L’ ‘epigenetica’ si riferisce a tutti i cambiamenti dell’espressione genica e dell’organizzazione della cromatina che sono indipendenti dalla sequenza del DNA.

Epigenetics

-DNA methylation (5-mC, 5-hmC) -Histone PTMs (>100)

Metilazione del DNA• Nei vertebrati la metilazione interessa

solamente la Citosina: l’enzima citosina metiltransferasi aggiunge un gruppo metile al C5 della citosina5-metilcitosina.

• mCpG (NEI VERTEBRATI NON IN DROSOPHILA)

• Non interferisce con il giusto appaiamento delle basi del dna

• Espressione genica,trasmissione di profili di espressione alle cellule figlie, sistema di difesa contro trasposoni

• Solo 3% delle C e’ metilata (CpG)• 5meC e’ instabile e viene

deaminata Timina• Durante evoluzione il numero di

dinucleotidi CpG nei vertebrati diminuisce CpG-TpG o CpA (escluse le CpGi)

• Cromatina in conformazione condensata (seq.ripetute)

METODI PER LO STUDIO DELLE REGIONI metilate

1_Selezione DNA metilato MeDIP (ab anti 5meC)MCIp (MBD)MIRA (MBD+ his+colonna)

METODI PER LO STUDIO DELLE REGIONI CpG

1_Analisi del DNA selezionato PCRMicroarray (CpG island)Sequencing

CpG ISLAND•CpGisland sono state identificate tramite digestione del DNA di topo con HPAII(CCGG)•Tratti di DNA ipometilato con frequenza di CG di oltre il 50% (frequenza attesa del dinucletide)•Marcatori genici regioni trascrizionalmente attivestato permissivo della cromatina•Cromatina in conformazione aperta•Localizzate su Sito di Inizio della Trascrizione ma non solo

CpG islands e Regolazione della Trascrizione•Metilazione del Dna correla con silenziamento (GATA2 tessuto specifico)•Stati trascizionali di molti geni non correlano con lo stato di metilazione dei singoli promotori•TSS alternativi•CpG island collocate dove ha origine un non-coding RNA•CpGi intergeniche se metilate influiscono sull’espressione di interi locus (CTCF)

Effetto complesso della Metilazione delle CpG islands

DNA Metiltransferasi (writers) e Fasi di metilazione • Metilazione differenziale de novo (Dnmt3a e Dnmt3b); • Demetilazione passiva (natura sconosciuta);

• Mantenimento della metilazione e trasmissione alle cellule figlie (Dnmt1) dopo replicazione del DNA.

• Esiste un ulteriore DNA metilasi DNMT2 ma metila tRNA.

Metilazione nello sviluppo dei mammiferi

Demetilazione passiva

Cancellazione dello stato epigenetico

Rimetilazione e determinazione dell’imprinting

Rimetilazione durante il differenziamentoDemetilazione

pssiva

Demetilazioneenzimatica

Riprogrammazione epigenetica durante la gametogenesi

Genomic imprinting differenza nelle modificazioni del genoma dei gametiAlcuni geni ereditano l’imprinting (metilazione) dal genoma paterno e altri da quello maternoImprinting viene mantenuto fino alle cellule somatiche e perso nelle cellule germinali primordiali

Esperimenti di knock-out

Esperimenti di knock-out

Istoni acetilati

Metilazione del DNA nell’embrione durante stadi precoci•DEMETILAZIONE nell’EMBRIONE (methylated sites un-methylated sites)•La trascrizione persiste e viene rimetilata la zona extra CpG island e poi il Gene viene silenziato con meccanismi non methyl –dipendentiPOTENZIALE TRASCRIZIONE ATTIVA•Oppure la trascrizione viene bloccata con altri meccanismi e questo stato richiama metilazione de novo sia della CpG island che delle sequenze fiancheggiantiPOTENZIALE SILENZIAMENTO

Methyl Binding Protein (MBD)•Riconoscono e legano le 5meCpG•Reclutano altre proteine coinvolte nella repressione come HDAC(Histone Deacetylase)

Perdita di funzione di MECP2 causa Sindrome di Rett (si trova sull’X)Nelle femmine si ha la Sindrome se negli X inattivati c’e’ al copia sana del gene (importante soprattutto nei neuroni), nel maschio e’ letale

METILAZIONE E SILENZIAMENTO GENICO

TFs e Proteine Regolatrici proteggono il promotore dalla metilazione

TFs e Proteine Regolatrici non sono piu’ legate per un meccanismo specifico (gene OFF but LEAKY)

Metilazione delle CpG e reclutamento delle MBP che richiamano altri complessi di rimodellamento della cromatina e Istone Deacetilasi (gene COMPLETELY OFF)

METILAZIONE E SILENZIAMENTO GENICO

reversibili

Irreversibili(ETEROCROMATINA)

Metilazione del DNA e Repressione trascrizionale

A_TFs non riescono a legare le CpG se metilate (CTCF si lega al DNA e isola azione di attivazione di Enhancer metilazione DNA impedisce legame di CTCF )B_MBD protein: MBD1, MBD2, MBD3, and MeCP2 and KAISO che possono riconoscere 5meCpG e richiamare altre proteine (silenziamento)

