bacchi, G. Pelizzi, C. Musiu, M. G. Setzu, A. Pani, P. La Colla

and M. E. Marongiu. Synthesis and Antimicrobial activity of New 3-(1-R -3-methyl-4-nitroso-1H-5-

pyrazolyl)-5-methylisoxazole derivatives, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2000, 8, 2719-2728

[2] Stefania Aiello; Enrico Aiello, Marica Orioli, Marina Carini, 3-(1-R-3-methyl-4-nitroso-1H-5-

pyrazolyl)-5-methylisoxazoles: a new class of antifungal compounds. In vitro metabolism by rat

liver:LC and LC-MS studies. Convegno Nazionale, Sorrento 18-22 Settembre 2002.

[3] S. Aiello, E. Aiello and M. Milici: “Synthesis and Antifungal Activity of new 3(5)-methyl-5(3)-(2-

thiophenyl) and -(2-quinolyl)-1H-1-R-4-nitrosopyrazoles.Part V”. Polish-Austrian-German-

Hungarian-Italian Joint Meeting on Medicinal Chemistry, Krakow, October 15-18, 2003

[4] Stefania Aiello, Antonio Macchiarulo, Maria Milici and Enrico Aiello, Sintesi e studi QSAR di

nuovi derivati 3(5)-(2-X)-1R-1H-4-nitrosopirazoli: una classe di composti con potente attività

antifungina in vitro. Parte VI XVII Convegno Nazionale della Divisione di Chimica Farmaceutica

della SCI, Pisa 6-10 settembre 2004.

Corresponding author: Stefania Aiello, Dipartimento di Scienze e Tecnologie

Molecolari e Biomolecolari, Università degli Studi di Palermo, Via Archirafi 32,

90123 Palermo, Italy; tel:+39.091 23896802; email: [email protected]


| 57

Light regulated enzyme activities

Aba Losi1, Wolfgang Gärtner

2*

1, Physics department, University Parma, Italy;

2, Max-Planck-Institute for Chemical Energy

Conversion, Mülheim, Germany

In collaboration with Georg Nagel, Univ. Würzburg, Germany, Peter Hegemann, Humboldt-Univ.

Berlin, Germany

Biological photoreceptors fulfill a double duty in (i) receiving information by

absorption of light and (ii) transmitting information by generating and transducing a

biological signal (which eventually will enable the organism to adjust its lifestyle

according to the environmental conditions). In many cases, both functions are located

in distinct protein domains that are fused to each other through a “connector”

peptide. Genome-wide screens reveal that often one type of sensing domain is

connected to different types of signaling domains and vice versa, i.e., the same type

of signaling domain is fused to different types of sensing functions.(1) The fact that

photoreceptors are instantaneously activated or de-activated in a non-invasive

manner (light activation!), and the demonstration by nature that combinations of

various domains yield functional receptors, has triggered activities to employ

naturally occurring or synthetically formed hybrid photoreceptors in biotechnological

applications.(2,3)

In this presentation, two types of naturally occurring nucleotide cyclases will be

discussed: AMP-cyclases(4) and c-di-GMP cyclases/hydrolases.(5,6) Their function

in the natural environment is well documented, as cAMP is an important second

messenger in many (micro)organisms, and c-di-GMP is identified as a molecule that

can regulate pathogenicity, biofilm formation, or motility.

Literature cited:

(1) Losi, A. and Gärtner, W. (2008) Photochem. Photobiol.. Sci. 7, 1168-1178.

(2) Christie, J.M., et al. (2012) Molecular Plant 5, 533-544.

(3) Olson, E.J. and Tabor J.J. (2012) Curr. Op. Chem. Biol. 16, 300-306.

(4) Stierl, M., et al. (2011) J. Biol. Chem. 286, 1181-1188.

(5) Wu, Y.I., et al. (2009) Nature 461, 104-108.

(6) Cao, Z., Livoti, E., Losi, A., and Gärtner, W. (2010) Photochem. Photobiol 86, 606-611.

58 | P O S T E R

Towards nano-physiology in mammalian cells: a multi-parametric

analysis with scanning ion conductance microscopy

Michele Miragoli1,4

, Stefano Rossi2, Max J. Lab

3, Julia Gorelik

3

1. Centro di Eccellenza per la Ricerca Tossicologica, CERT, INAIL ex-ISPESL, Universita’ degli

studi di Parma

2. Dipartimento di Bioscienze, Universita’ degli studi di Parma

3. NHLI, Myocardial Function, Functional Microscopy Unit, Imperial College London

4. Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milano

Nanotechnologies has opened new avenues for the comprehension of physiological

processes at nano-scale levels. Indeed, atomic force microscopy, scanning probe

microscopy and scanning tunneling microscopy provide details of imaging surface

and physiological processes at the atomic range. Notwithstanding, that those

techniques provide insights into various cellular function, they necessary require

manipulation, contact or destruction of the samples. In the context of the complex

nature of cell disease, in addition to the use of multiple conventional methods that

address individual questions, it would be extremely useful to develop a novel

universal technique capable of correlating cell function with morphology,

macroscopic structural remodeling in intact tissue, and spatial-temporal aspects of

intracellular signalling or ion channel activity measured in single cells and

subcellular compartments. We have modified scanning ion conductance microscopy

invented by Hansma et al . in hopping probe ion conductance microscopy (HPICM)

to image and analyze surface topography of live cells without contact with the

samples. HPICM and a battery of associated innovative methods are unique among

current imaging techniques, not only in spatial resolution, but also in the rich

combination of imaging modalities with other functional and dynamic methods. Here

we describe HPICM technique as a converging technology to perform highly

resolved dynamic and integrative analysis of cell structure, nanophysiology and

mechanisms of cardio and vascular diseases. We have combined HPICM with i)

surface confocal microscopy to study nanoparticles-cell membrane interaction in

lung and cardiac cells[1], with ii) FRET for receptors localization [2] and with

localized intracellular electrode impalement for study myofibroblast membrane

potential in the presence of anti-arrhythmic drugs [3]. Using this technique, we show

that the physicochemical nature of nanoparticles play a pivotal role in modification

of cardiac membrane excitability and ion trafficking (Figure 1) by leading to

arrhythmia in clusters of neonatal rat ventricular myocytes. We also describe how

2-receptors are de-localized from T-tubules to crest in heart failure cells and how in

such pathological conditions it is possible to study the role of myofibroblasts as

target cell for cardiac arrhythmia. In conclusion, HPICM provides a highly

| 59

informative multimodal imaging platform for functional analysis of the mechanisms

of cell diseases, which should facilitate identification of novel therapeutic strategies.

Reference:

M.Miragoli, P.Novak, P. Ruenraroengsak, A.I. Shevchuk, Y.E. Korchev, M.J. Lab, T.Tedley and J.

Gorelik. Functional interaction between charged nanoparticles and cardiac tissue: a new paradigm for

cardiac arrhythmia? Nanomedicine UK, in press.

M.Miragoli, A.Moshkov, P.Novak, A.Shevchuk, V.O. Nikolaev I.El-Hamamsy, C.M.F. Potter, A.R.

Lyon, S.E. Harding. J.A. Mitchell, A.H Chester, M.J. Lab, Y.E. Korchev, J. Gorelik. Scanning Ion

Conductance Microscopy: A Convergent High-resolution Technology for Multiparametric Analysis of

Living Cardiovascular Cells. Journal of Royal Society of Interface. J R Soc Interface. 2011 Jul

6;8(60):913-25. Epub 2011 Feb 16.

Miragoli M, Kadir SH, Sheppard MN, Salvarani N, Virta M, Wells S, Lab MJ, Nikolaev VO,

Moshkov A, Hague WM, Rohr S, Williamson C, Gorelik J. A protective antiarrhythmic role of

ursodeoxycholic acid in an in vitro rat model of the cholestatic fetal heart. Hepatology. 2011

Oct;54(4):1282-92.

Figure1. Topographical height-coded images, obtained by HPICM, of neonatal rat ventricular

myocyte affected by 50 nm carboxyl-modified latex nanoparticles. A. 50 nm nanoparticles induced

life-compatible nanopores in the membrane. B. Zoom in the square area in A (yellow) identifies three

nanopores (a,b,c) with a 50nm profile.

Corresponding author: Michele Miragoli, CERT c/o Dipartimento di Bioscienze,

Address: Viale G.P Usberti 11/A 43124 Parma Tel: 0521905665 Email:

[email protected]

60 | P O S T E R

Biomolecular NMR, a versatile tool for the understanding of protein

science; retinoid-binding proteins as an example

Lorella Franzoni1, Fabio Baroni

1, Davide Cavazzini

2, Gian Luigi Rossi

2, Christian

Lücke3

1Department of Biomedical, Biotechnological and Translational Sciences and

2Department of

Biosciences, University of Parma, Italy; 3Max Planck Research Unit for Enzymology of Protein

Folding, Halle (Saale), Germany. 1Plesso Biotecnologico, via Volturno 39, 43125 Parma; 0521-033823; [email protected]

Protein science stands at the heart of modern life sciences because it unravels

fundamental biological mechanisms and forms the basis for rapid advances in

biomedicine and biotechnology. NMR spectroscopy is uniquely suited to study

various aspects of protein structure, dynamics, molecular interactions and function,

because information for individual residues can be obtained; moreover, kinetic data,

low-populated states and the possible formation of intermediates on the reaction

pathway can be determined.

The case of retinoid-binding proteins is discussed here, as an example. Vitamin A

has diverse biological functions and is

essential for human survival. It circulates

in blood bound to serum retinol binding

protein (RBP) and is transported into

cells by a membrane receptor termed

STRA6 (1). The cellular trafficking and

metabolism of vitamin A are regulated

primarily by specific high-affinity

carriers called CRBP-I and CRBP-II.

They represent an interesting case where

structure determination as well as the

study of fast dynamics (ps-ns time scale)

(2) failed to elucidate the mode of retinol

binding and thus to explain their diverse

tissue distribution, functional roles and

different ligand affinities.

The highly similar structure of the apo and holo forms (a b-barrel with two short

a-helices, see the cartoon) exhibits a closed conformation in both proteins, that

seemingly offer no access for the ligand. Given the biological relevance of retinoids,

the characterization of their protein interactions and targeted release is of special

interest. To tackle this challenging subject we have employed a suite of NMR

techniques: 15

N relaxation dispersion experiments to investigate the proteins


| 61

dynamics in the slower ms-ms timescale, line-shape analysis of 15

N-HSQC spectra

recorded during a retinol titration to get insights into the mechanism of ligand

binding and H/D exchange experiments to investigate conformational stability. The

results allowed to derive a model of retinol uptake, which is different for CRBP-I and

CRBP-II (3, 4); moreover, a distinct local flexibility was found to modulate their

binding properties (5).

The two proteins deliver retinol to microsomal membrane-bound enzymes, either

for esterification with fatty acids (LRAT) (6, 7) or for oxidation to retinaldehyde

(RDH) (8). Our current understanding of these processes remains incomplete, but

there is evidence that the membrane microenvironment plays a role in the

interactions of holo CRBPs with enzymes (8). To address this hypothesis, we have

performed a series of NMR experiments with retinol-bound CRBP-I and CRBP-II in

the presence of model membranes composed of either anionic or zwitterionic

phospholipids, at varying protein:lipid molar ratios and ionic strength.

Both homologues interact with liposomes of anionic phospholipids, but in a

significantly different way (9). A conformational rearrangement of the portal region,

coupled to a change in protein dynamics, are required for retinol exchange; these

processes seem to be triggered by a membrane-collision.

All the differences between CRBP-I and CRBP-II, when dissolved either in buffer

or in the presence of biomembrane mimetic systems, may account for their distinct

functional roles in the modulation of intracellular retinoid metabolism. Further

experiments are in progress to better describe the ongoing processes in a biological

context.

References

(1) Kawaguchi R., Yu J., Honda J., Hu J., Whitelegge J., Ping P., Wiita P., Bok D., Sun H. (2007)

Science, 315, 820-825.

(2) Franzoni L., Lücke C., Pérez C., Cavazzini D., Rademacher M., Ludwig C., Spisni A., Rossi

G.L., Rüterjans H. (2002) J. Biol. Chem., 277, 21983-21997.

(3) Mittag T., Franzoni L., Cavazzini D., Schaffhausen B., Rossi G.L., Günther U.L. (2006) J. Am.

Chem. Soc., 128, 9844-9848.

(4) Franzoni L., Reed M., Cavazzini D., Rossi G.L., Günther U.L., in preparation.

(5) Franzoni L., Cavazzini D., Rossi G.L., Lücke C. (2010) J. Lipid Res., 51, 1332-1343.

(6) Amengual J., Golczak M., Palczewski K., von Lintig J. (2012) J. Biol. Chem., 287, 24216-

24227.

(7) Jiang W., Napoli J.L. (2012) Biochim. Biophys. Acta, 1820, 859-869.

(8) Napoli J.L. (2012) Biochim. Biophys. Acta, 1821, 152-167.

(9) Franzoni L., Baroni F., Cavazzini D., Rossi G.L., Lücke C., in preparation.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17255476&ordinalpos=3&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum

62 | P O S T E R

Application of the multiuse encapsulator agent F-500 for

environmental remediation

Luigi Pane, Elisabetta Giacco, Gian Luigi Mariottini

Department of Earth, Environment and Life Sciences (DISTAV), University of Genova,

In the framework of the “Risk Assessment” procedure for the ecotoxicological

evaluation of compounds used in the aquatic environment, tests with target species

have been carried out. This paper reports the results concerning the evaluation on

cladocerans Daphnia magna of the acute toxicity of F-500 micelle encapsulator

(Hazard Control Inc., USA), a mixture of ionic and non-ionic surfactants based on

fatty acid esters with aliphatic polyalcohols in watery solution used as fire fighter

agent as well as dispersant against hydrocarbon pollution, with the purpose to verify

its compatibility for the aquatic environment and its potential usefulness for the

remediation of soils polluted with hydrocarbons. F-500 has been indicated to be able

to reduce hydrocarbon concentrations within the soil environment and therefore to be

active for soil remediation [1]. As a matter of fact, F-500 has high affinity for soil

particles and was demonstrated that 0.1% F.500 solutions are adsorbed almost

completely (>99%) in soils; furthermore, after elution of soil with water less than 1%

of F-500 was found into the eluate [2]. For ecotoxicological tests the artificial soil

was prepared according to standardized procedures [3]. Soil constituents were

previously dried and subsequently dampened with deionized water in order to obtain

40-60% of the maximum water retention. The artificial soil was treated with

commercial diesel and with F-500 at the concentration (1.5%) known to be non-toxic

for the organisms [4], packed up in 5 cm diameter glass columns and subsequently

eluted with deionized water to obtain the eluate, according to the EPA method [5].

The elutriate was obtained placing soil aliquots and deionized water (1:4) in glass

beakers and stirring them for 1 hour [5, 6]. For both eluate and elutriate testings the

following four samples were prepared and subsequently tested: 1) control (only soil),

2) soil + diesel, 3) soil + 1.5% F-500, 4) soil + diesel + 1.5% F-500. Two different

tests were carried out with the eluate using two different amounts of both compounds

(Test A: Diesel 10 ml, F-500 5 ml. Test B: Diesel 20 ml, F-500 10 ml), thus

maintaining unchanged the Diesel/F-500 rate (2:1). Four different tests were carried

out with the elutriate maintaining unchanged the diesel amount and varying the

diesel:F-500 rate, namely 2:1 (A), 1:1 (B), 1:2 (C), 1:4(D). Daphnia magna

specimens have been obtained from Daphtoxokit ephippia (Microtox, Milano, Italy;

batch DM281009) and maintained at 25 2°C in aerated and properly screened

mineral water supplemented with 0.45 m-filtered 1:100 CaCl2 solution and 0.45

m-filtered 1:100 NaHCO3 solution. Before the test 30 Daphnia magna females were

| 63

isolated and maintained starved for 24 hours; the offspring born during this period

were used in the test and exposed for 24 hours at 20±2°C, 16:8 light:dark period, to

the eluates and to the elutriates in multiwell plates with polyethilene inserts provided

with 74 mm porosity basal membrane (NetwellTM

Corning, NY, USA). Five

organisms per test in quadruplicate against control test were utilized. The tested F-

500 concentrations were chosen considering the results of preliminary assays. The

acute toxicity was evaluated estimating as end-point the percent immobilization of

treated newborn specimens after 10 sec. according to OECD [7].

The results of tests are shown in table 1 (a, b). The data confirm that F-500 is not

toxic to daphnids and show clearly that mixing F-500 to a soil pollutant (commercial

diesel) the acute toxicity induced by eluates and elutriates on cladocerans decreases

remarkably. This allows to confirm the ecocompatibility of F-500 and its suitability

for soil remediation.

F-500 is an easy-to-use compound useful for the remediation of soils and effective

mainly under aerobic conditions; it is able to improve the biological degradation of

contaminants by natural microbial populations as well as to stimulate the

biodegradation reducing the toxicity of the environmental pollutants or making them

innocuous. F F-500 allows to restore the usage of the treated areas accelerating the

self-regeneration of contaminated soils and restoring rapidly the ecological

equilibrium (http://www.fctservices.co.uk/F-500-land-application/).

a

Test Control F-500 1.5% Diesel Diesel + F-500

1.5%

A 6.0 8.9 0 31.8 24.4 12.7 20.0

B 0 5.0 0 46.7 17.5 16.7 12.5

b

A 0 0 70.0 14.1 70.0 14.1

B 0 0 30.0 14.1 40.0 28.2

C 2.0 4.5 0 70.0 7.0 31.8 23.5

D 2.0 4.5 0 70.0 7.0 16.0 14.0

Table 1. Percent immobilization of Daphnia magna exposed to different amounts of

contaminated soil eluate (a) and elutriate (b).

Furthermore, the overall ecocompatibility [4, 9] and the low toxicity against marine

crustaceans and fish [4, 10, 11] of F-500, evaluated through standardized parameters

http://www.fctservices.co.uk/F-500-land-application/

64 | P O S T E R

[8], are known. The tests carried out in this study have shown an evident decrease of

the toxicity in soils treated with diesel + F-500 in comparison to those treated with

only diesel. This result is supposed to be due to the power of the compound to

encapsulate the hydrocarbon molecules maintaining them in watery solution and

consequently making them more accessible for the remediation process and

decreasing both their toxicity and bio-availability. Like this, the hydrocarbons could

be made less available to the organisms thus resulting less toxic. Therefore, the

results show a potential protective effect of F-500 against the damage exerted by

pollution on aquatic organisms and, as recently reported [1], the suitability of this

compound to counteract the hydrocarbon contamination of soil.

References

[1] Alberta Environment and Patch H2S Services Limited 2010. F-500: Canadian Testing. Case

Study Testing. Details of tests completed in Canada utilising F-500 in various contaminated land

scenarios. http://www.fctservices.co.uk/docs/Alberta-and-Patch-tests.pdf

[2] National Industrial Chemicals Notification and Assessment Scheme (NICNAS) 2004. Full public

report. Chemical in F-500. Australian Government Publishing Service, Canberra. File No:

EX/42(NA/976): 23 pp.

http://www.nicnas.gov.au/publications/car/new/ex/exfullr/ex0000fr/ex42fr.pdf

[3] OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) 1984. Guidelines for testing

of chemicals No. 207. Earthworm, acute toxicity test. OECD, Paris.

[4] Giacco E., Mariottini G.L., Pane L. 2008. Valutazione ecotossicologica del prodotto estinguente

F-500 su organismi d’acqua dolce appartenenti a diversi livelli trofici. XVIII Congresso della

Società Italiana di Ecologia, “Ecologia, emergenza, pianificazione”. Riassunti (a cura di G.

Benassi, G. Giordani, P. Viaroli), Parma 1-3 settembre 2008. P.10.5 144-145.

[5] EPA 2001. Methods for collection, storage and manipulation of sediments for chemical and

toxicological analyses: Technical Manual. EPA-823-B-01-002 Oct. 2001. Chapter 5, Pp. 14-15.

