ISO-TR 13843 Ultimo

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    RAPPORTO TECNICO ISO/TR13843

    Prima edizione2000-06-01

    Qualit dell'acqua - Guida per la validazionedei metodi microbiologici

    Qualit de leau Lignes directrices pour la validation des mthodesmicrobiologique

    Numero di riferimentoISO/TR 13843:2000(E)

    ISO 2000

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    ISO/TR 13843:2000(E)

    ICS 07.100.20Prezzo definito da xxx pagine

    ISO 2000 Tutti i diritti sono riservatiRinunce PDF

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    ISO 2000

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    ISO2000 Diritti riservati

    Indice

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    http://www.iso.ch/http://www.iso.ch/

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    Introduzione IV

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    1 Obiettivo2 Glossario3 Struttura del documento4 Principi di base4.1 Generalit

    4.2 Validazione4.3 Rivelatori4.4 Prestazioni caratteristiche4.5 Specifiche5 Limitazioni ed aspetti caratteristici dei metodi5.1 Riscontro dellanalita5.2 Variabilit del campione5.3 Distribuzione delle particelle e sovradispersione5.4 Interazioni nel rilevatore5.5 Insensibilit

    5.6 Errori spuri5.7 Carte di controllo e di indirizzo6 Modelli matematici di variazioni6.1 Variazioni di base non modificabili6.2 Sovradispersione - Modello binomiale negativo6.3 Limiti statistici e pratici6.4 Prove generali di randomizzazione Rilievo della

    sovradispersione7 Specifiche Pratica corrente8 Specifiche Raccomandazioni

    9 Determinazione ed espressivit delle caratteristiche delleprestazioni9.1 Generalit9.2 Caratteristiche delle prestazioni relative alla specificit e

    selettivit9.3 Limiti operativi9.4 Intervallo operativo con procedure MPN9.5 Precisione10 Procedure e fasi della validazione10.1 Generalit10.2 Validazione primaria10.3 Validazione secondaria11 Modalit per la definizione delle specifiche11.1 Modello generale per le specifiche quantitative basilari11.2 Precisione dellintera procedura analitica11.3 Caratteristiche di categoria11.4 Risultati non programmatiAllegato A Procedure statistiche e programmi computerizzatiAllegato B Esempi numericiAllegato C Esempio di una validazione sperimentaleBibliografia

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    Introduzione

    Iso (the International Organization for Standardization) a federazione a

    carattere mondiale di organismi nazionali per la standardizzazione (ISOmember bodies). Il lavoro per la preparazione degli Standard Internazionali condotto da comitati tecnici ISO. Ciascun membro dellorganismo interessato inuna attivit per la quale un comitato tecnico stato predisposto ha il diritto diessere rappresentato nellambito del comitato. Organizzazioni internazionali,governative e non, in collegamento con lISO, prendono anchesse parte ailavori. Listituzione ISO collabora strettamente con la InternationalElectrotechnical Commission (IEC) per quanto concerne la standardizzazione ditipo elettrotecnico.

    Gli Standard internazionali sono approntati in accordo alle indicazioni fornite

    nelle direttive ISO/IEC, Parte 3.

    Il principale compito dei comitati tecnici quello di preparare gli StandardInternazionali. Le prime stesure degli Standard Internazionali proposti daicomitati tecnici sono trasmessi ai membri associati per essere sottoposti adapprovazione. Laccettazione come Standard Internazionale richiedelapprovazione da parte di almenoil 75%dei componentiaventi diritto di voto.

    In circostanze eccezionali, nel caso in cui un comitato tecnico abbia raccoltoinformazioni su aspetti di tipo differente fra quelli che sono normalmentepubblicati come Standard Internazionali (per esempio, stato dellarte), si pudecidere con una semplice maggioranza dei membri partecipanti la possibilitdi pubblicare un Rapporto Tecnico. Un rapporto Tecnico ha di per s unsignificato esclusivamente informativo e non deve essere revisionato fino aquando i risultati prodotti possono essere ritenuti validi o utili.

    Si deve porre attenzione perch alcune parti di questo Rapporto Tecnicopossono essere assoggettate a diritti riservati. Lorganizzazione ISO non siritiene responsabile di segnalare alcuno di questi diritti riservati.