Ipometilazione delle CpGisland durante de novo metilazione3 IPOTESI

CpGi refrattarie a de novo metilation (DNMT) a causa della loro sequenza

CpGi sono target di un meccanismo di demetilazione del DNA che rimuove specificamente la 5meC

I TFs legati alle CpGi precludono il legame alle DNMT (esperimento con mutazione del sito di SP1 in APRT promoterde novo METHYLATION)

Fig. 2. Epigenetic states and transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells. (A) Methylation state (blue gradient) relative to CpG density (red bar). (B) DNA methylation and state of H3K4m3/H3K27m3 “bivalency” in undifferentiated mouse ES cells. The figure was composed from data reported in PcG refers to the polycomb group repressor complex (PRC) 2, which methylates H3K27 through activity of the histone methyltransferase E

STATI EPIGENETICI NELLE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI MURINE

ACUTE MYELOID LEUKEMIAHELP for AML: Methylation Profiling Opens New Avenues

There is growing evidence that aberrant gene expression in cancer is linked to epigenetic deregulation like promoter cytosine methylation in CpG-islands. In this issue of Cancer Cell, Figueroa et al. show that genome-wide promoter DNA methylation profiling reveals unique AML subgroups and methylation patterns that are associated with clinical outcome.

The importance of aberrant promoter cytosine methylation in CpG islands and the resulting gene silencing has been shown to be involved in cancer development (oncosoppressor genes).Genome-wide promoter DNA methylation profiling to a large cohort of 344 newly diagnosed primary AML samples using the recently developed HELP (HpaII tiny fragment enrichment by ligation-mediated PCR) assay

Figure 1. A Decade of ‘‘-omics’’ Research in AMLAt the beginning of this decade, microarray-based gene expression profiling studies began providing new insight into leukemia pathogenesis. Since then, novel SNP microarray and sequencing-based genomics studies have unraveled novel findings, and now, genome-wide epigenomics promises to provide a deeper understanding of leukemia. Proteomics approaches are currently also under development. Future efforts will aim toward integrated data analyses, thereby leading to a more comprehensive view of the biology of this disease, a prerequisite for refined AML classification and improved patient management

Pathways Representative hypermethylated genes

DNA repair hMLH1, MGMT, WRN, BRCA1

Hormone response Estrogen, progesterone, androgen, prolactin and thyroid-stimulating hormone receptors

Vitamin response RARB2, CRBP1,

Ras signaling RASSFIA, NOREIA

Cell cycle p16INK4a, p15INK4b, Rb

P53 network p14ARF, p73, HIC-1

Cell adherence and invasion

E-cadherin, H-cadherin, FAT cadherin, EXT-1, SLIT2, EMP3

Apoptosis TMS1, DAPK1, WIF-1, SFRP1

Wnt signaling APC, DKK-1, IGFBP-3

Tyrosine kinase cascades SOCS-1, SOCS-3, SYK

Transcription factors GATA-4, GATA-5, ID4

Homeobox genes PAX6, HOXA9

Other pathways GSTP1, LKB1/STK11, THBS-14, COX-2, SRBC, RIZ1, TPEF/HPP1, SLC5A8, Lamin A/C

microRNAs miR-127 (targeting BCL6), miR-124a (targeting

Hypermethylated genes in different cancers

• Metilazione della Citosina, solitamente CpG, deaminazione non riconosciuta dal apparato di riparazione del DNA, funzione.

• Esperimenti per lo studio della Metilazione MeDip, MCIp, MIRA• Analisi del DNA PCR, Microarray (probe che rappresentano CpG island), sequencing• CpG regioni con alta densita’ GC ipometilate solitamente nei promotori dei geni ma non solo,

al’interno dei geni o in regioni intergeniche.• Geni hanno diversi promotori alternativi e cpg island possono essere diverse ed eessere in

stati di metilazione diversa, cpg island in regioni dove viene trascritto un ncrna oppure in regioni lontane dai geni ma che regolano l’espressione delll’intero locus.

• DNA metiltransferasi: Metilazione de novo, Mantenimento delle metilazione, Demetilazione passiva.

• Stadi di Metilazione nello sviluppo dei mammiferi• Dna metil transferasi importanti nello sviluppo dell ovocita e dello spermatozoo(insieme a

metilatori e deacetilatori degli istoni)• Meccanismi di metilazione dopo la demetilazione embrionicadue stati di metilazione

ereditabili dalle cellule figlie• Methyl Binding Protein:riconoscono il DNA metilato (dominio conservato che riconosce dna

metilato al di fuori di MBD3); • Metilazione=condensamento della cromatinasilenziamento• Diversi stati della cromatina: reversibili (solo alcune modificazioni istoniche),

irreversibile(metilazione del DNA e modificazione istoniche)

• Meccanismi di repressione trascrizionale dopo dalla Metilazione del dna (TF non legano piu’ il dna, proteine che riconoscono la metilazione reclutano altre proteine che deacetilano istoni e condensano ulteriormente cromatina)

• Come le CpG island rimangono ipometilate durante la metilazione De novo : 3 ipotesi

• Grado di nelle cellule embrionali staminali: maggiore metilazioni in Promotori di Geni con basso contenuto CpG. In base al tipo di gene (espressione) il panorama della metilazione e’ diverso e si associa ad altre modificazioni istoniche

• Esempio della Leucemia Mieloide Acuta: metilazioni anomale nelle Regioni regolative dei geni oncosoppressoritumore