[6] APAT 2002. Guida tecnica su metodi di analisi per il suolo e i siti contaminati. Utilizzo di

indicatori ecotossicologici e biologici. P. Nappi, C. Jacomini (APAT)RTI CTN_SSC 2/2002.

[7] OECD (2004). Guideline for testing of chemicals. "Daphnia sp., acute immobilisation test and

reproduction test". Guideline 202.

[8] GESAMP 2002. The revised GESAMP hazard evaluation procedure, Report and Studies n. 64.

[9] Clemson Final Report: Tiwet-Project – 09440 1997. A study of the physical properties, biological

effects and possible usages of F-500 in environmental protection and restoration. The Institute of

Wildlife and Environmental Toxicology Clemson University Pendleton, SC 29670 George P.

Cobb, Section Leader Analytical Toxicology.

[10] EPA 2002. Oil Program Center. Technical Product Bulletin sw-30.

[11] ARPA Ferrara 2005. Rapporto di prova 002971/05/FE.

Corresponding author: Luigi Pane - Department of Earth, Environment and Life

Sciences (DISTAV), University of Genova, Viale Benedetto XV 5, 16132 Genova,

Italy. Tel. +390103538071; email: [email protected]

http://www.fctservices.co.uk/docs/Alberta-and-Patch-tests.pdf

http://www.nicnas.gov.au/publications/car/new/ex/exfullr/ex0000fr/ex42fr.pdf

| 65

A photochromic bacterial photoreceptor as a novel tool for super-

resolution microscopy

Carmen Mandalari1,*

, Aba Losi1, Wolfgang Gärtner

2, Sarah Raffelberg

2, Francesca

Cella Zanacchi3, Paolo Bianchini

3, Alberto Diaspro

3, Stefania Abbruzzetti

1,4,

Cristiano Viappiani1,4

1Dipartimento di Fisica, Università di Parma

2Max-Planck-Institute for Bioinorganic Chemistry, Mülheim a.d. Ruhr, Germany,

3Istituto Italiano di Tecnologia, Genova,

4NEST, Istituto Nanoscienze-CNR

We introduce a novel fluorescent reporter for super-resolution microscopy, based on

the bacterial photoreceptor YtvA [1]. YtvA (from Bacillus subtilis) comprises a

photosensitive flavin based LOV domain, efficiently photo-switchable between

fluorescent and non fluorescent states [2]. The remarkable thermal and

photochemical stability of YtvA and its excellently suited properties for imaging

make flavin-binding LOV domains a powerful new class of autofluorescent proteins,

which adds to the already available GFPs toolbox. We demonstrate FPALM studies

of live Escherichia coli cells, expressing YtvA molecules (Figura 1).

Figura 1: A comparison between the conventional wide-field fluorescence image (Fig. 1a,b) and the

FPALM image (Fig. 1c) shows the remarkable resolution improvement and clearly demonstrates the

suitability of YtvA for super-resolution applications in cells.

66 | P O S T E R

References:

1. A. Losi, A. and W. Gärtner, Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy

applications: flavins in LOV and BLUF photoreceptors. Photochem. Photobiol., 2011, 87, 491 510.

2. The LOV2 domain of phototropin: a reversible photochromic switch. J.T.M. Kennis, I.H.M. van

Stokkum, S. Crosson, M. Gauden, K. Moffat, and R. van Grondelle, J. Am. Chem. Soc., 2004, 126,

4512 4513.

*Corresponding author: University of Parma (www.unipr.it), Department of Physics

and Earth Sciences, viale G.P. Usberti 7/A, 43100-Parma (I) Tel: +39-0521905256

e-mail: [email protected]


| 67

Study of the interaction of myelin basic protein with membranes by

means of molecular dynamics simulations

Eugenia Polverini1*

Mauro De Donatis1 and George Harauz

2

1. Department of Physics and Earth Science - University of Parma, Parma, Italy.

2. Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1,

Canada.

Myelin basic protein (MBP) is a highly basic multifunctional protein of the central

nervous system, whose principal role is to maintain the compactness and integrity of

the myelin sheath, acting as a “biological glue”. Because of its involvement in human

demyelinating diseases, the investigation of the interaction of MBP with membrane

is particularly relevant. The three-dimensional structure of MBP is still unknown,

due to its intrinsic flexibility and dependence of conformation on environment and

on its multiple biological roles. However, three regions of the protein can potentially

be amphipathic alpha-helices [1] and, therefore, are good candidates as interaction

sites with membranes. In this study, we investigate the first, N-terminal region,

ranging from residue R29 to G48 (murine sequence numbering), which also contains

a double Phe-Phe site that can strongly contribute to anchor this segment to the

membrane. Molecular dynamics (MD) simulations were performed on this peptide in

the presence of both neutral (DMPC) and mixed neutral-negatively charged (DMPC-

DMPS) lipid bilayer, to explore the effects of the electrostatic driving force. The

results show a tilt and a deep penetration of the amphipathic helix into the DMPC

membrane, anchored by its hydrophobic surface. In the mixed DMPC-DMPS bilayer,

instead, the peptide remains more at the membrane surface, due to the stronger

electrostatic interaction of MBP charged residues with the charges of the lipidic

headgroups. In both cases, the helix conformation is very stable and strongly anchors

the peptide to the membrane.

Several post-translational modifications (PTMs) are known to be present all along

the whole protein, acting as a “molecular barcode” that modulates the interaction of

MBP with membrane or with signaling proteins. Among these, the more studied are

the arginine deimination and the serine/threonine phosphorylation, also present in

R29-G48 peptide. In particular, deimination seems to limits MBP’s ability to

maintain compact myelin and correlates strongly with disease severity. In this

context, the effect of R31 deimination on the conformation and membrane

interaction of R29-G48 fragment was investigated by MD, both in the neutral and in

the mixed bilayer system. While in neutral lipids the arginine modification does not

influence the depth and the tilt of the helix in respect of the unmodified peptide, in

the DMPC-DMPS mixed bilayer it causes the exposition to the solvent of the region

around the deimination itself and, at the same time, the tilt of the N-terminal side of

68 | P O S T E R

the helix, that consequently becomes less deeply inserted.

The exposition by deimination was already experimentally observed for the second

-helix region (V83-T92), that is the primary immunodominant

epitope, and this effect was supposed to trigger the initiation of autoimmune response

in MS patients [2]. Our results are in agreement with this behavior and not only

support the hypothesis of R29-G48 as a membrane interaction site in MBP, but also

underline the importance of simulating the negative charges present at the membrane

surface to take into account the effect of the electrostatic driving force. This is

particularly relevant for studying the post-translational modifications that, like the

deimination, change the net charge of the molecule.

References

[1] G. Harauz, V. Ladizhansky, J.M. Boggs, Structural polymorphism and multifunctionality of

Myelin Basic Protein, Biochemistry, 2009, 48: 8094-8104.

[2] A.A. Musse, J.M. Boggs, G. Harauz, Deimination of membrane-bound myelin basic protein in

multiple sclerosis exposes an immunodominant epitope, PNAS, 2006, 103: 4422-4427.

* Corresponding author: Eugenia Polverini, Dipartimento di Fisica e Scienze della

Terra, Parco Area delle scienze 7/A, 43124 Parma, Italia. Phone: +39 0521 905254.

E-mail: [email protected]

| 69

Modulation of the photocycle of a flavin-based photoreceptor by

site-directed mutagenesis

Aba Losi1,*

, Sarah Raffelberg2, Carmen Mandalari

1, Wolfgang Gärtner

2, Cristiano

Viappiani1, Stefania Abbruzzetti

1

1: Dept. of Physics and Earth Sciences, Univ. of Parma (Italy), www.unipr.it

2: Max Planck Institute for Chemical Energy Conversion, Mülheim (Germany)

The non-covalently bound flavin chromophore in blue light-sensing LOV domain

proteins is stabilized through an extended hydrogen-bonding network. Preferential

interactions take place between the C(2)=O, N(3)H, C(4)=O, and N(5) groups and a

conserved bunch of glutamine and asparagine residues (1). Less conserved

aminoacids establish interactions with the apolar part of the isoalloxazine ring. This

extended network of weak interactions renders the chromophore cavity extremely

rigid and may affect both spectral properties and dynamics of the photocycle that

involve the reversible formation of a covalent FMN-cysteine adduct. In this work we

studied the influence of the network of weak interactions on the efficiency, kinetics,

and energetics of a LOV protein photocycle, specifically the protein YtvA from

Bacillus subtilis. By means of site-directed mutagenesis, aimed to change the

interactions at the polar and/or apolar sides of the flavin chromophore, and an array

of biophysical techniques, we show that it is possible to modulate the fluorescence

and photocycle quantum yields, the spectral properties in the UVA region, the

dynamics of excited states and the thermal relaxation to the dark-adapted state. All

mutated proteins investigated exhibit blue-light driven formation of the FMN-cys

adduct, but can be driven into a dark/adduct photoequilibrium by illumination with

UVA/violet light. The results reported here have implications for understanding the

mechanisms underlying thermal recovery and for advanced biophysical applications

such as super-resolution fluorescence microscopy (nanoscopy, Losi et al., 2012).

References

1. S. Raffelberg, M. Mansurova, W. Gärtner and A. Losi, Modulation of the photocycle of a LOV

domain photoreceptor by the hydrogen bonding network, J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 5346-5356.

2. A. Losi, W. Gärtner, S. Raffelberg, F. Cella Zanacchi, P.Bianchini, A. Diaspro, C. Mandalari, S.

Abbruzzetti and C. Viappiani, A photochromic bacterial photoreceptor with potential for super-

resolution microscopy, Photochem. Photobiol. Sci, 2012, DOI: 10.1039/c2pp25254f

*Corresponding author: University of Parma (www.unipr.it), Department of Physics

and Earth Sciences, viale G.P. Usberti 7/A, 43100-Parma (I)

Tel: +39-0521905293 e-mail: [email protected]

http://www.unipr.it/


70 | P O S T E R

Nuove metodologie per antichi rimedi: il caso del fungo di malta

Antonella Rosaa, Antonio Rescigno

a, Alessandra Piras

b, Angela Atzeri

a, Paola

Scanob, Silvia Porcedda

b, Paolo Zucca

a, M. Assunta Dessì

a

aDip. Scienze Biomediche,

bDip. Scienze Chimiche e Geologiche, Università degli Studi di Cagliari,

Cittadella Universitaria, SS 554, Km 4.5, 09042 Monserrato, Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39

70 675 4124; e-mail: [email protected].

I grassi e gli oli hanno un ruolo importante nell'industria alimentare e farmaceutica.

Vi è un crescente interesse per le caratteristiche dei lipidi di oli vegetali non

convenzionali come fonte di componenti bioattivi e nutrienti funzionali1.

Il Cynomorium coccineum L. è una pianta non-fotosintetica, perenne e parassita,

della famiglia delle Cynomoriaceae, presente in diversi paesi del Bacino del

mediterraneo (Spagna,

Corsica, Sardegna,

Sicilia, Malta e Creta),

nella costa africana

occidentale e Penisola

Araba2-4

. È conosciuta

con nomi diversi, tra i

più comuni Fungo

melitensis,

Champignon o Éponge

de Malt, Fungo di

Malta e Tarthuth nei

paesi arabi2-4

. Le

proprietà terapeutiche

del Fungo di Malta

sono state tenute in

grande considerazione

nel corso dei secoli. È

stato ampiamente utilizzato in molte culture come rimedio medicinale per la cura di

ulcere, emorragie, dissenteria, impotenza, disordini mestruali e infezioni2-4

. Studi in

vitro e in modelli animali hanno evidenziato proprietà antiemorroidali, antiossidanti,

afrodisiache, toniche, antivomitive, ipotensive e di stimolazione della

spermatogenesi, degli estratti ottenuti da questa pianta2-5

. In letteratura si trovano

esempi sull'uso del C. coccineum come cibo durante i periodi di carestia.

0

20

40

60

80

100

120

ctrl 50 100 250 500 750 1000

% V

iita

lità

Olio fisso ( g/mL)

af a

adgl

adglo adglo

AB

Figura 1. Immagine digitale del Cynomorium coccineum (fungo di Malta)

raccolto in un’area costiera del sud-est della Sardegna, Italia (A). Vitalità

(% del controllo) misurata nelle cellule Caco-2 tumorali dopo 24 ore di

incubazione in presenza dell’olio fisso di C. coccineum (test MTT) (B). a =

P < 0.001, c = P < 0.05 versus ctrl; d = P < 0.001, f = P < 0.05 vs cellule

incubate con 50 g/mL; g = P < 0.001 vs 100 g/mL; l = P < 0.001, vs 250

g/mL; o = P < 0.001, vs 500 g/mL; (n = 16).


| 71

Lo scopo di questo lavoro è stato quello di evidenziare eventuali proprietà funzionali

e potenziali effetti benefici sulla salute umana correlabili al consumo dell’olio

ottenuto dal fungo di

Malta. A tal fine,

attraverso l’azione

congiunta di diversi

gruppi di ricerca, sono

state studiate la

composizione chimica e

l'attività biologica

dell’olio fisso isolato dal

Fungo di Malta (Figura

1A) raccolto in

Sardegna6. L'olio è stato

ottenuto mediante

estrazione con anidride

carbonica in fase

supercritica (CO2-SFE)6.

La CO2-SFE è una

tecnica di estrazione

rispettosa dell'ambiente,

utilizzata industrialmente

per l’ottenimento di oli

essenziali/fissi da spezie/piante, in alternativa ai metodi classici. L’analisi quali-

quantitativa delle principali classi lipidiche è stata effettuata mediante risonanza

magnetica nucleare (13

C NMR)6. Le analisi in GC e HPLC hanno fornito dettagliate

informazioni sui singoli acidi grassi e sullo stato ossidativo dell'olio estratto6. Sono

stati quindi valutati gli effetti modulatori dell’olio sulla vitalità cellulare, sul profilo

dei componenti lipidici (acidi grassi e colesterolo) in cellule Caco-2 differenziate,

come modello di cellule epiteliali intestinali normali, e in cellule coloniche tumorali

(Caco-2 non differenziate)6.

L’estrazione mediante CO2-SFE (250 bar, 40 °C) ha portato all’ottenimento di un

olio giallo (resa 7%). Tra i principali componenti sono stati identificati triacilgliceroli

(42.4%), 1,3 diacilgliceroli (13.1%), 1,2 diacilgliceroli (4.3%), monoacilgliceroli

(3.8%) e acidi grassi liberi (36.3%). L’olio ha mostrato un composizione particolare,

con elevati livelli di 18:1 n-9 (38%, 303 mg/g) e degli acidi grassi essenziali 18:2 n-6

(20%, 159 mg/g) e 18:3 n-3 (11%, 93 mg/g). Diversi oli fissi hanno mostrato, in

colture cellulari e modelli animali, interessanti proprietà antitumorali7. L’olio del C.

coccineum ha indotto in cellule Caco-2 coloniche tumorali una significativa

riduzione della vitalità da 100 g/mL (Figura 1B), e del 90% a 500 g/mL, mentre

non ha indotto alcuna riduzione della vitalità in monostrati di cellule intestinali Caco-

0

25

50

75

100

125

Ctrl 50 100 150 250 350 500 600 750 1000

Vit

ali

tà (

%

con

tro

llo

)

Olio fisso ( g/mL)

0

10

20

30

40

50

0

25

50

75

100

125

150

175

200

Ctrl 50 100

18

:2 e

18

:3 (

g/p

iast

ra)

16

:1 e

18

:1 (

% c

on

tro

llo

)

Olio fisso ( g/mL)

16:1

18:1

18:2 n-6

18:3 n-3 c

c

ad

a

ad

a

B

A

Figura 2. Vitalità (% del controllo, test Alamarblue) (A) e valori degli acidi

grassi 16:1, 18:1 (% controllo), 18:2 e 18:3 ( g/piastra) (B) misurati nelle

cellule Caco-2 differenziate di controllo e dopo 24 ore di incubazione in

presenza dell’olio fisso di C. coccineum (B). a = P < 0.001, c = P < 0.05

versus Ctrl; d = P < 0.001, vs 50 g/mL; (n = 16).

72 | P O S T E R

2 differenziate (Figura 2A). Le cellule epiteliali intestinali sono state quindi incubate

con l’olio per una valutazione dell’effetto modulatorio sui componenti lipidici e della

biodisponibilità. Dopo 24 ore di incubazione è stato osservato nelle cellule trattate un

significativo cambiamento nel profilo degli acidi grassi, con un marcato incremento

degli acidi grassi essenziali 18:2 n-6 e 18:3 n-3 (rispettivamente 4 e 14 volte

superiori rispetto alle cellule di controllo) e, in minor misura, di 18:1 n-9 (Figura

2B). L’olio ha inoltre indotto un selettivo aumento anche nei livelli di 20:3, 22:5 n-3

e, in misura minore di 20:5 n-3. Non è stato osservato un accumulo di colesterolo

rispetto alle cellule di controllo, mentre è stato misurato un lieve incremento del

livello di idroperossidi, correlato allo stato ossidativo dell’olio. Un simile effetto sul

profilo lipidico è stato osservato nelle cellule Caco-2 tumorali. La composizione

degli acidi grassi è molto importante in relazione alle caratteristiche nutrizionali e

funzionali di un olio. L’olio del Fungo di Malta è risultato una fonte naturale,

biodisponibile, di acidi grassi essenziali; ha mostrato la capacità di influenzare la

vitalità in cellule tumorali intestinali, senza alcuna tossicità nelle cellule normali. Si

qualifica quindi come una risorsa per applicazioni farmaceutiche e alimentari,

potenzialmente in grado di esercitare effetti positivi sul mantenimento della salute e

di agire nella prevenzione/trattamento di condizioni patologiche.

Bibliografia

1) Al Ashaal, H.A., Farghaly, A.A., Abd El Aziz, M.M., Ali, M.A., 2010. Phytochemical

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5) Abdel-Magied, E.M., Abdel-Rahman, H.A., Harraz, F.M., 2001. The effect of aqueous extracts of

Cynomorium coccineum and Withania somnifera on testicular development in immature Wistar

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Chemical composition and effect on intestinal Caco-2 cell viability and lipid profile of fixed oil

from Cynomorium coccineum L. Food Chem. Toxicol. 50, 3799–3807.

Corresponding author: Antonella Rosa - Dip. Scienze Biomediche, Università degli

Studi di Cagliari, Cittadella Universitaria, SS 554, Km 4.5, 09042 Monserrato,

Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39 70 675 4124; e-mail: [email protected]


| 73

POSTER

74 | P O S T E R

P O S T E R | 75

Qualitative comparision of olive oil mediterranean

Diego Planeta a, Stefania Aiello

b, Marco Giammanco

c, Walter Randazzo

d, Valerio

Mineo a

a Dipartimento Sistemi Agro-Ambientali, Università degli Studi di Palermo

b Dipartimento di Scienze e Tecnologie Molecolari e Biomolecolari, Università degli Studi di Palermo

c Dipartimento di Studi Giuridici, Economici, Biomedici e Psicosociopedagogici delle Scienze

Motorie e Sportive, Università degli Studi di Palermo d Dipartimento DEMETRA, Università degli Studi di Palermo

The interest in the last few decades for olive cultivation is expanding is because they

have been achieved levels of mechanization that make olive growing economically

competitive with other tree crops, and because the recognition of the nutritional and

health qualities of olive oil resulted in an increase and a geographic expansion of

demand.

The revaluation of olive oil which fat essential for a balanced diet is due to the

particular lipid fatty acid composition which, in addition to being rich in

monounsaturated fatty acids, has a budget balanced essential polyunsaturated fatty

acids, with positive effects on adjustment of the level of cholesterol in blood, on the

mechanisms of cell permeability and the formation of free radicals.[1,2]

Among the minor constituents of virgin olive oils carotenes, tocopherols and

phenolic substances are hydrophilic compounds Healthy mostly related to the quality

of virgin olive oil due to its antioxidant properties.[3]

The overall quality of an oil is determined by genetic factors (cultivar), soil

(chemical-physical characteristics of the soil), climatic and cultural practices. From

the interaction of these factors depend on the chemical characteristics of an oil.[4]

The main purpose of this work was to compare quality parameters of chemical

samples monovarietal oils extracted from cultivar Sicilian and Spanish. The Sicilian

cultivars are divided into three categories: major, minor and neglected, while the oil

samples were produced by Spanish cultivar originating in Andalusia, southern Spain.