    ISO/TR 13843 stato approntato dal Comitato Tecnico ISO/TC 147, Water

    quality, Sottocomitato SC 4, Microbiological methods

    Qualit dellacqua -- Guida alla validazione deimetodi microbiologici

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    1 Obiettivo

    Questo Rapporto Tecnico interessa la validazione dei metodi microbiologici,con particolare attenzione ai metodi quantitativi di tipo selettivo tramite i qualile valutazioni quantitative si determinano con il conteggio delle particelle con

    metodi diretti quali la microscopia o indiretti, che si avvalgono della crescita(moltiplicazione) batterica con formazione di colonie o con lo sviluppo ditorbidit

    I principi e le procedure che soddisfano questo obiettivo si avvalgano dellavalutazione della presenza/assenza (P/A), del numero pi probabile (MostProbable Number MPN), del conteggio delle colonie e del conteggio diretto(microscopico)

    Questo Rapporto Tecnico non applicabile alla validazione dei cos dettimetodi rapidi o di recente acquisizione che si avvalgono della misurazione diprodotti o cambiamenti correlati all'attivit microbica e non sul riscontro dellesingole particelle.

    2 Glossario

    Nella descrizione del Rapporto Tecnico saranno utilizzate le seguenti definizionie termini scientifici.

    2.1accuratezza della determinazione

    approssimazione alla concordanza fra il risultato di una prova ed un valore diriferimento riconosciuto

    NOTA Quando la definizione di accuratezza riferita ad un insieme di risultati dirilevamento o di risultati di prova, essa coinvolge una combinazione occasionale di componentied un comune errore sistematico o una predisposizione a questa condizione.

    [ISO 3534-1:1993, 3.11]

    2.2analita

    oggetto assoggettato a misurazioneparticolare quantit soggetta a determinazione

    NOTA 1 Consultare il riferimento bibliografico [5].

    NOTA 2 In microbiologia lanalita teoricamente definito come linsieme delle specieriportate nella classificazione tassonomica. Nella pratica, in molti casi, lanalit pu esseresolamente definito come riferibile ad un gruppo, modo certamente meno accurato rispetto alladefinizione tassonomica.

    2.3

    porzione di analitaporzione di prova

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    volume della sospensione di particelle inoculata in una unit di rilevazione

    NOTA Una piastra di agar, una provetta, la griglia a maglie quadrate del microscopiorappresentano diversi esempi di unit di rilevazione.

    2.4intervallo di applicazioneintervallo riferito alla concentrazione di particelle routinariamentedeterminabile con un determinato metodo

    2.5caratteristica di categoriacaratteristica prestazione di un metodo espressa numericamente comefrequenza relativa basata sulla classificazione di tipo P/A o +/-

    2.6

    CFU, non consigliabileunit formante colonia, non consigliabileCFP, non consigliabileparticella formante colonia, non consigliabileNOTA Termine introdotto originariamente per soddisfare il convincimento che unacolonia possa originare non esclusivamente da una singola cellula ma anche da una catenaformata o da aggregati di cellule, insiemi di spore, parti del micelio ecc. Questo concettoerroneamente ha attribuito il numero delle colonie osservate al numero di entit viventiseminate sul terreno. Unit di crescita, particella vitale, propagulo (2.27) e germe (2.13) sonotermini con significati simili ma si attengono allidea originale in modo migliore e sono

    estendibili non solo ai metodi basati sul conteggio delle colonie ma anche ai metodi MPN e P/A

    2.7coefficiente di variazioneCVdeviazione standard relativaper caratteristica non negativa, definita dal rapporto fra la deviazione standarde la media

    NOTA 1 Il rapporto pu essere espresso come percentuale

    NOTA 2 Talvolta utilizzata la definizione deviazione standard relativa (RDS) inalternativa al coefficiente di variazione, ma lutilizzo di questa definizione non consigliato

    [ISO 3534-1:1993, 2.35]

    NOTA 3 In questo Rapporto Tecnico utilizzato il termine coefficiente di variazione (CV)quando la deviazione standard relativa espressa in valore percentuale (CV %= 100 RDS)

    2.8prova collaborativa

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    prova metodologica o prova di laboratorio a cui collaborano diversi laboratori inuna sperimentazione pianificata e coordinata da un laboratorio guida

    NOTA Le prove di tipo collaborativo appartengono principalmente a due tipi. Sieseguono prove di intercalibrazione per consentire ai laboratori di comparare i loro risultati di

    prova con quelli degli altri laboratori partecipanti.

    Le prove per la valutazione di un metodo consentono riscontri di precisione (ripetibilit,riproducibilit) derivanti dai dati emersi quando diversi laboratori partecipanti saggianocampioni identici con un metodo altamente standardizzato.