The analyzes were carried out in 2010 on 24 samples of olive oil olive oil products in

the year 2008/2009, of which 19 produced by native Sicilian cultivars and 5 from

Spanish cultivars.

The samples were analyzed according to the Regulation EC 1989/03 and the

following parameters were determined; free acidity, number of peroxides,

spectrophotometric indices at 232 nm and 270 nm, fatty acid composition, by

analysis by gas chromatography of methyl esters, phenolic substances, by UV

76 | P O S T E R

spectrophotometric analysis.

Revealed a high biological variability and agronomic feature of Sicilian varietal

platform, unlike other distribution areas such as the Spanish olive sector.

This genetic polymorphism is primarily responsible for the variability that affects all

aspects of olive production, including chemical and physical indices adopted for the

qualitative assessment. The survey conducted on monovarietal oils of cultivars

germplasm native Sicilian and Spanish, it was found that all the oils meet the

European standards of the law, but at the same time there was a different overall

quality that contrasts the Sicilian oils to those Iberians.

The oils are collectively discreetly equipped with polyphenols, except that in the case

of Manzanilla resulting deficient. The analysis of fatty acid composition showed an

imbalance in cultivars Spanish tied to values meager of oleic acid, linoleic acid at

high values and, consequently, to relations of oleic / linoleic quite low, less than 6.

Chemical-physical precious have been found in the oils of the cultivar Biancolilla

Nerba, Crastu, Iacona, Pizzutella, Vaddarica and to a greater extent Montonica.

Bibliography

[1] L. Franzetti, M. Scarpellini, M, A. Vecchio, D. Planeta. Microbiological and safety evaluation of

green table olives marketed in Italy. Annals Of Microbiology, Vol. 61, Issue: 4, Pages: 843-851

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bioanalytical chemistry, Vol. 400, Issue: 5, Pages: 1443-1450

[3] V. Mineo, D. Planeta, C. Finoli, S. Giuliano.

Fatty acids, Sterols and Antioxidant compounds of minor and neglected cultivar of Sicilian virgin

olive oils.Progress in nutrition, Vol. 9 Issue: 4 Pages: 259-263

[4]G. Aiello, P. Catania, M. Enea, G. La Scalia, F. Pipitone, M. Vallone.

Real time continuous oxygen concentration monitoring system during malaxation for the production

of Virgin Olive Oil. Grasas y Aceites, Vol. 63 Issue 4, Pages 475-483.

Corresponding author: Diego Planeta, Dipartimento Sistemi Agro-Ambientali,

Università degli Studi di Palermo, Viale Scienze 11, 90128 Palermo, Italy;

tel:+39.091 23897080; email: [email protected]


P O S T E R | 77

Relationship between maximal fat oxidation and oxygen uptake:

comparison between patients with type 2 diabetes and healthy

sedentary subjects

Angelo Cataldo, Giuseppe Russo, Dario Cerasola, Danila Di Majo, Stefania Aiello,

Marco Giammanco, Marcello Traina

Department of Sports Science (DISMOT), University of Palermo, Italy

Purpose

Carbohydrate and fatty acids are the dominant fuels oxidized for energy production

during exercise. Their contribution is influenced by intensity of exercise1, with a

progressive increase in the relative contribution of carbohydrate oxidation to energy

expenditure, whereas the absolute rate of fat oxidation increases from low to

moderate intensities of exercise and declines as exercise becomes more intense2. In

patients with type 2 diabetes (T2D) the altered metabolism and the lower capacity to

sustain efforts3 changed the choice and regulation of energy substrates for oxidation

4.

Purpose of our study was to assess the relationship between the highest value of fat

oxidation rate (FATmax) and the oxygen uptake (VO2) in sedentary T2D patients and

to compare with healthy sedentary subjects.

Methods

Fifteen sedentary T2D patients (nine males, six females), mean age 58 (range 39 –

65) and fifteen healthy sedentary subjects (eight males, seven females), mean age 53

(range 37 – 71), were studied. All T2D patients were being treated with diet and

antiglycemic agents. Significant cardiovascular disease was excluded in all subjects

by an instrumental examination. The exercise testing started in the laboratory at

08.00 hours after an overnight fast. All subjects performed a graded exercise test to

exhaustion on treadmill, using modified Bruce protocol. Oxygen uptake (VO2) and

carbon dioxide (VCO2) were recorded and maximum fat oxidation rate (FATmax) was

determined using indirect calorimetry, with the assumption that urinary nitrogen

excretion rate was negligible. Substrate oxidation rates were then plotted as a

function of exercise intensity, expressed as percentage of maximal oxygen uptake

(VO2max). Experimental data are presented as means standard error of the mean,

and for the statistical analysis of the data linear regression analysis was used.

Results

The physical and physiological characteristics of subjetcs are shown in table 1. The

average VO2max for T2D patients and healthy subjects was 22.29 1.06 ml/Kg/min

and 28.63 2.03 ml/Kg/min respectively (P < 0.01). In T2D patients, absolute fat

oxidation rate reached a maximum of 6.71 0.46 mg/Kg/min at VO2 of 15.41 0.68

ml/Kg/min (70 1.27% of VO2max) while in healthy subjects 7.19 0.77

mg/Kg/min at VO2 of 18.23 1.28 ml/Kg/min (64 2.61% of VO2max). When linear

78 | P O S T E R

regression analysis was performed, a positive linear correlation between FATmax and

VO2 (r = 0.85; p = 0.0001) in both groups has been found (Fig. 1). Also, positive

linear correlation between FATmax and VO2max in both T2D (r = 0.76; p = 0.001) and

healthy subjects (r = 0.73; p = 0.002) has been found (Fig. 2).

Conclusions

Our data, comparable with those reported in the literature5, indicate that in T2D

patients fat oxidation rate is not impaired. VO2max, index of exercise capacity, was

significantly lower in T2D patients so that, in T2D compared to healthy subjects, we

found a maximal fat rate oxidation at higher exercise intensity. Moreover, the

positive linear correlation between FATmax and both VO2 and VO2max suggests that

even in T2D patients the muscle oxidative capacity might increase in response to

aerobic training.

Table 1: Physical and physiological characteristics of subjetcs.

T2D patients Healthy subjects

n 15 15Age (y) 58 ± 1.78 53 ± 2.04

Height (cm) 168 ± 2.32 167 ± 2.58Weight (Kg) 81 ± 3.20 75 ± 4.69

BMI 28.7 ± 1.07 26.6 ± 1.3VO2max (ml/Kg/min) 22.29 ± 1.06 28.63 ± 2.03 **

FATmax (ml/Kg/min) 6.71 ± 0.46 7.19 ± 0.77

VO2 at FATmax (ml/Kg/min) 15.41 ± 0.68 18.23 ± 1.28 *

%VO2max at FATmax (%) 70 ± 1.27 64 ± 2.61 *

Data are means ± SE

* P < 0.05 for difference between healthy and T2D subjects

** P < 0.01 for differences between healthy and T2D subjects

.

Fig.1 Correlations between FATmax and VO2 in T2D (A) and Healthy (B) subjects

Fig.2 Correlations between FATmax and VO2max in T2D (A) and Healthy (B) subjects.

9.00

11.00

13.00

15.00

17.00

19.00

21.00

23.00

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00

VO

2 (

ml/

Kg/

min

)

FATmax (mg/Kg/min)

T2D subjects

r = 0.85

A

9.00

14.00

19.00

24.00

29.00

3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00

VO

2 (

ml/

Kg/

min

)

FATmax (mg/Kg/min)

r = 0.85 p = 0.0001

Healthy subjects

B

9.00

14.00

19.00

24.00

29.00

34.00

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00

VO

2m

ax (m

l/K

g/m

in)

FATmax (mg/Kg/min)

T2D subjects

A

r = 0.76 p = 0.001

9.00

19.00

29.00

39.00

49.00

3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00 VO

2m

ax (

ml/

Kg/

min

)

FATmax (mg/Kg/min)

Healthy subjects

r = 0.73 p = 0.002

B

P O S T E R | 79

References

1) Romijn JA, Coyle EF, Sidossis LS, Gastaldelli A, Horowitz JF, Endert E, and Wolfe RR.

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Type II diabetic patients at rest and during exercise. Clinical Sc. 103: 559-566, 2002.

Corresponding Author:

Marco Giammanco, fax+390916236407, Email: [email protected]


80 | P O S T E R

The influence of hypocaloric diet, associated with moderate physical

activity and cbt (cognitive behavioral therapy), on self-esteem and

self-efficacy and their modulator role on emotional eating.

Giulia Giammanco, Danila Di Majo, Marco Giammanco, Maurizio La Guardia

Dipartimento DISMOT, Unità Operativa Didattico Scientifica di Fisiologia e Farmacologia

Università degli Studi di Palermo

There are many evidences that emotional factors have great influence on eating

habits; this phenomenon is defined “emotional eating” and increases the risk of

obesity (1). Few studies demonstrate that patients affected by binge eating disorder

felt negative emotions before binges; the main emotion reported was anxiety, then

sadness and tiredness. The emotional factors can interfere with a diet therapy and

with keeping results at the end of a diet. Emotional eating is related to the stress (2),

so when subjects feel anxiety and depression, is more probable that they use food as

modulator of their emotions, in this way the weight develops fast with all risks of

obesity.

The obesity is often attended by a specific syndrome called metabolic syndrome; the

main symptoms are insulin resistence, hyperinsulinemia, not-insulin-dependent

diabetes mellitus, dyslipidemia, central obesity, hyperuricemia, hypertension; this

clinic condition predisposes to cardiovascular diseases. So the aim of our study is to

observe how two psychological constructs as “self-esteem” and “self-efficacy”, that

are demonstrated to have a protective role against negative emotions as anxiety e

depression (5), can modulate the emotional eating. For this aim, we used CBT

(Cognitive Behavior Therapy). We began to select a sample of obese subjects, and

gave them few questionnaires to evaluate the degree of anxiety and depression

(STAI/BDI), the level of self-esteem (BASIC SE), and if there was a diagnosis of

Binge Eating Disorder (BED) by a Binge Eating Scale (BES). The first results show

a significant relation between anxiety and depression and low level of self-esteem,

and their relation with BED. The one subject of the sample with low self-esteem and

high depression and anxiety, but without BED, uses pharmacological therapy for

anxiety and depression. Is probable that modulator effect of food is displaced by

drugs.

P O S T E R | 81

sesso età BMI BES BDI STAI BASIC SE

F 30 37,2 1 6 27 >80°

F 47 53,7 39 40 77 <1°

F 50 40,1 6 33 67 <5°

M 30 52,8 31 13 59 15°

M 36 37,1 4 1 35 >90°

Bibliography 1) DallmanMF. “Stress-induced obesity and the emotional nervous system.”

Trends EndocrinolMetab. 2010 Mar; 21(3):159-65. Epub 2009 Nov 18.

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performance, interpersonal success, happiness, or healthier lifestyle?” Psychological Science in the

Public Interest, 2003 4, 1-44. 4

Corresponding Author: Giulia Giammanco, email: [email protected]

http://it.wikipedia.org/wiki/1988


82 | P O S T E R

The control of abstinence in the treatment of alcohol dependence:

the use of acamprosate in relapse prevention.

Fabio Venturellaa, Asaro Anna

a, Guido Faillace

b, Gianpaolo Spinnato

c, Danila Di

Majoe; Maurizio La Guardia

e, Marco Giammanco

e, Stefania Aiello

d

a Dipartimento di Scienze per la Promozione della Salute G. D’ Alessandro, Università di Palermo

b Ser.T Alcamo;

c Sevizio di Psichiatria ASL Palermo 2.

d Dipartimento di Scienze e Tecnologie Molecolari e Biomolecolari, Università di Palermo

e. Dipartimento DISMOT, U.O. di Fisiologia e Farmacologia, Università di Palermo

"The alcoholism can also deal with drug treatments."

This is the message that emerges from the press conference of presentation of

Campral, trade name of acamprosate, a neuromodulator specifically indicated in the

maintenance of abstinence in alcohol-dependent patients.Alcoholism is a disease

characterized by: craving, loss of control, tolerance and physical dependence.For

many years the prevention of relapse in use of alcohol after detoxification was

supported almost exclusively by psychosocial procedures and techniques with

modest success. Treatment with acamprosate is a valid tool to complement

psychotherapy as it does not cause addiction, abuse or withdrawal of its suspension

and does not interfere with other medications that patients often alcoholics must

take.To evaluate the effectiveness, our study evaluated the effects of Acamprosate

compared to GHB in clinical-physiological and social health in a way indicators of a

possible therapeutic success in terms of abstinence from alcohol and social

reintegration. The hypothesis of the project is that pharmacotherapy anticraving with

acamprosate integrated with psycho-social support, can reduce relapse in alcohol

together with the reduction of the risk of abuse arising from the use of GHB. This

work purports to be an account of 11 months of observation of patients treated with

acamprosate.

Results: A total of 36 patients were observed, of which 5, 4 men and 1 woman at the

Ser.T Alcamo and 31, 21 men and 10 women at the Ser.T of Palermo. In the fight

against alcoholism, this therapy with acamprosate offers significant potential:

decreases, in fact, the incidence, severity and frequency of relapses (Fig. 1). As

regards the craving, during the period of treatment with acamprosate, there has been

a change, in the sense of reduction, of craving for alcohol: if before therapy was in

68% of cases, medium-high, becomes after 3-4 months after therapy in low-nil in

89% of patients observed.

It has been recorded that, after 3-4 months after receiving acamprosate, the clinical

picture of the patient is greatly improved by referring to biological markers (Fig. 2). Conclusions: The study shows that treatment with acamprosate is an exciting

P O S T E R | 83

55,6%

13% Relapse

relapse with GHB

relapse with acamprosate

opportunity within a project of integrated care for the treatment of alcohol addiction.

The acamprosate may also be used early in the pharmacological treatment of

dependence on alcohol to prevent the appearance of excitability neuronal associated

abstinence.On the other hand, its use must have a duration sufficient to allow

neuronal excitability to normalize in the most enduring possible: the treatment, in

fact, is recommended for one year. In any case, the use can be continued even in the

face of relapses, with the aim to reduce the frequency or severity.In particular, the

strong point seems to be the ability for the user to experience a new sense of

normalcy and to remove the desire for significant periods of alcohol.

Fig.1: Percentage of

relapse during treatment

with acamprosate.

Fig.2: Laboratory findings on biological markers before and after treatment with acamprosate.

Bibliography:

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dysphoria and insomnia. Scottsdale, AZ, Dec 7-11-2008.

2. Mason BJ, Heyser CJ: the neurobiology, clinical efficacy and safety of acamprosate in the

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psychopathology on alcohol dependence treatment outcomes and acamprosate efficacy. Am J

Addict. 19: 147-154, 2010.

95 77

43.3

356.8

91.5

17 21

61

0 40 80

120 160 200 240 280 320 360 400

MCV AST ALT G-GT

Biological markers

BEFORE

AFTER

84 | P O S T E R

5. Ootemen W, Naassila M, Koeter MW, Verheul R, schippers GM, Houchi H, Daoust M, Van Den

Brink W: predicting the effect of naltrexone and acamprosato in alcohol-dependent patients using

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Corresponding author: Dott. Fabio Venturella, Dipartimento di Scienze per la

promozione della salute G. D’ Alessandro,Via Del Vespro 127 Università degli Studi

di Palermo, Tel. 3203354997,

Email: [email protected]

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Petrov%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Krogh%20J%22%5BAuthor%5D

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P O S T E R | 85

Cellular drug delivery system based on vaterite particles

B. Parakhonskiy1, 2

, C. Foss1, E. Carletti

1, A. Haase

1, A. Motta

1, C. Migliaresi

1, and

R. Antolini1

1. BIOtech, University of Trento, via delle Regole 101, 38123 Mattarello, Italy

2. Shubnikov Institute of Crystallography, Russian Academy of Science, Moscow, Russia

The novel technique for the synthesis of vaterite submicron containers were

developed in our work. We present the characterization of these carriers, their

loading and experiments on possible release strategies controlling of the release rates

of encapsulated substances. Biocompatibility analyses were performed, evaluating

the cytotoxicity of vaterite containers and their influence on the cell metabolism.

Finally we present in vitro cellular uptake experiments for different molecular-

weight cargos.

CaCO3 vaterite spherical particles were fabricated with controllable average sizes

from 400nm up to 10 micron. As proof-of-principle experiments, fluorescent markers

(low-molecular-weight Rhodamine 6G and high-molecular-weight TRITC-dextran)

were encapsulated into the vaterite containers, so that payload release dynamics

could be studied by fluorescence microscopy and spectrofluorimetry. An increase of

the release rate of Rhodamine 6G into water and cell growth medium was found with

respect to ethanol coinciding with the recrystallization phase transition from vaterite

to calcite after 3 days. For samples loaded with TRITC-dextran, this phase transition

was inhibited, causing only small amounts of the encapsulated markers being

desorbed during one week.

Human ovarian carcinoma ES2 cells were cultured with a suspension of vaterite

particles in culture medium. Neither cytotoxicity was noticed after 2 days of

incubation, nor cell reproduction was significantly affected proving the

biocompatibility of the vaterite containers. The uptake dynamics was monitored by

confocal laser microscopy after staining live cells with Calcein-AM. High- and low-

molecular-weight payload for cell uptake experiments showed diverse dynamics.

While the first exhibited fast dye release into the cells, the later showed strong

indications of intact containers accumulating within the cell also after 48h. These

contrasting dynamics can be further controlled by covering the microcontainers with

additional layers of biocompatible polyelectrolyte, which will further increase the

payload release time. A change of the pH from neutral to acid conditions instead,

will lead to a destruction of the vaterite matrix followed by a quick release of the

encapsulated materials. These flexible control mechanisms make this system an

interesting candidate for pharmaceutical applications.

86 | P O S T E R

Modelli biologici di stress ossidativo per lo studio delle proprietà

antiossidanti del carciofo

Melis M. Paola, Atzeri Angela, Cabboi Barbara, Deiana Monica, Incani Alessandra,

Loru Debora, Rosa Antonella, Massimiliano Melis, Dessì M. Assunta

Dip. Scienze Biomediche, Università degli Studi di Cagliari, Cittadella Universitaria, SS 554, Km 4.5,

09042 Monserrato, Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39 70 675 4127; e-mail: [email protected].

É oramai ben riconosciuto il ruolo funzionale, in relazione al miglioramento dello

stato di salute e di benessere e/o riduzione del rischio di malattia, di una serie di

alimenti che rientrano nelle normali abitudini alimentari e che mostrano la loro

efficacia nelle quantità normalmente consumate nella dieta.