    2.9conteggio delle colonie confermato (validato)

    x

    conteggio di colonie presuntivo corretto dai falsi positivi

    k

    x = pc = --- cn

    dove

    c valore del conteggio presuntivo

    p valore della quota reale positiva

    n numero di presunti positivi isolati per conferma

    k numero degli isolati confermati

    2.10carta di controllodiagramma bidimensionale per il controllo continuo delle prestazioni di unmetodo utilizzando i risultati ottenuti da studi di Tipo A

    NOTA Nelle carte di controllo lasse delle ascisse di solito riferito ad una scala di tipotemporale ed il controllo della variabile espresso dalla media di alcune determinazioni diprecisione (s, CV, RSD).

    2.11

    rilevatorerilevatore di particellepiastra di matrice solida o provetta di liquido nutrienti per il conteggio od ilrilievo di particelle microbiche vitali

    2.12sistema di rilevamentosistema di rivelazionecombinazione di piastre o provette a cui si ricorre per la valutazione dellaconcentrazione microbica di tipo quantitativo

    NOTA Il sistema di rilevamento rappresentato dallinsieme di piastre o di provetteutilizzate per la definizione numerica di un valore singolo

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    ESEMPIO Piastre parallele per una stessa sospensione, piastre per diluizioni progressive,sistema MPN a 3 x 5 provette, micropiastra

    2.13germe

    entit vitale capace di sviluppare crescita in un terreno nutriente

    cf. propagulo (2.27)

    2.14carta di orientamentorappresentazione bidimensionale per la rappresentazione dei dati delleprestazioni di un metodo (quantit o precisione) con valori arbitrari diriferimento o valori di riferimento ottenuti secondo la procedura di Tipo B

    NOTA Nelle carte di riferimento lascissa rappresenta il conteggio di colonie ottenuto

    con un rilevatore

    2.15distribuzione eterogenea di Poissondistribuzione che emerge quando la media della distribuzione di Poisson varia acaso di volta in volta

    NOTA 1 Consultare la bibliografia [11].

    NOTA 2 Consultare anche la distribuzione binomiale (2.19).

    2.16limite di rilevamentonumero di particelle x(per parte analitica) ove la probabilit po di un risultato

    negativo uguale al 5%

    NOTA 1 Probabilit di un risultato positivop(+) = 1 -po

    NOTA 2 a) Calcolo dixcon la distribuzione di Poisson

    1 1x= ln ----- = ln -------- = ln (20) = 3,00

    po 0,05

    b) calcolo di xcon la distribuzione binomiale negativa

    u2 u2 u2

    po 1 0,05 1 20 - 1

    x= ------------------ = ----------------- = --------------

    u2 u2 u2

    2.17

    limite della determinzione

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    concentrazione media del minor numero di particelle x per parte analitica ovelincertezza della deviazione standard relativa uguaglia un valore specificato(RSD)

    NOTA a) Calcolo dixcon la distribuzione di Poisson

    1x= -----------

    (RSD)2

    b) Calcolo dixcon la distribuzione binomiale negativa

    1x= ----------------- , considerato u come fattore di sovradispersione

    (RSD)2 u2

    2.18linearitdipendenza lineare del segnale rispetto alla concentrazione dellanalita

    cf. proporzionalit (2.28)

    2.19distribuzione binomiale negativauna particolare distribuzione statistica dei conteggi sovradispersa

    NOTA 1 La sua varianza pu essere espressa nel modo seguente

    2 = + u22

    dove esprime la media

    NOTA 2 In questo Rapporto Tecnico in valore quadratico del fattore dellasovradispersione sostituito dal reciproco (1/k) della formula standard per la distribuzione

    binomiale negativa.

    2.20sovradispersionevariazione eccedente rispetto alla distribuzione randomizzata di Poisson

    NOTA E rilevata qualitativamente dallindice di dispersione di Poisson e calcolataquantitativamente tramite la definizione del parametro u (fattore di sovradispersione) delladistribuzione binomiale negativa

    2.21fattore di sovradispersioneu

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    incertezza casuale eccedente in una determinazione rispetto alla distribuzione di Poisson,calcolata in termini di deviazione standard relativa

    2.22errore da sovrapposizione

    errore da sovraffollamentosottostima sistematica del conteggio dovuto alla confluenza delle colonie

    NOTA Da un punto di vista quantitativo lerrore di sovrapposizione dipende in primoluogo dallo spazio di crescita disponibile occupato dallo sviluppo delle colonie.