Il carciofo, alimento da sempre apprezzato nella regione mediterranea, è una verdura

caratterizzata da elevati livelli di polifenoli (≈ 2% del peso fresco), composti in grado

di esercitare un’importante azione di prevenzione nei confronti di differenti

condizioni patologiche. Tradizionalmente è stato utilizzato nella medicina popolare

per le sue proprietà coleretiche-colagoghe, diuretiche, epatoprotettive ed

ipocolesterolemizzanti, proprietà confermate da vari studi sperimentali, che hanno

avvalorato l’azione benefica del carciofo nei confronti di alcuni disturbi epatici e

digestivi1, la capacità di esplicare effetti anti-iperlipidemici

2 sia ostacolando

l’aumento di trigliceridi sia inibendo lo svuotamento gastrico. È stata inoltre

evidenziata un’azione ipoglicemizzante negli animali e nell’uomo oltre ad un effetto

ipocolesterolemico3 dovuto sia ad aumentato flusso biliare (e conseguente aumento

di escrezione di colesterolo), sia all’ostacolo di neo-sintesi di colesterolo (tramite

l’inibizione dell’enzima idrossi-metilglutaril CoA reduttasi). Numerosi studi hanno

mostrato l’importante azione antiossidante esplicata dal carciofo o dai suoi estratti in

diversi modelli sperimentali, in particolare in leucociti umani stimolati con diversi

ossidanti tra cui H2O2, in colture di cellule endoteliali e di monociti4, in colture

primarie di epatociti di ratto trattati con cumene idroperossido o tert-butil

idroperossido5 o durante l’ossidazione di LDL mediata da ioni rameici

4,6. Le

proprietà antiossidanti del carciofo sono state correlate al contenuto di composti

polifenolici presenti, in particolare ai livelli di acido caffeico e dei suoi derivati. Altri

importanti composti fenolici identificati nel carciofo sono i flavonoidi apigenina e

luteolina e i loro glucosidi e rutinosidi.


P O S T E R | 87

Questo studio è volto a valutare l’azione antiossidante del carciofo della cultivar

“Spinoso Sardo”, clone “Spinoso”, con l’obiettivo di fornire una nuova

caratterizzazione delle proprietà di questo pregiato ortaggio, molto importante

nell’economia della Sardegna, per renderlo da squisito alimento apprezzato

soprattutto per la sua bontà, oltre che per le sue proprietà benefiche nei confronti di

vari disturbi epatici-biliari, a nuova potenziale fonte di molecole antiossidanti. A tale

scopo è stato studiato e comparato il potere antiossidante di una serie di estratti

metanolici ottenuti da differenti parti (foglie, capolini e gambi) del carciofo Spinoso

Sardo attraverso l’utilizzo di diversi modelli di stress ossidativo di rilevanza

biologica, quali la degradazione ossidativa dell’acido linoleico a 37 °C e

l’ossidazione del colesterolo a 140 °C. Inoltre è stato valutato l’effetto citotossico nei

confronti delle cellule Caco-2 differenziate, quale modello di cellule intestinali. Tutti

gli estratti di carciofo hanno ostacolato la degradazione dell’acido linoleico ma in

maniera differente: i capolini hanno mostrato un potere protettivo maggiore rispetto

agli estratti dei gambi e delle foglie; infatti, già da 1 g hanno protetto l’acido

linoleico di circa il 50% e permesso un recupero maggiore di acidi grassi

idroperossidi a dieni coniugati (HP). Una protezione totale dell’acido grasso si è

riscontrata con 5 g degli estratti dei capolini e con 50 g degli estratti dei gambi

(Figura 1). Tale capacità antiossidante probabilmente è esplicata dagli estratti di

carciofo attraverso un meccanismo di donazione di atomi idrogeno, confermato dalla

0

50

100

150

200

250

300

0

20

40

60

80

100

120

HP

to

t (%

del

l'o

x)

ac.

lin

ole

ico

(%

del

co

ntr

oll

o 0

°C)

estratti di carciofo

1ug 2.5ug 5ug 10ug 50ug

1ug 2.5ug 5ug 10ug 50ug

Figura 1: Acido linoleico residuo (barre) espresso in % del controllo a 0 C e acidi grassi

idroperossidi totali (HP tot) (linee) espressi in % dell’ossidato (ox), formati dopo

incubazione, a 37 C per 32 ore alla luce, di 1mg di acido linoleico in assenza (ox) o in

presenza di 1-50 g di estratti in metanolo di gambi, foglie e capolini di carciofo, clone

“Spinoso”, cultivar “Spinoso Sardo”. (Valori del controllo: ac. linoleico= 0.95 0.05mg;

HP= 86.66 11.44 g, analisi in HPLC7).

88 | P O S T E R

capacità degli estratti di spostare il rapporto c,t/t,t degli HP formati durante

l’autossidazione dell’acido linoleico a favore degli isomeri c,t7. La protezione verso

il colesterolo è stata più simile tra gli estratti (100% di protezione da 5 g), 1 g

dell’estratto dei capolini ha permesso una protezione paragonabile tra foglie e

capolini, mentre i gambi sono stati meno efficaci.

Sulle cellule Caco-2 differenziate, (modello ampiamente utilizzato per la valutazione

delle proprietà delle cellule intestinali8), gli estratti in metanolo dei capolini del clone

“Spinoso” non hanno mostrato alcuna azione citotossica, valutata con il test Alamar

Blue9, nel range di concentrazione 1-1000 mg/ml, al contrario degli estratti

metanolici delle foglie totalmente tossici già a concentrazione di 25 mg/ml (Figura

2). Dai risultati ottenuti si evince come l’uso di metodiche semplici, poco costose e

di routine siano risultate utili per mettere in luce virtù benefiche di un alimento da

tanti apprezzato per il suo gusto oltre che per le sue proprietà quale “alimento

funzionale”.

Bibliografia

1) Sannia A. (2010). Un’esperienza di fitoterapia con una associazione di fitocomplessi ad attività

epatoprotettrice contenente un estratto di foglie di carciofo per il controllo dei sintomi della

dispepsia funzionale. Minerva Gastroenterol. Dietol., 56: 93-99.

2) Shimoda et al., (2003). Anti-hyperlipidemic sesquiterpenes and new sesquiterpene glycosides

from the leaves of artichoke (Cynara scolymus L.): structure requirement and mode of action.

Bioorg. Med. Chem. Lett., 13: 223-228.

0

20

40

60

80

100

120

1 2,5 5 10 25 50 100 250 500 750 1000

Mo

rta

lità

cel

lula

re (

% d

el c

on

tro

llo

)

concentrazione estratti ( g/ml)

gambi

capolini

foglie

a, d a, #

Figura 2: Mortalità cellulare (% del controllo, 0% di mortalità o 100% di vitalità) di

cellule Caco-2 tenute in coltura per 24 ore con diverse concentrazioni (1-1000 g/ml) di

estratti di carciofo. [a= p<0.001 vs i controlli; d= p<0.001 foglie vs gambi e capolini;

#= p<0.001 gambi e foglie vs capolini]. La citotossicità degli estratti (1-1000 g/ml) è

stata saggiata su cellule CaCo-2 differenziate8, utilizzando il test Alamar Blue9.

P O S T E R | 89

3) Bundy et al., (2008). Artichoke leaf extract (Cynara scolymus) reduces plasma cholesterol in

otherwise healthy hypercholesterolemic adults: A randomized, double blind placebo controlled

trial. Phytomedicine, 15: 668-675.

4) Zapolska-Downar et al., (2002). Protective properties of artichoke (Cynara scolymus) against

oxidative stress induced in cultured endothelial cells and monocytes. Life Sciences, 71: 2897-

2908.

5) Gebhard (1997). Antioxidative and protective properties of extracts from leaves of the artichoke

(Cynara scolymus L.) against hydroperoxide-induced oxidative stress in cultured rat hepatocytes.

Toxicol. App. Pharmacol., 144: 279-286.

6) Jiménez-Escrig et al., (2003). In vitro antioxidant activities of edible artichoke (Cynara scolymus

L.) and effect on biomarkers of antioxidants in rats. J. Agric. Food Chem., 51: 5540-5545

7) Rosa et al., (2002). Antioxidant activity of capsinoids. J. Agric. Food Chem., 50: 7396-7401

8) Deiana et al., (2010). Protective effect of simple phenols from extravirgin olive oil against lipid

peroxidation in intestinal Caco-2 cells. Food Chem. Toxicol., 48: 3008–3016.

9) O'Brien et al., (2000). Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the

assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur. J. Biochem., 267: 5421-5426.

Corresponding author: Melis M.Paola - Dip. Scienze Biomediche, Università degli

Studi di Cagliari, Cittadella Universitaria, SS 554, Km 4.5, 09042 Monserrato,

Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39 70 675 4127; e-mail: [email protected].


90 | P O S T E R

Cardiac regeneration by pharmacologically active microcarriers

releasing growth factors and/or transporting adipose-derived stem

cells

Monia Savi1,7

, Leonardo Bocchi1,4

, Emanuela Fiumana2,4

, Caterina Frati3,

Francesca Bonafé2,4

, Stefano Cavalli3, Paolo Giovanni Morselli

6, Jean-Pierre

Karam2,5

, Claudia Montero-Menei5, Claudio Marcello Caldarera

,2,4, Carlo

Guarnieri2,4

, Claudio Muscari2,4

, Donatella Stilli1,4

, Federico Quaini7,4

, Ezio

Musso1,4

.

Dipartimento di Bioscienze-Università di Parma1, Dipartimento di Biochimica-Università di

Bologna2, Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali-Università di

Parma3, Istituto Nazionale per le Ricerche Cardiovascolari (INRC)

4, INSERM U 646 – Università di

Angers5, Dipartimento d Scienze Chirurgiche Specialistiche ed Anestesiologiche-Università di

Bologna6, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale - Università di Parma

7.

AIMS. In preclinical studies, cell transplantation has definitely emerged as a

potential treatment strategy for heart failure secondary to myocardial infarction (MI)

whereas data from large sample size clinical trials are conflicting (1). To ameliorate

the unsatisfactory outcome of cell therapy in clinical settings attention has been paid

to several factors such as tailoring of cell type, fine tuning of procedural aspects, and

optimization of engraftment techniques with the use of scaffolds. In recent years,

several studies documented the existence in adipose tissue of stem cells (Adipose-

derived Stem Cells: ASCs) which can be safely transplanted to an autologous or

allogeneic host and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes

(2). Further, Hepatocyte Growth Factor and Insulin-Like Growth Factor-1 (GFs)

were shown to repair the infarcted heart and improve its electromechanical

competence by respectively mobilizing resident cardiac stem cells (CSCs) and

promoting their survival and proliferation (3). Finally, pharmacologically active

microcarriers (PAMs) formed by biodegradable and non-cytotoxic poly (lactic-co-

glycolic acid) microspheres which interact with cells/molecules conveyed on their

surface and tissue microenvironment were proposed for enhancing cell engraftment

in the injured myocardium (4). In the present study, we tested the hypothesis that

stem cell based cardiac regeneration through intra-myocardial delivery of ASCs, GF-

mediated local activation of CSCs, or both, can be improved by PAMs.

METHODS. ASCs were isolated by human lipoaspirates. PAMs were coated with

fibronectin and poly-lysine to improve cell adhesion and biological function. GFs

were encapsulated into PAMs during the microsphere formulation. Thirty-eight adult

male Wistar rats with one-month old MI were treated with ASCs (MI_ASC group,

n=8), ASCs+PAMs (MI_ASC+PAM, n=7), GF-releasing PAMs (MI_PAM+GF,

n=6), ASCs+GF-releasing PAMs (MI_PAM+ASC+GF, n=6) or vehicle (MI_V,

n=6). Five additional rats were sham operated (SHAM). Two weeks after treatment,

hemodynamic parameters were invasively determined in Millar conductance catheter

P O S T E R | 91

+dP/dt (mmHg/s)

- 22%-13%

-18%-15%

0

100020003000

400050006000

7000

80009000

-dP/dt (mmHg/s)

-8000

-6000

-4000

-2000

0

- 33%

-23%

-29%-33.6%

studies and inducibility of ventricular arrhythmias was assessed during programmed

stimulation in Langendorff-perfused hearts, by Microelectrode Array (MEA) system.

Eventually, the hearts were subjected to anatomical, morphometric, and

immunohistochemical analyses. ASC tracking was achieved by the detection at tissue

level of both pre-labeled cells with Dil fluorochrome and human specific sex

chromosomes by FISH.

RESULTS. The deterioration of ventricular function in untreated MI rats was

represented by an approximately 22% reduction in the maximal rate of ventricular

pressure rise and decline (±dP/dt; Figure 1 a-b) and a 35% prolongation of

isovolumic contraction and relaxation times. PAM+ASC+GF was the most effective

treatment leading to a substantial improvement of all hemodynamic parameters

whose values approached those measured in SHAM rats (Figure 1 a-b). The recovery

of left ventricular (LV) hemodynamics in MI_PAM+ASC+GF group had a structural

counterpart in a 10% reduction in LV chamber dilation together with a 20% increase

in mass-to-chamber-volume ratio, thus cancelling out the unfavorable LV

remodeling induced by MI (no significant difference vs. SHAM). In the same

animals a considerable amount of cell engraftment within the infarcted hearts was

clearly documented by FISH immunohistochemical studies. Lastly, all treatments

involving the use of PAM had beneficial effects on myocardial perfusion by

significantly increasing the number of arterioles in the regenerated hearts. Again, the

best results were obtained in MI_PAM+ASC+GF group (+75%; p<0.01 vs. MI-V ).

a) b)

* * * * * * * *

Figure 1. Mean values±SE of (a) +dP/dt and (b) –dP/dt, measured in the 6 experimental groups. *

p<0.05, significant differences vs. SHAM

By contrast, the improvement in cardiac mechanical function and structure mediated

by PAM+ASC+GF treatment was not accompanied by a similar positive effect on

electrical function. Indeed, arrhythmias occurring during programmed stimulation

trended to be larger in all treated animals and more so in MI_PAM+ASC+GF group.

SHAM

MI_V

MI_ADSC

MI_ADSC+PAM

MI_PAM+GFs

MI_PAM+ADSC+GFs

SHAM

MI_V

SHAM

MI_V

MI_ADSC

MI_ADSC+PAM

MI_ADSC

MI_ADSC+PAM

MI_PAM+GFs

MI_PAM+ADSC+GFs

MI_PAM+GFs

MI_PAM+ADSC+GFs

92 | P O S T E R

CONCLUSION. PAMs appeared to improve ASC- or GF-based approaches to

regenerate the infarcted heart and ameliorate cardiac function although caution

should be paid on the electrophysiological impact of the physical interaction of

microspheres with the myocardium.

References: 1) Malliaras K, Marbán E. Cardiac cell therapy: where we've been, where we are, and where we

should be headed. Br Med Bull. 2011;98:161-85.

2) Mizuno H, Tobita M, Uysal AC. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for

future regenerative medicine. Stem Cells. 2012;30:804-10.

3) Urbanek K, Rota M, Cascapera S, Bearzi C, Nascimbene A, De Angelis A, Hosoda T, Chimenti

S, Baker M, Limana F, Nurzynska D, Torella D, Rotatori F, Rastaldo R, Musso E, Quaini F, Leri

A, Kajstura J, Anversa P. Cardiac stem cells possess growth factor-receptor systems that after

activation regenerate the infarcted myocardium, improving ventricular function and long-term

survival. Circ Res. 2005;97:663-73.

4) Karam JP, Muscari C, Montero-Menei CN. Combining adult stem cells and polymeric devices for

tissue engineering in infarcted myocardium. Biomaterials. 2012;33:5683-95.

Corresponding author: Donatella Stilli, Dipartimento di Bioscienze, Parco Area

delle Scienze 11A, Università di Parma, 43100 PARMA. Tel.: +390521905624. E-

mail [email protected]


P O S T E R | 93

Micro-Raman mapping of bio-carbonates and polyenic pigments in

corals and shells

L. Bergamonti1, G. Predieri

1, P.P. Lottici

2

1 Chemistry Department, University, Parco Area delle Scienze 17/a, 43124 Parma – Italy

2 Physics and Earth Sciences Department, University, Parco Area delle Scienze 7/a, 43124 Parma –

Italy

Calcifying organisms are widely studied to investigate the complex organic-

inorganic structure of the biogenic carbonates and the environmental factors

influencing their formation (1). The nature of the pigments in marine and terrestrial

biogenic carbonates found in corals, shells or pearls is still debated and, in addition, a

deeper understanding of the intricate biomineralization processes is looked for to

mimic the “natural” growth techniques for specific applications.

Raman microscopy is a powerful technique to investigate both the spatial distribution

of the inorganic phases (calcite, aragonite or vaterite) and to define the nature of the

organic pigments in corals, shells and pearls, especially when resonance conditions

are attained (2-6). Mixtures of methylated (carotenoids) or non-methylated polyenes

with different UV-VIS absorption spectra and chain lengths (i.e. number N of C=C

bonds) are responsible for the colors and their variations in mineralized organisms

(4-5).

Here we report on Raman mapping measurements at 632.8 nm and at 473.1 nm

(resonance) in calcitic and/or aragonitic samples: terrestrial pulmonate gastropod

mollusk shells of the Liguus virgineus species (family Orthalicidae) compared with

corals (Stylaster roseus and Corallium rubrum).

The pigment in Corallium rubrum (calcitic) shows Raman frequencies typical of

polyenic unmethylated chains whereas in Stylaster roseus coral (aragonitic) the

spectrum is similar to that found in a methylated carotenoid pigment as astaxanthin

or canthaxanthin. On the other hand, for the peculiar Liguus virgineus shells

investigated (mainly aragonitic), the pigments show both methylated and

unmethylayed polyenic nature. The results of the Raman mapping distribution of

carbonate species are discussed and compared with those found in marine gastropoda

or bivalve shells, where methylated polyenes are hardly found.

http://en.wikipedia.org/wiki/Terrestrial_animal

http://en.wikipedia.org/wiki/Pulmonate

http://en.wikipedia.org/wiki/Gastropod

http://en.wikipedia.org/wiki/Mollusk

94 | P O S T E R

References:

1 - Urmos, J.; Sharma, S. K.; Mackenzie, F. T., Am. Mineral. 1991, 76, 641–646.

2 - Bergamonti, L.; Bersani, D.; Csermely, D.; Lottici, P.P., Spectrosc. Lett. 2011, 44, 453-458.

3 - Soldati, A. L.; Jacob, D. E.; Wehrmeister, U.; Hager, T.; Hofmeister, W., J. Raman Spectrosc.

2008, 39, 525–536.

4 - Karampelas, S.; Fritsch, E.; Mevellec, J.-Y.; Gauthier, J.-P.; Sklavounos, S.; Soldatos, T., J.

Raman Spectrosc. 2007, 38, 217–230.

5 - Barnard, W.; de Waal, D. J. Raman Spectrosc. 2006, 37, 342–352.

6 - Hedegaard, C.; Bardeau, J.-F.; Chateigner, D., J. Mollus. Stud. 2006, 72, 157–162.

P O S T E R | 95

La popolazione del vergante attraverso lo studio dei cognomi

L. Pedrini1, B. Pedrini

1, E. Rabino Massa

2

1Collaboratore scientifico: Museo di Antropologia ed Etnografia - Università di Torino

2Dipartimento di Scienze della vita e Biologia dei Sistemi - Università di Torino

Nel Vergante, zona collinare situata a sud-ovest del Lago Maggiore, sino a pochi

decenni fa, la migrazione dai paesi montani e collinari verso il fondovalle era scarsa.

La pastorizia e l’agricoltura fornivano alle popolazioni mezzi appena sufficienti per

vivere ma non di più, per cui non vi era neanche immigrazione. Abbiamo verificato

se questa stanzialità c’è stata o c’è ancora in alcuni paesi collinari del Vergante.

La presente ricerca si prefigge lo scopo: a- Di verificare quali siano stati i flussi

migratori delle popolazioni del Vergante nel corso delle ultime cinque generazioni;

b- Di accertare l’eventuale esistenza di una omogeneità biologica valutata sui

cognomi; c- Di avviare indagini genetiche, previo accertamento dell’ isolamento

delle comunità vergantesi, d- Di utilizzare i risultati al fine di un completamento e

confronto con quelli degli studi in corso sulle popolazioni isolate delle Alpi e degli

ambienti lagunari (Progetti Antico Delfinato e L’Uomo e il Lago).

La presente ricerca rappresenta, quindi, uno studio pilota per esaminare, attraverso

l’analisi dei cognomi, l’isolamento dei seguenti 8 paesi del Vergante: Ghevio,

Colazza, Pisano, Corciago, Tapigliano, Nebbiuno Fosseno e Massino. Per ciascuno

dei paesi sopra ricordati abbiano rilevato la frequenza dei cognomi di tre decenni

scelti a caso compresi nel periodo 1866- 1994 (1866-’ 75, 1930-’39 e 1985-‘94).