    2.23conteggi parallelinumero di particelle o colonie prelevati in aliquote identiche da una stessasospensione

    2.24distribuzione di Poissondistribuzione completamente casuale del numero di particelle quando ilcampionamento proviene da una sospensione miscelata nel modo piadeguato

    NOTA La probabilit P(k) derivante da osservazioni precise di kunit in una parte di uncampione di prova quando la media di conteggio calcola da

    k

    P(k) = ---- e- K!

    2.25precisioneapprossimazione della concordanza fra risultati di prove indipendenti ottenute in condizionipredeterminate

    NOTA La precisione non correlata al valore esatto o ad un valore specificato. Di solito

    espressa in termini di imprecisione e calcolata come deviazione standard dei risultati delleprove.

    2.26validazione primariavalidazione completadefinizione delle specifiche delle prestazioni di un nuovo metodo e/o verifica sperimentale cheun metodo rispetta i criteri di qualit postulati su base teorica

    2.27propaguloentit vitale, cellula vegetativa, gruppo di cellule, spore, ammassi di spore oframmenti di micelio fungino in grado di svilupparsi in un substrato nutritivo

    ff. germe (2.13)

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    2.28proporzionalitconcordanza dei conteggi di particelle osservata nellambito del volume (odiluizione) di una serie di porzioni analitiche provenienti da una sospensione diorigine comune

    NOTA La proporzionalit conteggiata per valutazioni statistiche come rapporto di

    probabilit logaritmica G2con n 1 gradi di libert

    2.29metodo qualitativometodo di analisi in cui il risultato espresso come presenza o assenza di unanalita in una determinata quantit di campione

    NOTA Consultare il riferimento bibliografico [10]

    2.30riscontrodefinizione generale relativa al numero di particelle riscontrate in una prova suuna aliquota di campione, o sul campione in toto, avendo la consapevolezzache esiste un numero reale (peraltro sconosciuto) di tali particelle, di cui possibile con un rilevatore evidenziare la presenza al 100%, o in proporzioneminore

    2.31accuratezza relativagrado di corrispondenza fra il risultato ottenuto con un metodo di riferimento equello evidenziato da un metodo alternativo applicato su un campione identico

    NOTA Consultare il riferimento bibliografico [10]

    2.32differenza relativaddifferenza fra due valori misurati, divisa per il loro valore medio

    xA - xB 2 (xA - xB)

    d = ----------- = ------------- _x xA - xB

    d % = 100 d

    NOTA Per motivi pratici, lo stesso valore pu essere ottenuto da d = ln (xA) - ln (xB)

    2.33riscontro relativo

    rapporto (A/B) del conteggio delle colonie ottenuto con due metodi saggiati suparti volumetriche identiche della stessa sospensione, in cui si identifica con Bil metodo di riferimento (quando disponibile)

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    2.34deviazione standard relativaRSD (relative standard deviation)stima della deviazione standard di una popolazione ottenuta da un campione

    con nrisultati suddiviso per il valore medio dello stesso campione

    s

    RSD = --- _

    x

    cf. coefficiente di variazione (2.7)

    2.35ripetibilitcongruenza fra risultati di due successive determinazioni relative ad unidentico campione, condotte nelle stesse condizioni analitiche

    NOTA 1 Consultare Guide to the expression of uncertainty in measurement[6]

    NOTA 2 La ripetibilit calcolata secondo r = 2,8sr, dove sr rappresentato dallaripetibilit della deviazione standard

    2.36

    riproducibilitcongruenza fra risultati di determinazioni eseguite su un identico campionecondotte in condizioni analitiche diverse

    NOTA 1 Consultare Guide to the expression of uncertainty in measurement[6]

    Nota 2 La riproducibilit computata come R =2,8sR,

    dove

    sR la riproducibilit della deviazione standard solitamente calcolata con le deviazioni

    standard di laboratori diversi sL e la ripetibilit della deviazione standard sr

    sR = sL2+ sr2

    2.37insensibilitcaratteristica di metodo analitico di non essere influenzato da modesti

    cambiamenti nelle procedure

    NOTA 1 Consultare il riferimento bibliografico [23]

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    NOTA 2 Per la valutazione della insensibilit si consiglia di eccedere, in modocontrollato, nei confronti delle condizioni predeterminate del metodo stesso

    2.38

    validazione secondariadimostrazione sperimentale che un determinato metodo mantiene le propriespecifiche quando utilizzato in modo diffuso

    2.39selettivit apparenteFrapporto fra il numero di colonie bersaglio ed il numero totale delle coloniepresenti nello stesso volume di campione

    F= ln (t/n)

    dove

    t concentrazione riscontrata durante il conteggio di colonie le cui caratteristiche sonocompatibili con le specifiche predefinite

    n concentrazione totale delle colonie

    2.40sensibilitfrazione del numero totale delle colture o colonie positive correttamente

    individuate nel corso di una valutazione presuntiva

    2.41specificitfrazione del numero totale di colture o colonie negative correttamenteindividuate durante una ispezione presuntiva

    2.42incertezza standardincertezza del risultato di una determinazione espressa come deviazionestandard

    NOTA Consultare il riferimento bibliografico [5]

    2.43valutazione di tipo A(di incertezza) metodo di valutazione dellincertezza con analisi statistica diuna serie di osservazioni

    ESEMPIO Le osservazioni possono essere, ad esempio, la deviazione standard, ladeviazione standard relativa

    NOTA 1 Consultare i riferimenti bibliografici [5] e [6]

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    NOTA 2 La ripetibilit e la riproducibilit sono spesso valutate utilizzando i risultati diprove collaborative nelle quali diversi laboratori indagano su campioni identici forniti da unaorganizzazione centralizzata [15]

    2.44

    valutazione di tipo B(di incertezza) metodo di valutazione dellincertezza di una serie diosservazioni con metodologia diversa dallanalisi statistica, ad esempio, condistribuzione di probabilit predeterminate, fondate sullesperienza o su altritipi di informazione

    ESEMPIO Le osservazioni possono essere ottenute dalla deviazione standard o dalladeviazione standard relativa

    NOTA Consultare i riferimenti bibliografici [5] e [6]

    2.45incertezza(di misurazione) parametro associato al risultato di una misurazione checaratterizza la dispersione dei valori che potrebbero ragionevolmente essereattribuiti alloggetto di valutazione

    NOTA Consultare il riferimento bibliografico [6]

    2.46incertezza

    (di conteggio) deviazione standard relativa dei risultati ottenuti da conteggiripetuti delle colonie o delle particelle della stessa piastra(e) o campo(i) dilettura ottenuti in condizioni predefinite

    ESEMPIO Condizioni predefinite possono essere costituite dalla stessa o da persone diversedi un solo laboratorio, o da laboratori diversi

    2.47intervallo di validazioneintervallo della media del numero di particelle per aliquota di campione per ilquale lobbligo delle specifiche di validazione (in modo particolare la linearit)sono state dimostrate in modo sufficiente

    NOTA Di solito i conteggi delle colonie sono espressi come intervallo di fiducia

    3 Struttura del documento

    Nella prima parte (sezioni da 4 a 8) di questo Rapporto Tecnico sono descritti iprincipi di base, le caratteristiche e le limitazioni dei metodi microbiologici e gliaspetti generali della validazione. La seconda parte (sezioni 9 - 11) relativa aldocumento attuale della validazione e contiene specifiche e procedure

    raccomandate per questa finalit.

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    Vecchi e nuovi principi e concetti non sono completamente esplicitati in questoRapporto Tecnico. Sono inclusi tre allegati. Nell'allegato A sono specificate leformule statistiche pi importanti riportate nel documento, in quello B sonocontenuti esempi numerici ed in quello C piani dettagliati per due esperimentidi validazione.

    In linea generale, i metodi statistici non rappresentano il nucleo centrale delproblema. I calcoli matematici sono utilizzati principalmente nell'intento difornire un insieme di dati e la distribuzione statistica fornisce una guidainterpretativa. Una tabella della distribuzione del 2 costituisce la guida pifrequentemente consultata.

    I due programmi BASIC descritti nell'allegato A sono facilmente ricopiabili su PCo calcolatori tascabili e possono servire per le valutazioni numeriche pifrequentemente utilizzate.

    4 Principi di base

    4.1 Generalit

    Poich coinvolta la statistica delle particelle, i conteggi microscopici sonogovernati dagli stessi principi delle particelle vitali, ai quali fanno eccezione imetodi delle microcolonie, liberi quindi da problemi di tipo biologico associatialla loro crescita. Non modificano il principio metrologico le colorazionidifferenziali, complessi specificamente marcati od altri sistemi utilizzati perriconoscere il target. Possono essere applicati gli stessi criteri di validazione dei

    metodi selettivi per il riscontro delle colonie.