Dall’esame in dettaglio dei singoli Comuni si evince che, a partire dal 1866, il ceppo

originario appare conservato, pur incidendo meno sulla totalità della popolazione. Le

peculiarità più salienti si rilevano per il Comune di Massino, che mostra il più altro

grado di omogeneità, in quanto il ceppo originario ha mantenuto un alto grado di

persistenza, ed anzi il numero medio degli abitanti con lo stesso cognome è

aumentato. Al contrario del Comune di Corciago, dove il ceppo originario si è

disperso, più che dimezzandosi in 120 anni.

In conclusione si può affermare che nella maggior parte dei Comuni si è potuti

risalire, attraverso ai cognomi, alle famiglie presenti da cinque generazioni e che

l’acquisizione di nuovi patronimici ha permesso di individuare i cambiamenti dovuti

all’ immigrazione.

96 | P O S T E R

Ricerche sulla popolazione di Giaglione (TO) in epoca preunitaria

Sergio De Iasio (1), Giulia Levati (1), Marilena Girotti (2), Marcello Fagiano (2),

Rosa Boano (2)

(1) Dipartimento di Bioscienze, Universita' di Parma

(2) Dipartimento di Scienze della Vita e Biologia dei Sistemi , Università di Torino

La ricerca biodemografica ha storicamente privilegiato l’utilizzo di fonti di flusso

(nascite, matrimoni, morti) per le analisi sui meccanismi microevolutivi delle

popolazioni. In particolare l’attenzione dei ricercatori è stata rivolta ai registri di

matrimonio. Varie circostanze hanno portato a operare verso tale scelta: la possibilità

piuttosto comune di disporre di tali documenti; la facilità nella stima di alcuni

parametri biodemografici da essi desumibili, quali ad esempio i livelli di endogamia

ed esogamia. Tuttavia le fonti di flusso non rendono sufficientemente conto della

frazione di popolazione che ha effettivamente perpetuato la comunità nel tempo,

come pure non danno informazioni sulle modalità di aggregazione dei suoi

componenti, né consentono di valutare l’importanza dei diversi fattori

socioeconomici che possono avere inciso sul processo di continuità della

popolazione. Una valida alternativa alle fonti di flusso può essere l’utilizzo di fonti di

stato censuarie, civili (censimenti) o parrocchiali (gli “status animarum”), che danno

una fotografia molto dettagliata sullo stato della popolazione in un preciso momento.

É bene tuttavia ricordare che esse non sono sempre facilmente reperibili, in

particolare quelle in epoca preunitaria.

In questa prospettiva di studio, il recupero e l’analisi della documentazione censuaria

assume un ruolo prioritario al fine di ovviare alle carenze proprie delle fonti di

flusso.

Nel presente lavoro vengono comparati alcuni stimatori demografici relativi alla

popolazione di Giaglione (Val Susa, Torino) desunti utilizzando i censimenti civili

del marzo 1799 (all’epoca facente parte della effimera Repubblica Piemontese) e del

dicembre 1858 (allora Giaglione era sotto il Regno di Sardegna, riformato dallo

Statuto Albertino, in provincia di Susa, divisione di Torino).

Al 1799 la popolazione di Giaglione risulta costituita da 1348 individui, compresi in

266 unità abitative e ripartiti in 7 frazioni geografiche di dimensioni variabili da 120

a 303 abitanti. Al 1858 la comunità si è accresciuta a 1695 soggetti e 344 famiglie,

dislocate sul territorio in 9 frazioni, più un certo numero di toponimi riferibili

essenzialmente a piccoli gruppi di case sparse.

Le dimensioni degli aggregati abitativi al 1799 evidenziano un numero ristretto di

unità formate da solitari o da due persone soltanto, mentre quelle costituite da 3 a 7

persone sono le più comuni. Molto poche sono le unità di ampie dimensioni (9 o più

P O S T E R | 97

individui). Al censimento sabaudo del 1858 risultano aumentate in modo

significativo le proporzioni sia dei nuclei formati da due persone che da quelli

costituiti da almeno 9 individui, mentre si riducono percentualmente quelli di

dimensioni intermedie, segnali di un cambiamento in atto nelle modalità di

aggregazione della popolazione.

Le unità abitative sono state classificate e comparate sulla base del codice

predisposto da P. Laslett (Laslett, 1977) che consente di individuare gli aggregati

domestici secondo criteri di natura geografica (gli individui che “dormono sotto lo

stesso tetto”), di relazione o affinità familiare (legami familiari naturali o acquisiti

tramite matrimonio) o funzionale (coloro che condividono una certa attività). In linea

con quanto riscontrato nella letteratura demografica (Soliani et al, 1985), la

popolazione risulta strutturata principalmente in aggregati composti da coppie

nucleari, con o senza figli, anche in condizione di vedovanza, specie da parte della

femmina. Tuttavia tra il 1799 e il 1858 si rileva una accresciuta proporzione di

coppie senza figli e di vedovi (maschi) con figli, mentre risulta diminuita la quota di

aggregati estesi (comprendenti anche altri parenti non costituenti un ulteriore nucleo

familiare) e soprattutto multipli (più nuclei famigliari coresidenti), sintomi che al

momento della formazione della coppia si dovrebbe avere avuto una preponderanza

di matrimoni “neolocali”, costituenti cioè nuclei familiari nuovi, senza che il partner

fosse aggregato alla famiglia d’origine del coniuge.

Nella composizione per sesso, le femmine risultano in surplus rispetto ai maschi

rispettivamente di 50 individui (su 1346 totali) nel 1799 e di 17 (su 1695) nel 1858.

Lo sbilanciamento si avverte soprattutto nella fascia d’età degli adulti giovani (dai 20

ai 34 anni), difettose di maschi, presumibilmente causato dal reclutamento di soldati

per l’esercito; lo squilibrio rispetto al rapporto sessi 1:1 è rilevante anche nelle classi

più avanti con gli anni, dai 45 ai 59, ma stavolta a sfavore delle femmine. In assenza

degli atti di morte che lo possano attestare, sembra ragionevole imputare la carenza

di donne dai 45 ai 59 anni alla maggior mortalità femminile collegata al logoramento

fisico e all’indebolimento conseguenti gli stress da parto.

E’ stata inoltre effettuata una analisi della discendenza legittima, conteggiando i figli

minori ancora conviventi con i genitori (almeno uno ancora in vita al momento del

censimento). Naturalmente non può che trattarsi di una stima parziale della

discendenza finale in quanto molte delle spose considerate non avevano ancora

concluso il proprio periodo fertile. Inoltre dal computo mancano i figli deceduti che

non dovevano essere pochi in quanto negli anni censiti la popolazione doveva essere

caratterizzata da un “ancient regime” demografico di tipo pretransizionale, con

valori di natalità e mortalità ancora decisamente elevati. Mancano infine anche i figli

sposatisi precocemente e/o che per vari motivi si erano allontanati dalla famiglie

d’origine. La distribuzione dei nuclei familiari in funzione dei figli censiti evidenzia

una differenza importante tra le due rilevazioni nel numero di coppie coniugali

giovani ancora senza figli, con una quantità di coppie ancora “sterili” molto

98 | P O S T E R

maggiore nel censimento più antico. Probabilmente le modalità di scrittura dei

registri del 1799 per quanto concerne l’indicazione delle relazioni tra ciascun

individuo con il capofamiglia può avere dato adito ad errori interpretativi e forse

avere influito sulla correttezza dell’attribuzione di alcuni figli ai genitori giusti. Ne è

prova il rigetto dell’ipotesi di adattamento della distribuzione di frequenza osservata

a quella teorica di Poisson (p=0,04%), attesa per le popolazioni in regime di

fecondità naturale. Detta sovrastima di coppie senza figli sembra invece non

verificarsi per la distribuzione di frequenza delle dimensioni della prole per il 1858

(p=8,07%). Come suggerito da Cavalli-Sforza e Bodmer (1971), è possibile ovviare

all’errata stima delle coppie senza figli togliendole dalla distribuzione: così è stata

riscontrata la validità nell’adattamento al modello poissoniano (17,4% e 12,3%

rispettivamente per il 1799 e 1958) senza evidenziare fenomeni sistematici di

perturbazione sulla distribuzione dei figli vivi in regime di fecondità naturale.

Malgrado i limiti di analisi già illustrati, è stato possibile osservare la riduzione della

fecondità all’aumentare dell’ordine di nascita cumulando i figli legittimi (ancora)

vivi e rapportando fra loro i valori di ciascun ordine di nascita con il precedente (Livi

Bacci, 1981) . La riduzione della fecondità attesa nelle popolazioni “naturali”

dovrebbe essere attorno al 20% passando da un ordine al successivo. Nel presente

lavoro la riduzione percentuale della fecondità aumenta progressivamente al

succedersi degli ordini di nascita in quanto si assommano tra loro la mancata

conclusione della fecondità delle spose e gli effetti depauperativi della mortalità,

soprattutto di quelli in età preriproduttiva. Si osserva in entrambe i censimenti una

caduta molto più forte nella numerosità dei nuclei familiari passando dalle famiglie

con 4 figli vivi a quelle con 5, indice della criticità nella quale venivano a trovarsi i

nuclei una volta raggiunta una certa dimensione.

Bibliografia: L.L. Cavalli-Sforza, W.F. Bodmer, 1971, The genetics of human populations, H. Freeman, S.

Francisco (USA)

P. Laslett, 1977, Famiglia ed aggregato domestico, in: (a cura di M. Barbagli) Famiglia e

mutamento sociale, 30-54, Il Mulino, Bologna.

M. Livi Bacci, 1981, Introduzione alla demografia, Loescher editore, Torino.

L. Soliani, A. Anelli, R. Zanni, 1985, Aspetti della dinamica delle strutture familiari, in: (a cura di

A. Moroni, A. Anelli, O. Ravera) Atti S.IT.E., 5: 765-776, Zara Edizioni, Parma.

Corresponding author: Sergio De Iasio, Dipartimento Di Bioscienze, V.le Usberti

11/a, Parma tel. 0522 905664 e-mail [email protected]

P O S T E R | 99

Distribution and phylogeny/distance-trees of prokaryotic

photoreactive domains

Carmen Mandalari1, Aba Losi

1, Wolfgang Gärtner

2

1: Dept. of Physics and Earth Sciences, Univ. of Parma (Italy),

2: Max Planck Institute for Chemical Energy Conversion, Mülheim (Germany)

Light is very important for the metabolism of many prokaryotic and eukaryotic

organisms. Prokaryotic organisms often use dedicated red- and blue light sensing

photoreceptor functional domains. There are two main superfamilies of non-

membrane bound photoreceptors: the first ones are bilin-binding phytocrome-related

proteins based on GAF (cGMP-specific phosphodiesterases, cyanobacterial

adenylate cyclases, and formate hydrogen lyase transcription activator FhlA)

domains (bilin-GAF proteins); the second are flavin-binding proteins,

photoreceptive thanks to their LOV (Light, Oxygen and Voltage) and BLUF (Blue

Light sensing Using Flavins) domains [1].

Our model sequence for LOV domains is from the LOV-protein Ytva from B.

subtillis. For BLUF we used the corresponding domain from the T. elongatus PixJ

protein. We searched protein sequences similar to LOV and BLUF domains

employing the BLAST algorithm and then we try to find possible evolutionary paths.

From the research we find 498 proteins with LOV domains in 379 different species

and 751 with BLUF region in 558 organisms. Many species have more than one

protein with these domains and in some cases there is co-presence of both domains.

In most cases LOV and BLUF proteins are modular, with the photoreceptive

modules associated to diverse effector or/and regulative domains. In some

organisms beyond LOV and BLUF there are also phytocrome-related proteins. We

can say that in every bacterial phyla there is at least a photoreactive domain

bleonging to LOV, BLUF or bilin-GAF, whereas archaea possess solely LOV

proteins as soluble photoreceptors.

As for the phylogeny we use neighbouring-method to obtain a branching pattern,

limited to LOV and BLUF sequences, given the uncertainties in alligning bilin-GAF.

We can observe that most of proteins coming from different strains of the same

organism are in the same cluster and, in general, domains from organisms of the

same phyla are neighbour. We can also observe that proteins with the same

functional domains are in the same cluster, so that we should more correctly speak of

distance-trees.

From these observation we can think that proteins could have the same function or

they could be involved in similar signal-transduction/metabolic pathways.

100 | P O S T E R

References 1. A. Losi, W. Gartner, “Bacterial bilin- and flavin-binding photoreceptors”, Photochem. Photobiol.

Sci., 2008, 7, 1168-1178

*Corresponding author: Mandalari Carmen - University of Parma (www.unipr.it),

Department of Physics and Earth Sciences, viale G.P. Usberti 7/A, 43100-Parma (I)

Tel: +39-0521905256, e-mail: [email protected]


P O S T E R | 101

Biomarcatori per la diagnosi precoce del tumore al polmone

Paola Mozzoni1,2

, Iris Banda1,Matteo Goldoni

1,2, Michele Rusca

3, Paolo

Carbognani3, Angelo Casalini

3, Massimo Corradi

1, Antonio Mutti

1.

1 Università degli studi di Parma; 2 INAIL Istituto Nazionale per l’Assicurazione contro gli Infortuni

sul Lavoro; 3 Azienda Ospedaliera di Parma

Il cancro al polmone è la prima causa di morte per patologia neoplastica nei paesi

industrializzati. La prognosi di tale malattia è limitata a causa della mancanza di

validi approcci finalizzati al riconoscimento tempestivo delle lesioni che permettano

di attuare una diagnosi precoce. Appare perciò evidente l’importanza di sviluppare

metodiche in grado di individuare lesioni iniziali. (1-2).

Numerose evidenze sperimentali mostrano il coinvolgimento dei miRNA nella

regolazione di processi biologici che portano alla formazione del tumore, tra cui

l’adesione, l’invasione, la migrazione, la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT)

e l’angiogenesi (3). I microRNA (miRNA) sono una classe di piccoli RNA non

codificanti, generalmente lunghi tra i 18-25 nucleotidi, in grado di regolare

l’espressione genica a livello post-trascrizionale attraverso la degradazione di

specifici RNA messaggeri o attraverso l’inibizione della traduzione in proteina (4).

Il presente lavoro si pone l’obbiettivo di identificare potenziali biomarcatori da

utilizzare nella diagnosi precoce del tumore polmonare non a piccole cellule

(NSCLC) in matrici di facile accesso, quali il plasma e, per la prima volta, il

condensato dell’aria espirata (CAE) con lo scopo di ottenere un test diagnostico non

invasivo con una buona sensibilità e specificità. Sono stati valutati come

biomarcatori due microRNA: il miRNA-21 e il miRNA-486, correlati all’espressione

di oncogeni e oncosoppressori tumorali

Nel plasma l’espressione del miRNA-21 è risultata essere significativamente

maggiore nei soggetti con NSCLC rispetto ai soggetti di controllo sani (P<0.0001),

mentre l’espressione del miRNA-486 ha evidenziato una significativa riduzione di

espressione nei soggetti malati rispetto ai soggetti sani (P<0.0001). Lo stesso

andamento è stato evidenziato nel CAE, anche in questo caso il miRNA-21

presentava una maggiore espressione nei soggetti affetti da NSCLC, rispetto ai

soggetti sani (P=0.0253); al contrario il miRNA-486 mostrava una minore

espressione nei soggetti malati rispetto ai sani. (P=0.0294). Inoltre, considerando il

fatto che i soggetti con valori elevati di miRNA-21 presentavano generalmente bassi

livelli di miRNA-486, è stato valutato il loro rapporto in entrambe le matrici,

ottenendo un aumento del potere discriminante messo in evidenza dalle rispettive

curve ROC (Fig.1 e 2). La curva ROC generata dal rapporto tra il miRNA-21 e il

102 | P O S T E R

miRNA-486 nel plasma presentava una sensibilità dell’87.5% e una specificità

dell’86.8%. L’area sotto la curva era di 0.901 (IC95 0.827-0.975), significativamente

diversa da 0.5. La curva ROC generata dal rapporto tra il miRNA-21 e il miRNA-

486 nel CAE presentava una sensibilità dell’60% e una specificità dell’71.1%. L’area

sotto la curva era di 0.678 (IC95 0.549-0.806), significativamente diversa da 0.5.

Utilizzando gli indicatori valutati nel plasma e nel CAE, che nel confronto tra gruppi

erano risultati statisticamente differenti come variabili predittive e come variabile

dipendente lo status (malato o sano), è stata effettuata la regressione logistica binaria

per valutare la capacità di tali indicatori nel classificare i soggetti. Nell’insieme il

miRNA-21 e il miRNA-486 erano in grado di distinguere correttamente i soggetti

con tumore polmonare nel 76.5% dei casi (13/17) e i soggetti senza tumore nel

96.6% dei casi (28/29), con una percentuale globale dell’89.1%.

Questi risultati, seppur preliminari, evidenziano come i miRNA possano essere

considerati dei buoni biomarcatori precoci per la diagnosi di NSCLC, in matrici

periferiche di facile accesso, quali il sangue e per la prima volta il condensato

dell’aria espirata. Questo risultato è molto importante perché permetterebbe di

diagnosticare la malattia senza l’utilizzo di esami strumentali invasivi. Si potrebbe

quindi pensare ad un loro ipotetico utilizzo a fianco delle tradizionali tecniche di

imaging a scopo diagnostico e prognostico.

Figura 1

Fig. 1. A: Rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel plasma di soggetti sani (CTR, ) e di soggetti affetti

da NSCLC(▲). B: Curva ROC del rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel plasma. E’ indicato il punto

di flesso

P<0.0001

***

A

CTR NSCLC0.1

1

10

100

Rel

ativ

e E

xpre

ssio

n

miR

NA

-21/m

iRN

A-4

86 P

lasm

a

B

P O S T E R | 103

Figura 2

Fig. 2. A: Rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel CAE di soggetti sani (CTR,) e di soggetti affetti da

NSCLC (▲). B: Curva ROC del rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel CAE. E’ indicato il punto di

flesso.

Bibliografia

1. Al-Kattan K, Sepas E, Fountain SW, Townsend ER. (1997), “Disease recurrence after resection

for stage I lung cancer”. Eur J Cardiothorac Surg;12:380-384.

2. Westeel V, Choma D, Clement F, Woronoff-Lemsi MC, Pugin JF, Dubiez A, Depierre A.

Relevance of an intensive postoperative follow-up after surgery for non-small cell lung cancer.

Ann Thorac Surg 2000; 70:1185-1190.

3. Lages E, Ipas H, Guttin A, Nesr H, Berger F, Issartel JP. MicroRNAs: molecular features and role

in cancer. Front Biosci. 2012 Jun 1;17:2508-40.

4. Hussain MU. Micro-RNAs (miRNAs): genomic organisation, biogenesis and mode of action. Cell

Tissue Res. 2012 Aug;349(2):405-13.

Corresponding author: Dott.ssa Paola Mozzoni Dipartimento di Medicina Clinica e

Sperimentale, Via Gramsci, 14 – 43126 Parma; Tel 0521-033078; e-mail:

[email protected]

A B

CTR NSCLC0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

Rel

ativ

e E

xpre

ssio

n

miR

NA

-21/m

iRN

A486 C

AE

P=0.0289

*

104 | P O S T E R

Comparative analysis of cytotoxic effects INDUCED BY N4-

ethylmorpholine citronellalthiosemicabazone complexes in different

human cancer cell lines

Franco Biscegliea, Rossella Alinovi

b, Silvana Pinelli

b, Pieralberto Tarasconi

a,

Annamaria Buschinic, Francesca Mussi

c, Giorgio Pelosi

a

a Department of Chemistry,

b Department of Clinical and Experimental Medicine,

c Department

of Biosciences, University of Parma,

Thiosemicarbazone and their metal complexes are a class of compounds that

present interesting biological properties among which the ability to inhibit

proliferation of a wide variety of cancerous cell lines. In the course of our studies,

we have assessed that their activity is certainly due to more than one cellular target

and, interestilngly, is strongly dependent on the typology of tumour cells.[1] Their

high selectivity is highlighted in in vitro models: some cell lines are very sensitive

and others are totally insensitive. In previous papers we have reported that in

human leukaemia cell line U937 two N4-ethylmorpholine

citronellalthiosemicarbazone complexes, [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] and [Cu(Etmorph-

S-tcitr)2], showed strong antiproliferative activities.[2, 3] The aim of this study is

therefore to perform a comparative analysis of cytotoxic effects (apoptosis and

oxidative stress induction) of these two compounds in four cancer cell lines of

different malignancies: the histiocytic lymphoma cell line U937, the promyelocytic

leukemia cell line HL-60, the colon adenocarcinoma cell line HT-29 and the

neuroepithelioma cell line SK-N-MC.