    I conteggi dei batteriofagi su piastra sono per lo pi simili ai quelli delle coloniebatteriche.

    4.2 Validazione

    4.2.1Generalit

    Per validazione si intende una procedura che pone in evidenza come unmetodo sia in grado di conseguire l'obiettivo proposto: rilevare o quantificareun determinato microrganismo o gruppo microbico con adeguata precisione edaccuratezza. I metodi di conteggio totale non sono in grado di definire unospecifico gruppo e possono essere validati in relazione ad altri metodi o conespressioni teoriche di precisione attesa.

    La validazione classificata come primaria o secondaria in relazione alle suefinalit.

    4.2.2Validazione primaria

    La validazione primaria una procedura esplorativa che ha l'intento di stabilirei limiti e le possibilit caratteristiche di un metodo nuovo, modificato, o nonadeguatamente caratterizzato. Si devono ottenere risultati di tipo numerico e

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    specifiche descrittive per l'esecuzione ed includere descrizioni dettagliate enon approssimate dell'oggetto di interesse (colonie positive, provette opiastre).La validazione primaria procede in modo caratteristico usufruendo di schemispecificamente predisposti.

    Un laboratorio che stia sviluppando nella propria sede un metodo od unavariante di uno standard esistente provvede a intraprendere le procedure perla validazione primaria.

    E' importante che i tecnici impegnati nella validazione primaria abbiano una

    consistente esperienza anche con altri metodi microbiologici.

    4.2.3Validazione secondaria

    La validazione secondaria (definita anche verifica) ha luogo quando unlaboratorio procede ad implementare un metodo sviluppato altrove. La

    validazione secondaria focalizza la possibilit che il laboratorio in grado di

    rispettare le specifiche stabilite dalla validazione primaria. Attualmente le

    specifiche non sono disponibili per la maggior parte dei metodi. I risultati del

    controllo di qualit esterno (consultare 4.2.8) possono essere utilizzati come

    prima tappa per procedere verso la validazione secondaria.

    Tipicamente, la validazione secondaria utilizza aspetti semplificati delle stesse

    procedure utilizzate per la validazione primaria, ma di solito per tempi pi

    prolungati. I campioni naturali rappresentano il materiale ottimale da

    sottoporre alla prova e la metodologia richiede solo di allocare la procedura

    all'interno dei limiti operativi definiti dalla validazione primaria.

    4.2.4Controllo di qualit (AQC:Analytical Quality Control)

    L'applicazione di metodi affidabili nei loro limiti specifici non assicura

    automaticamente il raggiungimento di risultati attendibili. E' necessario

    eseguire il controllo di qualit analitica (AQC) contemporaneamente alle analisi

    di routine giornaliere. Ci consente il controllo dell'uso appropriato del metodo.

    Il controllo di qualit analitica rappresenta un processo a carattere continuo. Le

    carte di orientamento costituiscono il principale riferimento, con i limiti derivati

    dalle specifiche metodologiche (offerti dalla validazione primaria) o da altre

    considerazioni teoriche.

    I metodi di controllo di qualit rappresentano una estensione dei processi

    analitici di routine, vale a dire, replicazioni a differenti livelli, o semplici

    valutazioni di calcolo, di solito non eseguiti sui risultati di routine. Inoltre, si

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    possono utilizzare materiali di riferimento, calibratori intercalati e campioni

    artificialmente arricchiti.

    Il controllo di qualit analitico richiesto sia per la validazione primaria che per

    la validazione secondaria. Per conseguire i criteri di validazione e lecaratteristiche delle prove dovrebbero essere utilizzati solo risultati ottenuti in

    accordo col controllo di qualit analitico.

    I gruppi di lavoro internazionali e nazionali hanno elaborato numerosi

    documenti sul controllo di qualit analitico per i metodi microbiologici

    (riferimenti bibliografici 1, 2, 3, 4, 7, 8, 20, 21, 24, 26). I manuali di uso

    corrente contengono capitoli dedicati a questo argomento. Sebbene di

    importanza vitale per la validazione, i metodi di controllo di qualit analitica

    non sono riportati in modo dettagliato in questo Rapporto Tecnico. In ogni caso

    si ritiene che i laboratori utilizzino controlli appropriati e sia operativo un

    sistema di qualit interno ed esterno.