A first comparison of IC50 values evidenced that the copper complex is

systematically more potent. Both complexes exhibit the highest cytotoxic activity

on U937, while SK-N-MC cells resulted to be the most resistant (Tab. 1).

IC50 (µM)

[Ni(Etmorph-S-tcitr)2] [Cu(Etmorph-S-tcitr)2]

U937 12.3 + 0.9 2.3 + 0.4

HL60 15.4 + 1.8 6.0 + 0.9

HT29 52.6 + 6.3 14.9 + 3.4

SK-N-MC 21.2 + 2.7 5.7 + 1.2

Table 1. IC50 values for the tested cell lines exposed to compounds

[Ni(Etmorph-S-tcitr)2] and [Cu(Etmorph-S-tcitr)2]

P O S T E R | 105

More specifically, treatment with the IC50 concentration of each compound

resulted in a significant induction of apoptosis in U937, HL 60 and SK-N-MC cells

but not in HT-29 line. These results were confirmed by the DNA fragmentation

assay and caspase activation: no modification of caspase activities was observed in

HT-29.

Figure 1. Caspase activity (above) and ROS levels (below) induced by compounds [Ni(Etmorph-S-

tcitr)2] (left) and [Cu(Etmorph-S-tcitr)2] (right)

The same trends in ROS (Reactive Oxygen Species) intracellular levels were

observed for U937 and SK-N-MC cells: [Cu(Etmorph-S-tcitr)2] caused a time-

dependent increase and [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] only an early transient increase.

These oxidative stress markers were not modified in HL-60 cells by both

U937 HL60 HT29 SK-N-MC

100

1000

***

*

**

**

*

***

*

***

Casp

ase

activity

(% a

s compare

d t

o c

ontr

ols)

U937 HL60 HT29 SK-N-MC

100

1000

Cas-8

Cas-9

Cas-3

*

***

* *

***

* **

U937 HL60 HT29 SK-N-MC0

100

200

300

400

500

**

***

***

****

ROS

(% a

s compare

d t

o c

ontr

ols)

[Ni(Etmorph-S-tcitr)2] [Cu(Etmorph-S-tcitr)

2]

U937 HL60 HT29 SK-N-MC0

100

200

300

400

5001 h

4 h

24 h

*****

***

***

*

***

[Ni(Etmorph-S-tcitr)2] [Cu(Etmorph-S-tcitr)

2]

106 | P O S T E R

complexes. Intracellular ROS of HT-29 were more than 4 fold the control value

during the early phases of [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] exposure; a lower and later

increase of ROS was observed during [Cu(Etmorph-S-tcitr)2] treatment (Fig. 1).

The effects of [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] and [Cu(Etmorph-S-tcitr)2] on different

cell lines are extremely heterogeneous. This different “sensitivity” makes difficult

to hypothesise a general action mechanism and to generalize structure-activity

correlation. The choice of the cellular model used to investigate the interaction of

thiosemicarbazone complexes with the biological systems has come out to be a

crucial phase in in vitro studies.

References [1] G. Pelosi Thiosemicarbazone Metal Complexes: From Structure to Activity The Open

Crystallography Journal, 2010, 3, 16-28.

[2] M. Belicchi-Ferrari, F. Bisceglie, A. Buschini, S. Franzoni, G. Pelosi, S. Pinelli, P. Tarasconi

and M. Tavone Synthesis, structural characterization and antiproliferative and toxic bio-activities of

copper(II) and nickel(II) citronellal N4-ethylmorpholine thiosemicarbazonates, J. Inorg. Biochem.

2010, 104, 199-206.

[3] F. Bisceglie, S. Pinelli, R. Alinovi, P. Tarasconi, A. Buschini, F. Mussi, A. Mutti and G.

Pelosi, Copper(II) thiosemicarbazonate molecular modifications modulate apoptotic and oxidative

effects on U937 cell line, J. Inorg. Biochem. 2012, 116, 195-203.

Corresponding author: Giorgio Pelosi - Department of Chemistry, University of

Parma, Parco Area delle Scienze 17A 43124 Parma (Italy), tel. +390521905420, e-

mail: [email protected]

P O S T E R P a g . | 107

Effetti citotossici degli ossidi di cobalto e di titanio su cellule A549.

Rossella Alinovi2,

Silvana Pinelli2,

Matteo Goldoni1,

Paola Mozzoni1, Davide

Dallatana3, Alessio Perotti

2, Antonio Mutti

2

1CERT Centro di Eccellenza per la Ricerca Tossicologica,

2Dipartimento di Medicina Clinica e

Sperimentale, 3Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali, Università degli

Studi di Parma.

La continua e rapida espansione delle nanotecnologie ha comportato la diffusione

negli ambiente di vita e di lavoro di nanoparticelle (NP) che costituiscono un

rilevante problema sanitario: per le loro dimensioni (inferiori a 100 nm) sono in

grado di penetrare nell’apparato respiratorio fino a raggiungere gli alveoli polmonari,

con conseguenti insorgenze od aggravamenti di patologie respiratorie e

cardiopolmonari (1). Un contributo fondamentale alla comprensione dell’interazione

fra NP e sistemi biologici, dei meccanismi d’azione e dei possibili effetti viene

fornito dagli studi in vitro (2). In seguito ad esposizione a NP costituite da metalli e

dai loro ossidi sono stati evidenziati alterazioni mitocondriali, danni al DNA,

produzione di radicali liberi e fattori pro-infiammatori (3, 4).

Tra le NP di interesse industriale quelle di diossido di Titanio (TiO2) e di ossido di

Cobalto (Co3O4) sono diffusamente utilizzate, oltre che come pigmenti e

catalizzatori, nella produzione di schermi per raggi UV (Ti NP) e di sensori (Co NP).

In questo studio sono stati confrontati gli effetti di NP di ossido di Co e di ossido di

Ti su cellule A549, derivate da un adenocarcinoma polmonare. Questa linea cellulare

è stata scelta perché l’apparato respiratorio costituisce la principale via di inalazione

ed assorbimento di NP e quindi un potenziale bersaglio (5).

Nel medium di coltura le NP tendono ad aggregarsi, formando agglomerati di

notevoli dimensioni (alcuni µm).

Solo concentrazioni molto elevate di NP riducono la vitalità cellulare senza indurre

processi apoptotici: IC50 201.13+59.51 e 459.03+83.37 µg/ml rispettivamente per Co

e Ti. Concentrazioni non letali (50 e 100 µg/ml) di entrambe le NP sono tuttavia in

grado di disturbare l’adesione delle cellule al substrato di coltura ed di provocare

alterazioni nel ciclo cellulare di A549 esposte a Co, con una significativa

diminuzione delle cellule in fase S e G2/M.

Nel corso dell’esposizione a Co si osserva inoltre un elevato incremento dose-

dipendente di specie reattive dell’ossigeno (ROS), con conseguente significativo

aumento dei prodotti dello stress ossidativo sulle proteine (gruppi carbonilici), sui

lipidi di membrana (TBARS-Thiobarbituric acid reactive substances) e con

108 | P O S T E R

induzione di attività enzimatiche scavenger (eme ossigenasi-1). Nelle fasi iniziali del

trattamento (1 h) compare anche un lieve danno genotossico, evidenziato col metodo

del Comet alcalino. Questo effetto precoce è reversibile ed il recupero, presente già

dopo 4 h, è completato dopo 24 h.

Il nostro studio ha dimostrato che modelli sperimentali in vitro costituiscono una fase

importante per la comprensione dei meccanismi di tossicità di nanoparticelle di uso

industriale e che le peculiari caratteristiche chimico-fisiche delle NP rendono

impossibile qualsiasi generalizzazione.

E’ inoltre stato confermato che NP metalliche, in particolare Co NP, producono

ROS, in grado di provocare danni a livello di macromolecole e strutture cellulari. E’

tuttavia ipotizzabile che l’azione delle NP si esplichi con un meccanismo multi-

target.

Finanziato dalla Ricerca Finalizzata RF-2009-1472550: Integrated approach to

evaluate biological effects on lung, cardiovascular system and skin of occupational

exposure to nanomaterials (NanO I-LuCaS).

Bibliografia:

1. NIOSH National Institute for Occupational Safety and Health. Approaches to the safe

nanotechnology. Managing the health and safety concerns associated with engineered

nanomaterials. USA, 2009.

2. Han X., Corson N., Wade-Mercer P. et al. Assessing the relevance of in vitro studies in

nanotoxicology by examining correlations between in vitro and in vivo data. Toxicology 2012,

297; 1-9.

3. Lewinski N., Colvin V., Drezek R. Cytotoxicity of nanopartcles. Small 2008, 4: 26-49.

4. Rivera Gil P., Oberdorster G., Elder A., Puntes V., Parak W.J. Correlating physico-chemical with

toxicological properties of nanoparticles: the present and the future. ACS Nano 2010, 4, 5527-

5531.

5. Yang W., Peters J.I., Williams R.O. Inhaled nanoparticles. A current review. Int. J. Pharm. 2008,

356: 239-247.

Corresponding author: Alinovi Rossella - Dipartimento di Medicina Clinica e

Sperimentale, Università degli Studi di Parma, Via Gramsci, 14 - 43126 Parma

Tel. 0521 033093 e-mail: [email protected]


P O S T E R P a g . | 109

Enzimatic biomarkers in the gilthead seabream juveniles fed with

graded concentrations of alchylphenols

Ilaria Traversi1,3*

, Eugenia Gambetta1, Valentina Nozzi

2, Francesca Maradonna

2,

Oliana Carnevali2,3

, Alberta Mandich1,3

1Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova,

viale Benedetto XV 5,16132 Genova 2Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente, Università Politecnica delle Marche, via Brecce

Bianche, 60131 Ancona 3INBB Consorzio Interuniversitario di Biosistemi e Biostrutture, via Medaglie d’Oro, 00136 Roma

The presence of different types of organic pollutants, in both wild and cultured

teleosts, has been widely reported. Among organic pollutants, 4-t-octylphenol

(OCT), and 4-nonylphenol (NP) are man-made contaminants possessing

controversial endocrine disruption properties [1]. Gilthead seabream (Sparus aurata

L) is one of the most important commercial species for Mediterranean aquaculture

and one of the marine species more frequently used as bioindicator of endocrine

disruption [2]. The aim of this study was to investigate in seabream juveniles the

effects of OCT and NP enriched diet on biotransformation, measured as

ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity (phase I) and glutathione-S-

transferase (GST) activity (phase II). The effects on the activity of antioxidant

defences was determined by measuring catalyse (CAT) activity. Vitellogenin (Vtg)

and Zona radiata protein (Zrp) expressions were used as endocrine biomarkers of

exposure [3]. Seabream juveniles were divided into 8 groups of 20 animals (10g/bw)

each: control, solvent control (ethanol) and 6 groups exposed to 3 graded

concentrations of OCT (5, 50 e 100 mg /kg/day OCT1, OCT2, OCT3 respectively)

and NP (5, 50 e 100 mg /kg/day NP1, NP2, NP3 respectively) for 21 days. At the end

of the exposure, liver was immediately frozen for the enzymatic activity assays and

for RNA extraction for Vtg and Zrp mRNA assay. Liver weight was recorded for

hepatosomatic index (HSI). VTG e Zrp gene expression was evaluated by Q-RT-

PCR by using Sybergreen method. EROD activity was measured in microsome

suspension recording the increase in fluorescence for the resorufin formation; GST

activity in the cytosolic fraction was analyzed with spectrophotometer, following the

formation of s-2,4-dinitro phenyl glutathione, at 340 nm; CAT was

spectrophotometrically assayed at 240 nm, by consumption of H2O2. Significant

increase of HIS was observed in NP1, NP2 and OCT1. mRNA Vtg expression was

significantly higher in both NP1 and NP2 and in OCT2. Vtg and Zrp gene expression

valuation on NP3 and OCT3 groups are still in progress. OCT significantly inhibited

CAT activity (p<0,0005) in all groups, while CAT activity was significantly

(p<0,0005) inhibited only in NP1 and in NP3 (p<0,01). GST activity was

110 | P O S T E R

significantly increased in NP1 and NP2 (p<0,05) and decreased in OCT3 (p<0,005).

EROD activity was significantly lower (p<0,05) only in NP2 and NP3, while all

OCT concentrations induced lower EROD activity. Concluding the obtained results

evidenced negative effects of both NP and OCT exposure in every concentrations

here analyzed, although a dose dependent response was not evidenced, suggesting a

detrimental effects on the reproduction of this important economic model.

Progetto F-2009-1536185, finanziato dal Ministero della Salute.

Bibliografia.

[1] Pérez Carrera E., García-López A., Martín del Río M.P., Martínez-Rodríguez G., Solé M.,

Mancera J. M. Effects of 17β-estradiol and 4-nonylphenol on osmoregulation and hepatic

enzymes in gilthead sea bream (Sparus auratus). Comparative Biochemistry and Physiology, Part

C (2007), 145: 210–217

[2] Teles M., Pacheco M., Santos M. A. Sparus aurata L. liver EROD and GST activities, plasma

cortisol, lactate, glucose and erythrocytic nuclear anomalies following short-term exposure either

to 17h-estradiol (E2) or E2 combined with 4-nonylphenol. Science of the Total Environment

(2005) 336: 57– 69

[3] Arukwe, A., Goksory, A. Eggshell and egg yolk proteins in fish: hepatic proteins for the next

generation: oogenetic, population, and evolutionary implications of endocrine disruption. Review.

Comparative Hepatology (2003) 2:4 http://www.comparative-hepatology.com/content/2/1/4

Corresponding author: Traversi Ilaria, Dipartimento di Scienze della Terra,

dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova, viale Benedetto XV

5,16132 Genova tel 0103538046 – 3202622463 e-mail [email protected]

http://www.comparative-hepatology.com/content/2/1/4


P O S T E R P a g . | 111

Hepatic activities in Sparus Aurata L. juveniles fed with bisphenol A

enriched diet.

Ilaria Traversi1,3

, Annalisa Scorolli2, Giorgia Gioacchini

2, Gabriele Roncoli

1,

Oliana Carnevali2,3

, Alberta Mandich1,3

1Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova,

viale Benedetto XV 5,16132 Genova 2Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente, Università Politecnica delle Marche, via Brecce

Bianche, 60131 Ancona 3INBB Consorzio Interuniversitario di Biosistemi e Biostrutture, via Medaglie d’Oro, 00136 Roma

A large number of compounds have been reported to exhibite endocrine modulating

activity. These include chemicals such as Bisphenol-A (BPA), a man-made

contaminant, extensively used for human-manufactured products [1]. Recently, from

60 to 90% BPA-contamined fish has been found along South-Italian coasts,

demonstrating increasing impact of this contaminant in the marine environment [2].

Gilthead seabream (Sparus aurata L) is one of the most important commercial

species for Mediterranean aquaculture and one of the marine species more frequently

used as bioindicator of endocrine disruption [3]. This study aimed to relate the

effects of BPA-enriched diet to catalase (CAT), CYP1A-dependent 7-

ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) and glutathione S-transferase (GST) activities

in seabream juveniles. Vitellogenin (Vtg) and Zona radiata protein (Zrp) expressions

were measured as endocrine biomarkers of exposure [4]. Eight groups 8-10g/bw

seabream juveniles (n=20) were reared for 21 days under laboratory condition in 200

l tanks, at 18°C, 10L/14D photoperiod. Two groups were kept as control (C) and

solvent control (CSP). Experimental groups were fed on commercial diet enriched

with increasing concentrations of BPA (BPA1:5 mg/g/day, BPA2: 50 mg/g and

BPA3: 100 mg/g). At the end of the exposure, liver was immediately frozen for

enzymatic activities and mRNA extraction. Liver weight was recorded for

hepatosomatic index (HSI). EROD activity was measured in microsome suspension

recording the increase in fluorescence for the resorufin formation; GST activity in

the cytosolic fraction was analyzed to spectrophotometer, following the formation of

s-2,4-dinitro phenyl glutathione, at 340 nm; CAT was spectrophotometrically

assayed at 240 nm, by consumption of H2O2. VTG e Zrp gene expression was

evaluated by Q-RT-PCR by using Sybergreen method. More than 50% BPA3

exposed juveniles died after two week exposure and only two groups (BPA1 and

BPA2) were available for analyses at the end of the trials. Significant increase of

HSI, Zrp and Vtg expression was observed in both BPA1 and BPA2 (p<0,05) with

significantly higher levels of both biomarkers in BPA1. EROD and CAT activities

were significantly (p<0,001) inhibited in BPA1 and BPA2.

112 | P O S T E R

In conclusion the results here obtained clearly showed that the selected biomarkers

will be useful for monitoring the presence of Bisphenol-A on marine environment as

well as on commercial diet widely employed on aquaculture practice.

Progetto F-2009-1536185, finanziato dal Ministero della Salute.

Bibliografia

[1] Vandenberg L. N., Maffini M. V., Sonnenschein C., Rubin B. S., Soto A. M. Bisphenol-A and the

Great Divide: A Review of Controversies in the Field of Endocrine Disruption. Endocrine

Reviews (2009) 30(1):75–95.

[2] Mita L., Bianco M., Viggiano E., Zollo F., Bencivenga U., Sica V., Monaco G., Portaccio M.,

Diano N., Colonna A., Lepore M., Canciglia P., Mita D.G. Bisphenol A content in fish caught in

two different sites of the Tyrrhenian Sea (Italy). Chemosphere (2011), 82: 405–410.

[3] Teles M., Pacheco M., Santos M. A. Sparus aurata L. liver EROD and GST activities, plasma

cortisol, lactate, glucose and erythrocytic nuclear anomalies following short-term exposure either

to 17h-estradiol (E2) or E2 combined with 4-nonylphenol. Science of the Total Environment

(2005) 336: 57– 69.

[4] Arukwe, A., Goksory, A. Eggshell and egg yolk proteins in fish: hepatic proteins for the next

generation: oogenetic, population, and evolutionary implications of endocrine disruption. Review.

Comparative Hepatology (2003) 2:4 http://www.comparative-hepatology.com/content/2/1/4

Corresponding author: Traversi Ilaria, Dipartimento di Scienze della Terra,

dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova, viale Benedetto XV

5,16132 Genova tel 0103538046 – 3202622463 e-mail [email protected]

http://www.comparative-hepatology.com/content/2/1/4


P O S T E R P a g . | 113

K:D-Rib un inibitore della proliferazione delle cellule tumorali ed un

promotore del folding di DNAzima.

L.Bruni1,2,3

S.Croci1,2

1. Dipartimento di Neuroscienze - Unità di Biofisica e Fisica Medica - Università di Parma

2. INBB Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi - ROMA

3. Fondazione Valsè Pantellini

Le cellule tumorali mostrano un aumento della glicolisi anche in presenza d’ossigeno

disponibile. Questo processo chiamato “Effetto Warburg” è uno dei fondamentali

switch metabolici che una cellula cancerosa manifesta se paragonata ad una cellula

non cancerosa. Tra i trasportatori del glucosio c’è la famiglia SGLT (cotrasportatore

Na+/glucosio). L’elevata concentrazione totale di sodio in lesioni mammarie tumorali

misurata con 23

Na-MRI sembra essere un indicatore del livello cellulare di malignità

[1].