    4.2.5Metodi equivalenti

    Si ritiene necessario applicare due metodi in parallelo su campioni identici

    quando si procede allo sviluppo di un metodo interno o si raccolgono

    informazioni per giustificare l'utilizzo di un metodo alternativo.

    Le caratteristiche dei metodi assumono numerose peculiarit. Non esiste una

    sola prova con metodologia o valutazione numerica equivalente. Un metodo

    pu risultare migliore per specificit ma inferiore per capacit di riscontro.

    Tutte le informazioni concernenti linsensibilit, la precisione e la specificit

    poste in evidenza durante le prove di validazione possono essere utilizzate per

    il confronto fra metodi (esempi B.2, B.3, B.4 nell'allegato B). I metodi

    richiedono esclusivamente di essere saggiati in parallelo per poter essere

    confrontati sulle rispettive capacit di riscontro.

    Un metodo che consente la migliore capacit di riscontro di specifici

    microrganismi rappresenta ovviamente quanto di meglio si possa desiderare,

    eccetto il caso che sia richiesta di regola una prova di conferma. Pu essere

    talvolta considerato preferibile un metodo che mette in evidenza una capacit

    di riscontro inferiore, ma che non richiede prove di conferma. Il metodo

    dovrebbe essere considerato non idoneo se, nelle fasi di validazione primaria,

    si riscontrano elevate percentuali di falsi positivi o falsi negativi, e queste non

    possono essere corrette da una miglior ridefinizione delle caratteristiche dei

    microrganismi oggetto di ricerca.

    4.2.6Materiale di prova

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    E' noto che la prova di validazione dovrebbe simulare il pi possibile una prova

    di routine. Campioni con le concentrazioni microbiche naturalmente reperite

    dovrebbero pertanto rappresentare il principale materiale di prova. Per alcune

    circostanze sono prevedibili alcune eccezioni.

    Al fine di garantire la professionalit di base dei laboratori che partecipano alle

    prove di validazione dei metodi, per il controllo interno ed esterno sono

    utilizzati materiali preparati in modo artificiale (materiali di riferimento

    certificati e campioni inoculati con elevate concentrazioni).

    Larricchimento per inoculo pu essere utile ed anche necessario in corso di

    validazioni secondarie quando risulti difficile il reperimento naturale di

    campioni contenenti particolari microrganismi. Il personale di laboratorio deveessere posto in grado di avere familiarit con questi microrganismi.

    I campioni negativi (bianchi) dovrebbero essere circoscritti al controllo di

    qualit interno. Linclusione dei bianchi fra i campioni di prova saggiati per la

    valutazione di metodi equivalenti pu indurre ad errate considerazioni circa

    una loro buona correlazione. Conoscendo preventivamente quali campioni

    naturali non contengano specifici microrganismi, risulterebbe ovviamente

    immediata, in corso di validazione, la selezione dei falsi positivi.

    L'intervallo della concentrazione ottimale per la validazione dei metodi

    microbiologici pi ristretto rispetto a quello programmato. Non sono richiesteelevate concentrazioni. Questi campioni assomigliano a colture pure e noninfluenzano la prestazione del metodo o della prova di laboratorio.Per motivi di salute pubblica sono richiesti campioni con concentrazionibatteriche particolarmente basse, ma queste non sono utilizzabili, per motivistatistici, per il confronto di metodi o per prove di validazione. Considerandotuttavia che, all estremit inferiore della scala, i metodi microbiologicirisentono in misura minore della concentrazione microbica, il problema relativo

    a quanto sopra, appare facilmente evitabile.Nel terreno nutriente ogni singolo microrganismo reagisce in modo pressochindipendente rispetto agli altri presenti nel campione. Se un metodo caratterizzato da una ridotta capacit di riscontro rispetto ad un altro, talecondizione risulta pi facilmente evidente in presenza di 20 - 30 unit formanticolonia per piastra rispetto a quanto evidenziabile con una o poche colonie.

    Metodi ritenuti validi a concentrazioni sufficienti per la validazione sonoaffidabili anche a concentrazioni inferiori di analita.

    4.2.7Campioni - rappresentativit a sufficienza

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    L'analisi statistica fornisce soluzioni per il calcolo del numero di campionirichiesto per prove differenziate o valutazioni di condizioni particolari [3, 13].Per essere in grado di utilizzare modelli teorici, si dovrebbe definire ladimensione reale della loro capacit di rilevamento. Dovrebbe esseredisponibile una stima dell'incertezza delle determinazioni (precisione) e si

    dovrebbe ricorrere al campionamento randomizzato.