Il ruolo del D-ribosio e dello ione potassio (K+) sono ampiamente noti: il D-ribosio è

un aldopentoso, assiste il metabolismo energetico della cellula oltre ad esser un

precursore d’alcuni aminoacidi; lo ione K+ è coinvolto in molti processi tra cui

apoptosi, genesi e mantenimento del potenziale di membrana e stabilizza il folding

dei G-quadruplex. C'è un interesse crescente nell’utilizzo di G-quadruplex anche

come sensori per lo ione K+ [2].

Per saggiare l’effetto del K:D-Rib sulla proliferazione delle linee cellulari non si

sono potuti utilizzare i comuni saggi metabolici (MTT assay, WST-1 assay ecc) in

quanto K:D-Rib interagisce con il bromuro di tetrazolio riducendolo a formazan [3].

Ci siamo perciò avvalsi di un metodo d’uso comune: le cellule (4000 cell/ml trattate

con K:D-Rib 5mM e incubate per 12 gg) sono state contate utilizzando il programma

ImageJ ed in seguito si è calcolato il tempo di duplicazione. Il controllo ha mostrato

un tempo di duplicazione di 44 ore, mentre il trattato di 59 ore. L’effetto rilevato è un

progressivo rallentamento della proliferazione cellulare del trattato rispetto al

controllo.

Il saggio delle colonie, nel quale si contano gruppi cellulari di almeno 50

unità, ha confermato i risultati delle curve di crescita, mostrando ancora una volta un

effetto antiproliferativo del K:D-Rib sia sulla linea HTB-126 [3] che HTB-30

(metastasi pleurica di carcinoma mammario). Quest’ultima linea cellulare ha

mostrato 15 colonie per il controllo e nessuna colonia per i trattati. Questi dati

sperimentali unitamente ad una ricca bibliografia sui canali K+ [2] e sul ruolo stesso

del K+ ci hanno portato a ipotizzare che una fine regolazione della concentrazione di

K+ stia alla base del “corretto funzionamento” delle cellule. Da qui l’esigenza di

114 | P O S T E R

valutare se K+

entri o no nelle cellule in seguito al trattamento con K:D-Rib. La

concentrazione di K+ è stata misurata sfruttando la formazione di una macromolecola

chiamata DNAzima [4]. Dalla concentrazione di DNAzima si è in grado, attraverso

spettroscopia UV-VIS, di misurare se lo ione K+ è presente nella soluzione.

Abbiamo quindi verificato la formazione di questa molecola in presenza di K:D-Rib

5mM. Il DNAzima così formato può essere utilizzato come biosensore per la misura

della concentrazione del K+ nel mezzo cellulare, prima e dopo il trattamento.

Risultati preliminari sembrano indicare che il surnatante delle HTB-126 trattate con

K:D-Rib 5mM per 48h mostrano una concentrazione di DNAzima inferiore rispetto

al DMEM (terreno di coltura delle cellule) con K:D-Rib 5mM, ma superiore al solo

DMEM ed al surnatante del controllo (HTB-126 non trattate). Possiamo dire che una

parte di K+

entri all’interno della cellula e che il DNAzima possa essere utilizzato

come biosensore di K+.

Bibliografia:

[1] Ronald Ouwerkerk, Michael A. Jacobs , Katarzyna J. Macura, Antonio C. Wolff, Vered Stearn,

Sarah D. Mezban, Nagi F. Khouri, David A. Bluemke, Paul A. Bottomley Elevated tissue sodium

concentration in malignant breast lesions detected with non-invasive 23Na MRI. Breast Cancer Res

Treat (2007) 106:151–160.

[2] Zhiguo Wang Roles of K+ channels in regulating tumour cell proliferation and apoptosis. Eur J

Physiol (2004) 448: 274–28:

[3] S. Croci, L. Bruni, S. Bussolati, M. Castaldo, M. Dondi Potassium bicarbonate and D-ribose

effects on A72 canine and HTB-126 human cancer cell line proliferation in vitro. Cancer Cell

International (2011) vol. 11 11-30.

[4] Travascio P, Li Y, Sen D.. DNA-enhanced peroxidase activity of a DNA-aptamer-hemin complex.

Chem Biol (1998) 5:5 05–517.

P O S T E R P a g . | 115

Contenuto e mappa di distribuzione del magnesio intracellulare in

cellule farmaco-resistenti e -sensibili

Emil Malucelli,1,5

, Stefano Lagomarsino2, Lucia Merolle

1, Chiara Marraccini

3,

Azzurra Sargenti1, Concettina Cappadone

1, Giovanna Farruggia

1,5, Alessia Cedola

4,

Michela Fratini4, Andrea Notargiacomo

4, Marco Lombardo

6, Claudio Trombini

6,

7Alessandra Gianoncelli, Stefano Iotti

1,5.

1Dipartimento Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;

2Istituto per i Processi Chimico-

Fisici, c/o Dipartimento di Fisica, Università la Sapienza, Roma, 3Dipartimento di Scienze della Vita,

Università di Modena e Reggio Emilia; 4Istituto di Fotonica e Nanotecnologie - CNR, Roma;

5Istituto

Nazionale Biostrutture e Biosistemi; 6Dipartimento di Chimica, Università di Bologna;

ELETTRA -

Sincrotrone Trieste S.c.p.A., Basovizza Trieste

Introduzione

Il magnesio nelle cellule gioca un ruolo importante sia strutturale che di regolazione.

Nonostante la copiosa mole di dati che si possono trovare sulla biochimica del

magnesio, la fotografia della sua distribuzione e la comprensione della sua omeostasi

sono ancora incomplete sia per limitazioni strumentali che per difficoltà concettuali.

I recenti sforzi nell’applicazione di nuove tecniche di imaging nel campo della

ricerca sul magnesio non hanno permesso ancora l'accurata mappatura édella

distribuzione e del contenuto intracellulare di questo ione perché l'acquisizione di

informazioni dettagliate su processi intracellulari richiede una elevata risoluzione

spaziale, dati quantitativi e informazioni chimiche.

Per riuscire a soddisfare tutti questi requisiti, abbiamo dimostrato in un recente

articolo [1] che è possibile unire informazioni sulla composizione degli elementi

chimici, utilizzando X-Ray Fluorescence Microscopy (XRFM) e sulla morfologia

cellulare, tramite Atomic Force Microscopy (AFM). Combinando queste due

tecniche è possibile quantificare la concentrazione di qualsiasi elemento. Grazie ai

recenti miglioramenti delle sorgenti di raggi X dei sincrotroni di terza generazione e

al miglioramento delle ottiche di focalizzazione, la XRFM rappresenta la tecnica

ideale per effettuare questo tipo di misure. In particolare, la XRFM è un metodo con

elevata sensibilità per mappare la distribuzione di elementi all’interno delle cellule

come Carbonio, Azoto, Ossigeno, Sodio e Magnesio in una singola acquisizione.

Obiettivo

Lo scopo di questo studio è confrontare il contenuto e la distribuzione di Magnesio in

linee cellulari tumorali chemio-resistenti e -sensibili fissate chimicamente. Il modello

sperimentale utilizzato è una linea cellulare umana di carcinoma del colon (LoVo)

sensibili e resistenti alla doxorubicina, uno dei farmaci maggiormente utilizzato nella

terapia di tumori solidi.

Metodi

XRFM può mappare il contenuto degli elementi ma non la concentrazione, che è la

variabile rilevante nel contesto biologico. Abbiamo affrontato questo problema

116 | P O S T E R

combinando XRFM (risoluzione spaziale 0.5x0.5 micrometri) con la AFM

(risoluzione spaziale 0.12x0.12 micrometri) che consente di misurare lo spessore

della cellula analizzata. Questa combinazione di tecniche ha richiesto

l'implementazione di un nostro algoritmo di "multimodal fusion" che consente di

allineare immagini ottenute con tecniche e risoluzioni spaziali diverse. Questo nuovo

approccio sperimentale offre il vantaggio di combinare le informazioni sul contenuto

degli elementi con informazioni morfologiche di una singola cellula entrambe con

risoluzione spaziale sub-micrometrica.

Risultati

Utilizzando questo approccio abbiamo determinato:

i) Nella cellule farmaco resistenti analizzate, il contenuto (espresso in frazione

in peso) di magnesio è maggiore che nelle cellule sensibili. In particolare

nelle cellule resistenti abbiamo ottenuto un valore di magnesio oltre 5 volte

superiore rispetto alla sensibile in una ROI (8x8 mm) posizionata in

corrispondenza del nucleo.

ii) La mappa di magnesio intracellulare mostra una marcata differenza nel

pattern di distribuzione tra le cellule farmaco-resistenti e -sensibili.

Conclusioni

I risultati di questo lavoro confermano anche in cellule doxorubicina resistenti un

maggiore contenuto di magnesio intracellulare rispetto alle sensibili come

recentemente osservato con assorbimento atomico in una linea cellulare cis-platino

resistente [2]. Inoltre la diversa distribuzione riscontrata fornisce una ulteriore

evidenza del ruolo del magnesio nella genesi del fenotipo della farmaco-resistenza.

Riteniamo quindi che questa metodologia di analisi possa diventare un sistema di

riferimento non solo per la misura del Magnesio, ma anche per altri elementi leggeri.

Inoltre rappresenta un prezioso strumento per un’accurata mappatura di diversi

elementi intracellulari sia in condizioni patologiche che normali.

Bibliografia 1. Lagomarsino S., Iotti S., Farruggia G., Cedola A., Trapani V., Fratini M., Bukreeva I.,

Notargiacomo A., Mastrototaro L., Marraccini C., Sorrentino A., McNulty I., Vogt S., Legnini

D., Kim S., Giagnoncelli A. Maier J.A.M, Wolf. F.I. Intracellular concentration map of

magnesium in whole cells by combined use of X-ray fluorescence microscopy and atomic force

microscopy. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 66 (11–12), 834–840, 2011

2. Marverti G., Ligabue A., Montanari M., Guerrieri D., Cusumano M., Di Pietro M.L., Troiano L.,

Di Vono E., Iotti S., Farruggia G., Wolf F.I., Monti M.G., Frassineti C. Characterization of the

cell growth inhibitory effects of a novel DNA-intercalating bipyridyl-thiourea-Pt(II) complex in

cisplatin-sensitive and-resistant human ovarian cancer cells. Invest New Drugs, 29(1), 73-86,

2011.

Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e

Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, 40127 Bologna, tel. 051 2095625, e-mail

[email protected]

http://www.sciencedirect.com/science/journal/05848547

http://www.sciencedirect.com/science/journal/05848547/66/11


P O S T E R P a g . | 117

Modificazioni del contenuto intracellulare di magnesio durante

l’apoptosi mitocondrio-mediata: studi degli eventi precoci correlati

al potenziale mitocondriale

1Lucia Merolle,

1Concettina Cappadone,

1,2Giovanna Farruggia,

3Chiara

Marraccini, 1Azzurra Sargenti,

4Alessia Colanardi,

1,2Stefano Iotti

1Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;

2 Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi,

3Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio Emilia;

4Istituto di Farmacologia Traslazionale- CNR L'Aquila.

L’apoptosi non solo è un processo geneticamente controllato per il mantenimento

dell’omeostasi tissutale, ma è uno degli effetti antineoplastici indotti da molti agenti

chemioterapici. Diversi cationi sono coinvolti nei processi apoptotici, e la maggiore

enfasi è stata posta sul ruolo giocato dagli ioni calcio, considerato un importante

secondo messaggero intracellulare. Più recentemente l’attenzione si e' focalizzata nel

coinvolgimento del magnesio nei processi apoptotici, anche se la letteratura

sull'argomento è tuttora piuttosto scarsa e spesso presenta risultati contraddittori.

Uno studio recente ha evidenziato l’attività antitumorale di un nuovo derivato

indolico, MM67, che è in grado di attivare l’apoptosi mitocondrio-mediata e di

determinareun calo del contenuto intracellulare di magnesio in cellule di

adenocarcinoma umano del colon, HT-29 [1]. Le cellule trattate con questo agente

proapoptotico mostrano un arresto nella fase G2/M del ciclo cellulare, un aumento

significativo dell’espressione di Bax, la depolarizzazione della membrana

mitocondriale e un netto rilascio di citocromo c dal compartimento mitocondriale

[2]. Il mitocondrio è l’organello di stoccaggio del magnesio intracellulare [3], e

l’osservazione che nell’apoptosi indotta da MM67 si osserva una diminuzione dello

ione ci ha fatto ipotizzare che il magnesio sia coinvolto nella via intrinseca di

induzione di apoptosi.

Scopo di questo lavoro è stato quello di seguire le variazioni temporali del magnesio,

sia libero che totale, durante l’apoptosi indotta da MM67 e di valutarne la

correlazione con le variazioni del potenziale mitocondriale (Δ m). Tutte le analisi

sono state effettuate in citofluorimetria: il potenziale mitocondriale è stato valutato

mediante la marcatura delle cellule con la sonda mitocondriale DiOC6(3), mentre il

magnesio libero è stato determinato mediante marcatura con la sonda commerciale

MagFluo4-AM [4] e il magnesio totale mediante marcatura con la sonda non

commerciale di recente sintesi DCHQ5 [5].

Nei primi trenta minuti dopo il trattamento si è riscontrato un aumento del Δ m,

seguito da una marcata depolarizzazione nelle successive 48 ore. Il magnesio libero

118 | P O S T E R

intracellulare ha mostrato un andamento parallelo, con un incremento nella prima

mezzora, seguito da una diminuzione nelle ore successive. Il magnesio totale invece

decresceva fino dai primi minuti.

Possiamo quindi concludere che l’apoptosi indotta da MM67 è caratterizzata da una

diretta correlazione tra il ΔΨm e il magnesio libero intracellulare, in accordo con

quanto riportato in letteratura [3]. I nostri dati inoltre confermano che i due pool

cellulari di magnesio, quello libero e quello totale hanno ruoli diversi e meccanismi

indipendenti di regolazione.

Questo rappresenta uno studio preliminare perché rimane da chiarire se questi

movimenti del magnesio che seguono il trattamento con MM67 siano un

epifenomeno o se siano coinvolti nei meccanismi della cascata apoptotica

mitocondrio-mediata.

Bibliografia 1. Cappadone C, Merolle L, Marraccini C, Farruggia G, Sargenti A, Locatelli A, Morigi R, Iotti S.,

Intracellular magnesium content decreases during mitochondria-mediated apoptosis induced by a

new indole-derivative in human colon cancer cells (2012) Magnes. Res. 25(3):104-11.

2. Andreani A, Granaiola M, Locatelli A, Morigi R, Rambaldi M, Varoli L, Calonghi N, Cappadone

C, Farruggia G, Stefanelli C, Masotti L, Nguyen TL, Hamel E, Shoemaker RH, Substituted 3-(5-

imidazo[2,1-b]thiazolylmethylene)-2-indolinones and analogues: synthesis, cytotoxic activity, and

study of the mechanism of action (2012) Med Chem; 55:2078-88.

3. Kubota T, Shindo Y, Tokuno K, Komatsu H, Ogawa H, Kudo S, Kitamura Y, Suzuki K, Oka K.

Mitochondria are intracellular magnesium stores: investigation by simultaneous fluorescent

imagings in PC12 cells (2005) Bioch. et Biophys. Acta 1744 19–2 .

4. Lee S, Lee HG, Kang SH. Real-time observations of intracellular Mg2+

signaling and waves in a

single living ventricular myocyte cell (2009) Anal Chem.,812:538-42.

5. Farruggia G, Iotti S, Lombardo M, Marraccini C, Petruzziello D, Prodi L, Sgarzi M, Trombini C,

Zaccheroni N. Microwave assisted synthesis of a small library of substituted N,N'-bis((8-hydroxy-

7-quinolinyl)methyl)-1,10-diaza-18-crown-6 ethers (2010) J.Org.Chem.,75,6275-6278


Biotecnologie, via S. Donato 19/2, 40127 Bologna, tel. 0512095625, e-mail

[email protected]


P O S T E R P a g . | 119

Valutazione dell’efflusso di magnesio indotto da cAMP in cellule

HL60 mediante un nuovo chemosensore fluorescente derivato dall’8-

idrossichinolina

1Marraccini Chiara,

2Sargenti Azzurra,

2Merolle Lucia,

2Cappadone Concettina,

2,3Giovanna Farruggia,

2,3Stefano Iotti.

1Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio Emilia;


3Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi.

L’omeostasi del magnesio intracellulare è attivamente oggetto di studio, poiché è

noto l’importante ruolo che questo ione ricopre nelle funzioni cellulari. Molti studi

hanno evidenziato che stimoli metabolici o ormonali possono indurre flussi di

magnesio attraverso la membrana plasmatica in brevi intervalli di tempo. Questi

flussi sono caratterizzati da piccole variazioni del magnesio libero intracellulare ed

elevate variazioni del magnesio totale. In particolare, è stato riportato che la

stimolazione con AMP ciclico (cAMP) provoca una variazione del magnesio totale

entro 10 minuti dal trattamento in cardiomiociti, suggerendo che questo stimolo

induca un efflusso di magnesio nelle cellule eccitabili [1]. In questo studio abbiamo

voluto verificare se altri tipi di cellule manifestino un'analoga risposta al trattamento

con cAMP. A questo scopo abbiamo come modello la linea leucemica promielocitica

umana HL60, cellule non eccitabili ma altamente proliferanti. Per valutare le

variazioni del magnesio totale abbiamo utilizzato la sonda fluorescente DCHQ5,

derivato fenilico della famiglia di sonde basate su un estere azacrown coniugato con

due 8-idrossichinoline. Questa sonda ha una kd per il magnesio nell’ordine

micromolare e pertanto è adatta alla determinazione del magnesio totale

intracellulare; inoltre è molto ritenuta all’interno delle cellule e la fluorescenza

intracellulare è stabile per piu’ di 30 minuti [2].

Il magnesio intracellulare è stato valutato mediante un saggio fluorimetrico,

marcando le cellule con la sonda alla concentrazione 15 microM. Le cellule sono

state trattate con il sale butirrico del cAMP a diverse concentrazioni, comprese tra

0,6 e 2 mM, e la fluorescenza è stata seguita per 10 minuti dopo la stimolazione. In

tutti i casi si è verificata una diminuzione della fluorescenza entro i primi tre minuti

dallo stimolo, diminuzione che poi è proseguita in modo molto più moderato nei

minuti successivi. L’analisi quantitativa rivela che circa il 10% del magnesio viene

estruso, confermando che cAMP induce un efflusso di magnesio anche in questo tipo

di cellule. Abbiamo inoltre verificato, con un saggio citofluorimetrico con Propidio

Ioduro che la diminuzione della fluorescenza non è imputabile a fenomeni aspecifici

che inducono una permeabilizzazione membrana plasmatica.

Inoltre, mediante la marcatura delle cellule sonde commerciali e analisi

120 | P O S T E R

citofluorimetriche, abbiamo confermato che anche in questo modello cellulare la

stimolazione con cAMP non comporta una variazione della frazione libera ionizzata

[3] mentre induce una iperpolarizzazione del mitocondrio, come riportato in

letteratura [4].

In conclusione abbiamo dimostrato che la stimolazione con cAMP correla con

l’efflusso extracellulare di magnesio anche in cellule proliferanti. Questo fornisce

ulteriori evidenze all’ipotesi che il magnesio possa considerarsi un secondo

messaggero intracellulare. Infine queste misure hanno confermato che la DCHQ5 è

uno strumento di analisi estremamente utile per lo studio dell’omeostasi del

magnesio, e che può essere utilizzata sia per la determinazione quantitativa del

magnesio cellulare che per monitorare i flussi di questo ione.

Bibliografia

1. Romani A, Dowell E, Scarpa A. Hormonal stimulation of Mg2+ uptake in hepatocytes.

Regulation by plasma membrane and intracellular organelles (1991), J Biol Chem, 266:24376-

24384;

2. Marraccini C, Farruggia G, Lombardo M, Prodi L, Sgarzi M, Trapani V, Trombini C, Zaccheroni

N, Wolf F.I, Iotti S. Diaza-18-crown-6 hydroxyquinoline derivatives as flexible tools for the

assessment and imaging of total intracellular magnesium (2012), Chemical Science, 3, 727-734

3. Romani AM. Cellular magnesium homeostasis. (2011), Arch. Biochem. Biophys., 512:1-23.

4. Zungu IL, Hawkins Evans D, Abrahamse H. Mitochondrial responses of normal and injured

human skin fibroblasts following low level laser irradiation-an in vitro study (2009),

Photochem. Photobiol., 85(4):987-996;

5. Li FY, Chaigne-Delalande B, Kanellopoulou C, Davis JC, Matthews HF, Douek DC, Cohen JI,

Uzel G, Su HC, Lenardo MJ. Second messenger role for Mg2+ revealed by human T-cell

immunodeficiency (2011), Nature, 475(7357):471-6.



[email protected]


P O S T E R P a g . | 121

Nuove prospettive nella determinazione del magnesio intracellulare

1Sargenti Azzurra,

1Merolle Lucia ,

1Malucelli Emil,

2Andreani Giulia,

1Cappadone

Concettina, 1,4

Farruggia Giovanna, 1,4

Iotti Stefano, 3Marraccini Chiara,

4Trombini

Claudio, 4Lombardo Marco.


2Dipartimento di Scienze Mediche

Veterinarie, Università di Bologna; 3Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e

Reggio Emilia; 4

Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi, 4Dipartimento di Chimica, Università di

Bologna.

Il magnesio è essenziale per moltissimi processi biologici, ma la sua omeostasi

cellulare non è ancora stata completamente chiarita. In particolare è noto che il

magnesio libero ionizzato e quello totale sono sottoposti a meccanismi di regolazione

diversi e indipendenti tra loro: risulta quindi cruciale potere discriminare tra le due

frazioni. Mentre per il magnesio libero ionizzato sono disponibili molte sonde

fluorescenti, non esistono sonde commerciali in grado di valutare il magnesio totale.

Pertanto è di notevole interesse una nuova famiglia di sonde ottenuta coniugando ad

un etere corona due residui di 8-idrossichinolina (DCHQ) diversamente sostituita.

Queste sonde mostrano una notevole affinità e specificità per il magnesio [1]. In

particolare, la sonda capostipite (DCHQ1) ha permesso di visualizzare la

distribuzione intracellulare del magnesio in cellule vitali e di determinare, con un

saggio spettrofluorimetrico, il contenuto di magnesio in campioni cellulari. I dati

sono sovrapponibili a quelli ottenuti mediante spettrometria di assorbimento atomico

(AAS). Rispetto a questa tecnica, il dosaggio effettuato mediante questa sonda

presenta l’indubbio vantaggio di richiedere campioni molto più ridotti (di almeno

dieci volte), e l'utilizzo di strumentazioni di più larga diffusione e con minori

problematiche riguardanti la sicurezza [2].

Tuttavia, la sonda DCHQ1 ha mostrato alcune limitazioni di utilizzo, come una bassa

ritenzione intracellulare e un parziale "fotobleaching". Inoltre è eccitabile solo

nell’UV, limitandone l'uso in citofluorimetria o in microscopia confocale.

Un nuovo derivato fenilico, DCHQ5, mostra invece caratteristiche molto più

interssanti: è altamente ritenuta nelle cellule, il complesso con il magnesio è

altamente fluorescente, è molto stabile e può essere eccitato anche nel visibile [3].

Lo scopo di questo lavoro è quindi stato quello di valutare l’applicabilità della

DCHQ5 alla determinazione del magnesio totale intracellulare attraverso saggi

citofluorimetrici e spettrofluorimetrici.

Il modello cellulare utilizzato sono cellule leucemiche umane HL60, una leucemia

promielocitica che può essere indotta a differenziare con dimetilsolfossido (DMSO).

Questo trattamento induce già dopo 3 giorni il blocco proliferativo delle cellule in

fase G0/G1 e parallelamente il dimezzamento del magnesio totale, che passa da una

media di 25 nmoli/106 cell a circa 12 nmoli/10

6 cell [2].

122 | P O S T E R

L’analisi citofluorimetrica effettuata utilizzando la sonda DCHQ5 sia eccitando

nell’UV che nel visibile evidenzia che l’intensità di fluorescenza nelle cellule

differenziate è circa dimezzata rispetto alle cellule proliferanti, come mostrato nella

tabella I che riporta i dati di un tipico esperimento.

Dato che l’analisi citofluorimetrica fornisce solo un dato semiquantitativo, abbiamo

valutato la capacita' analitica di questa sonda ad un classico saggio di tipo

fluorimetrico, utilizzando campioni di cellule lisate per sonicazione. I risultati

ottenuti hanno mostrato un’ottima sovrapponibilità con i quelli ottenuti sugli stessi

campioni in AAS, come riportato nella tabella II.

Possiamo quindi concludere che la sonda DCHQ5 risulta un ottimo chemosensore

per la determinazione sia quantitativa che qualitativa del magnesio intracellulare,

ampliando l'applicabilità di questa famiglia di sonde a sistemi biologici.

Bibliografia 1] Farruggia G., Iotti S., Prodi L., Montalti M., Zaccheroni N., Savage P.B., Trapani V., Sale P., Wolf

F.I. 8-hydroxyquinoline derivatives as fluorescent sensors for magnesium in living cells. Journal of

the American Chemical Society 128, 344-50, 2006

2] Farruggia G., Iotti S., Prodi L., Zaccheroni N., Montalti M., Savage P., Andreani G., Trapani V.,

Wolf F.I., Hydroxyquinoline derivatives as Fluorescent Probes to Measure Intracellular Magnesium:

Insight into Characteristics and Biological Applications, Journal of Fluorescence, 19, 11–19, 2009

3] Marraccini C., Farruggia G., Lombardo M., Prodi L., Sgarzi M., Trapani V., Trombini C.,

Zaccheroni N., Wolf F.I., Iotti S. Diaza-18-crown-6 hydroxyquinoline derivatives as flexible tools for

the assessment and imaging of total intracellular magnesium. Chemical Science, 3, 727-734, 2012

Tab. II Quantificazione del magnesio intracellulare in diversi

campioni di cellule, utilizzando il saggio fluorimetrico con la sonda

DCHQ5 e la determinazione mediante AAS

Campione DCHQ5

Mg (nmol/106 cells)

AAS

Mg (nmol/106 cells)

HL60 121p 19,75 ± 0,76 22,78 ± 0,38

HL60 124p 22,93 ± 1,30 20,70 ± 0,61

HL60 128p 23,77 ± 1,14 24,70 ± 0,89

HT29 67p 24,31 ± 1,13 23,94 ± 0,89

HT29 69p 23,96 ± 0,37 21,17 ± 0,71



[email protected]

Tab.I. Canale medio della distribuzione di fluorescenza di cellule

marcate con DCHQ5 5 µM

Eccitazione 360 nm Eccitazione 488 nm

HL60 proliferanti 94 83

HL60 differenziate 45 43

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=16390164&query_hl=1&itool=pubmed_docsum

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=16390164&query_hl=1&itool=pubmed_docsum


P O S T E R P a g . | 123

La carenza di magnesio inibisce la progressione del ciclo cellulare in

cellule di osteosarcoma umano

1Cappadone Concettina,

1,2Farruggia Giovanna,

1Merolle Lucia,

3Marraccini

Chiara , 1Sargenti Azzurra,

1,2Malucelli Emil,

1,2Iotti Stefano


2 Istituto Nazionale di Biostrutture e Biosistemi;

3 Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio;

Vi sono molte evidenze che suggeriscono una correlazione tra la disponibilità di

magnesio e la proliferazione cellulare e, in particolare, è stato ampiamente

dimostrato che la carenza di questo ione inibisce la proliferazione in molte linee

cellulari di diversa origine, normali e trasformate [1]. Tuttavia, i meccanismi

molecolari che sottendono a questo fenomeno non sono ancora stati ben chiariti. In

questo lavoro abbiamo quindi studiato l’effetto della carenza di magnesio sulla

proliferazione e sull’espressione di alcune proteine coinvolte nella progressione del

ciclo cellulare in cellule di osteosarcoma umano SaOs-2 e U2OS.

Le cellule sono coltivate per 24 ore in terreno privo di magnesio e contenente lo

0,5% di siero fetale bovino (FBS) deprivato dello ione. Questo trattamento ha

sincronizzato le cellule nella fase G0/G1 e ha ridotto il contenuto di magnesio

intracellulare. Le cellule sono state quindi coltivate in terreno contenente il 5% di

FBS e in presenza o in assenza di MgCl2 1 mM per 24 ore. Sebbene sia riportato che

le cellule tumorali sono meno sensibili alla deprivazione di magnesio [2], la presenza

dello ione nel terreno di coltura ha incrementato notevolmente la proliferazione delle

cellule di osteosarcoma rispetto alle cellule deprivate. L’analisi del ciclo cellulare

mediante citofluorimetria a flusso, indica che le cellule deprivate sono bloccate in

G0/G1 anche dopo l’aggiunta di FCS, mentre nelle cellule coltivate in terreno

completo di magnesio si osserva un netto aumento delle cellule in fase S e in fase

G2/M.

A livello della transizione G1/S le attività delle chinasi ciclino-dipendenti sono

regolate positivamente dal legame con le loro cicline e negativamente dagli inibitori

CKI. Abbiamo quindi investigato l'espressione della proteina p21 e del suo attivatore

trascrizionale p53.

Dopo l'aggiunta di siero, le cellule coltivate in assenza di magnesio presentano un

netto calo del contenuto di questo ione, mentre non presentano variazioni

significative di p21 e p53 rispetto alle cellule in terreno contenente MgCl2. Alla luce

dei risultati ottenuti, si può concludere che l'arresto proliferativo dipende dalla

riduzione del contenuto di magnesio, ma è p53 indipendente. Studi futuri saranno

indirizzati a chiarire i meccanismi e i bersagli molecolari responsabili di questo

blocco.

124 | P O S T E R

Bibiliografia

1. Ikari A, Sawada H, Sanada A, Tonegawa C, Yamazaki Y, Sugatani J. Magnesium deficiency

suppresses cell cycle progression mediated by increase in transcriptional activity of p21(Cip1)

and p27(Kip1) in renal epithelial NRK-52E cells. J. Cell. Biochem. 2011 :112(12):3563-72

2. Wolf F., Trapani V. Cell (patho)physiology of magnesium. Clin. Sci. 2008: 114(1):27-35


Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, tel 051 2095626, e mail

[email protected]


P O S T E R P a g . | 125

Cadmium contamination and sense of smell in Danio rerio

Motta C.M., Miccoli G., Simoniello P.*, Panzuto R.

Department of Biological Sciences, University of Naples Federico II, Naples, Italy

* GSI Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung, Darmstadt, Germany

Olfactory lamellae, due to their position, are an easy target for several

environmental toxicants including heavy metals. Injury at this level may constitute a

serious threaten to the animal survival since may impair the search for food and the

escape from predators.

In this study, we evaluated the impact of an acute cadmium treatment on the

olfactory response in adult Danio rerio. Animals were contaminated whit 50μM

CdCl2 for 72 hours or, alternatively, contaminated for 72 hours and allowed to

recover for 7 days in uncontaminated water. At the end of treatments the effects on

behavioral responses were studied by exposing the animals to an odor discrimination

tests, in a labyrinth thank. Morphological analyses of the lamellae were also carried

out by conventional light microscopy techniques.

Behavioral tests demonstrated that Cd treatment causes a partial anosmia,

accompanied by an apparent loss in learning and memory abilities. In the olfactory

lamellae marked alterations are induced together with apoptosis. These effects,

however, are temporary: a short period in non-contaminated water is sufficient to

restore almost completely all the olfactory abilities and lamellar morphology.

126 | P O S T E R

I N D I C E A N A L I T I C O | 127

A

Abbruzzetti Stefania ............................... 65; 69

Aiello Stefania ............................ 55; 75; 77; 82

Alinovi Rossella ................................. 104; 107

Anagnostou Paolo ........................................ 51

Andreani Giulia .......................................... 121

Antolini R. .................................................... 85

Asaro Anna .................................................. 82

Atzeri Angela ......................................... 70; 86

B

Banda Iris ................................................... 101

Baraldi Andrea ............................................. 43

Baroni Fabio ................................................. 60

Baruffi Silvana ....................................... 35; 38

Bergamonti L. .............................................. 93

Bianchini Paolo ............................................ 65

Bisceglie Franco ......................................... 104

Boano Rosa ............................................ 43; 96

Boattini Alessio ............................................ 49

Bocchi Leonardo .......................................... 90

Bonafé Francesca ......................................... 90

Bridelli Maria Grazia ................................... 43

Bruni L. ...................................................... 113

Buschini Annamaria ................................... 104

C

Cabboi Barbara............................................. 86

Cacciani Francesca ................................. 29; 32

Caldarera Claudio Marcello ......................... 90

Callegari Sergio ...................................... 35; 38

Capocasa Marco ........................................... 51

Cappadone Concettina115; 117; 119; 121; 123

Caramell Davidi ........................................... 50

Carbognani Paolo ....................................... 101

Carletti E. ..................................................... 85

Carnevali Luca ....................................... 35; 38

Carnevali Oliana................................. 109; 111

Casalini Angelo .......................................... 101

Cataldo Angelo............................................. 77

Cavalli Stefano ............................................. 90

Cavazzini Davide ......................................... 60

Cedola Alessia ............................................ 115

Cella Zanacchi Francesca ............................ 65

Cerasola Dario ............................................. 77

Cocchi Massimo .......................................... 19

Colanari Alessia......................................... 117

Congiu Alessandra....................................... 51

Corradi Domenico ................................. 35; 38

Corradi Massimo ....................................... 101

Croci S. ...................................................... 113

D

Dallatana Davide ....................................... 107

De Donatis Mauro ....................................... 67

De Iasio Sergio ............................................ 96

Deiana Monica............................................. 86

Dessì M. Assunta ................................... 70; 86

Destro Bisol Giovanni ................................. 51

Di Majo Danila ................................ 77; 80; 82

Diaspro Alberto ........................................... 65

F

Fagiano Marcello ......................................... 96

Faillace Giudo ............................................. 82

Farruggia Giovanna ... 115; 117; 119; 121; 123

Fiumana Emanuela ...................................... 90

Fogassi Leonardo......................................... 13

Foss C. ......................................................... 85

Franzoni Lorella .......................................... 60

Frati Caterina ............................................... 90

Fratini Michela .......................................... 115

G

Gabrielli Fabio ............................................. 19

Gallone Salvatore ........................................ 22

Gambetta Eugenia ..................................... 109

Gärtner Wolfgang ...................... 57; 65; 69; 99

Giacco Elisabetta ......................................... 62

Giammanco Giulia ....................................... 80

Giammanco Marco .............. 55; 75; 77; 80; 82

Gianoncelli Alessandra .............................. 115

Gioacchini Giorgia .................................... 111

Girotti Marilena ........................................... 96

Goldoni Matteo .................................. 101; 107

Gorelik Julia ................................................ 58

Graffi Giuseppe ........................................... 22

128 | I N D I C E A N A L I T I C O

Graziano G ................................................... 25

Gualerzi Massimo ........................................ 23

Guarnieri Carlo ............................................ 90

H

Haase A. ....................................................... 85

Harauz George ............................................. 67

I

Incani Alessandra ......................................... 86

Iotti Stefano ................ 115; 117; 119; 121; 123

K

Karam Jean-Pierre ........................................ 90

L

La Guardia Maurizio .............................. 80; 82

Lab Max J. ................................................... 58

Lagomarsino Stefano ................................. 115

Levati Giulia ................................................ 96

Lombardo Marco................................ 115; 121

Loru Debora ................................................. 86

Losi Aba ..................................... 57; 65; 69; 99

Lottici P.P. ................................................... 93

Lücke Christian ............................................ 60

Luiselli Donata ............................................. 49

M

Macchi Emilio ........................................ 35; 38

Maida Carmelo Massimo ............................. 55

Malucelli Emil ........................... 115; 121; 123

Mandalari Carmen............................ 65; 69; 99

Mandich Alberta ................................ 109; 111

Maradonna Francesca ................................ 109

Mariottini Gian Luigi ................................... 62

Marraccini Chiara ...... 115; 117; 119; 121; 123

Melis M. Paola ............................................. 86

Melis Massimiliano ...................................... 86

Merolle Lucia ............. 115; 117; 119; 121; 123

Miccoli G. .................................................. 125

Migliaresi C. ................................................ 85

Milani Chantal ............................................. 46

Milani Rolando ............................................. 46

Milia Nicola.................................................. 51

Milici M........................................................ 55

Mineo Valerio .............................................. 75

Minerva F ..................................................... 25

Miragoli Michele ............................. 35; 38; 58

Montero-Menei Claudia ............................... 90

Montinaro Francesco .................................... 51

Morselli Paolo Giovanni .............................. 90

Moschetta A ................................................. 25

Motta A. ....................................................... 85

Motta Chiara ............................................... 125

Mozzoni Paola ....................................101; 107

Muscari Claudio ........................................... 90

Mussi Francesca ......................................... 104

Musso Ezio ...................................... 35; 38; 90

Mutti Antonio .....................................101; 107

N

Notargiacomo Andrea ................................ 115

Nozzi Valentina .......................................... 109

P

Palasciano G ................................................. 25

Palmieri VO.................................................. 25

Panattoni Gian Luigi .................................... 46

Pane Luigi .................................................... 62

Panzuto R. .................................................. 125

Parakhonskiy B. ........................................... 85

Pedrini B. ...................................................... 95

Pedrini L. ...................................................... 95

Pelosi Giorgio ............................................. 104

Perotti Alessio ............................................ 107

Pettener Davide ............................................ 49

Pinelli Silvana ....................................104; 107

Piras Alessandra ........................................... 70

Planeta Diego ........................................ 55; 75

Polverini Eugenia ......................................... 67

Pontrelli D .................................................... 25

Porcedda Silvia ............................................. 70

Predieri G. .................................................... 93

Q

Quaini Federico ............................................ 90

I N D I C E A N A L I T I C O | 129

R

Rabino Massa Emma .............................. 22; 95

Raffelberg Sarah..................................... 65; 69

Randazzo Walter .......................................... 75

Rescigno Antonio ......................................... 70

Rinaldi Marianna .......................................... 22

Roncoli Gabriele ........................................ 111

Rosa Antonella ....................................... 70; 86

Rosangela Cinquetti ..................................... 43

Rossi Gian Luigi .......................................... 60

Rossi Stefano .................................... 35; 38; 58

Rusca Michele ............................................ 101

Russo Giuseppe ............................................ 77

S

Sacco C ........................................................ 25

Sanna Emanuele ........................................... 51

Santovito D .................................................. 25

Sargenti Azzurra......... 115; 117; 119; 121; 123

Sarno Stefania .............................................. 49

Savi Monia ................................................... 90

Scano Paola .................................................. 70

Scorolli Annalisa ........................................ 111

Sgoifo Andrea ........................................ 35; 38

Simoniello P. ............................................. 125

Spinnato Gianpaolo ..................................... 82

Stani Mariachiara......................................... 43

Stilli Donatella ............................................. 90

T

Tarasconi Pieralberto ................................. 104

Traina Marcello ........................................... 77

Traversi Ilaria .................................... 109; 111

Trombini Claudio .............................. 115; 121

Trombini Mimosa ........................................ 38

V

Venturella Fabio .................................... 55; 82

Viappiani Cristiano ................................ 65; 69

Z

Zaniboni Massimiliano .......................... 29; 32

Zucca Paolo ................................................. 70

LA BIOLOGIA SPERIMENTALE: DALLE MOLECOLE … · M. G. Bridelli - Università degli studi di Parma...

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