    Nella valutazione delle prestazioni dei metodi microbiologici risulta difficilerispettare, nella quasi totalit o in modo completo, i requisiti precedentementeesposti, sia durante le fasi avanzate di progettazione che nellesecuzione delleprove. Lanalisi statistica, se utilizzata di per s, diventa un riferimentogrossolano.Non si dispone di altre precise modalit decisionali al di fuori di una valutazionestatistica. In alcuni casi il primo campione analizzato potrebbe fornirelinformazione che il metodo non possiede qualit sufficiente. Di solito sonocomunque richiesti ulteriori campioni. Potrebbe essere richiesto un migliaio dicampioni per dimostrare che due metodi del tipo P/A non sono equivalenti.La scelta di un numero ridotto di campioni potrebbe rappresentare una perditadi tempo.

    4.2.8Vantaggi del controllo di qualit esterno e di altre provecollaborative

    E considerata estremamente importante la partecipazione di numerosilaboratori a studi su materiali omogenei per la verifica dei metodi e delleprestazioni. (Una volta che gli aspetti marginali sono stati riconosciuti ed

    eliminati, i dati restanti possono essere utili a fornire linformazione necessariasulla prestazione ed efficienza del metodo).

    Le prove collaborative sono state sviluppate in modo diffuso per definireprecise caratteristiche dei metodi chimici (34). Sembra talvolta prematuroraccomandare questa procedura alla microbiologia. Deve essere certo che tuttii laboratori partecipanti abbiano acquisito alcuni anni di esperienza con imetodi di prova ed abbiano dimostrato la capacit di utilizzare gli stessi.Lesperienza attuale risulta essere quella che gli esperimenti a caratterecollaborativo volti alla definizione delle prestazioni di una prova tendono arientrare nelle prove di efficienza del laboratorio e nelle esercitazioni di

    addestramento del personale.

    Numerosi metodi microbiologici sono stati utilizzati da centinaia di laboratoriper anni (Endo agar per i coliformi totali, mFC per i coliformi termotolleranti,m-Enterococcus agar per gli enterococchi intestinali). Questi metodidovrebbero pertanto rappresentare, da un punto di vista teorico, oggetto diprova in studi collaborativi per la valutazione della prestazione.

    Quando si eseguono studi di efficienza a carattere collaborativo per specificimicrorganismi utilizzando terreni selettivi, quasi necessariamente i campioni

    dovranno essere arricchiti con colture pure o miscele di microrganismi. Unaltrasoluzione rappresentata dallutilizzo di materiali certificati. Questultimarappresenta una soluzione semplificata ed artificiale. In questo modo si evitano

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    le maggiori difficolt riscontrate dai diversi laboratori nelluso abituale dimetodi saggiati con campioni naturali. Anche se le caratteristiche delleprestazioni di un metodo microbiologico non possono essere espresse in modoquantitativo, le caratteristiche del controllo di qualit esterno possono essereconsiderate, nonostante il loro limite, il percorso pi soddisfacente per la

    validazione secondaria (verifica) di un metodo.

    4.3 Rilevatori

    4.3.1Generalit

    E utile definire il terreno nutriente presente allinterno di un contenitore qualeun rilevatore (2.11). Nelle differenti varianti delle metodiche microbiologiche siutilizzano due tipi di rilevatori, liquidi e solidi. Questi sono anche associati adifferenti criteri di conteggio o di rilevazione: i liquidi con P/A e MPN, i solidi conil conteggio diretto delle colonie.

    Tutti gli aspetti della validazione microbiologica sono focalizzati sulleprestazioni dei rilevatori.

    Il numero complessivo delle provette (MPN) o delle piastre utilizzate per le analisi definitoinsieme o insieme di rilevazione (2.12). Ciascuna provetta utilizzata dal metodo MPN definitarilevatore P/A.

    Esempio Un singolo pozzetto di una piastra microtiter un rilevatore P/A. La piastramicrotiter intera utilizzata come sistema MPN rappresenta linsieme di rilevamento.

    4.3.2Confronti fra rivelatori

    Per la maggior parte dei metodi di conteggio delle colonie si pu usufruire diuna fase liquida equivalente, priva della matrice solida (agar, membranafiltrante). Leffetto prodotto dalla componente solida pu essere valutatoconfrontando il conteggio delle colonie rilevato con il metodo MPN equivalente,consentendo la rilevazione che il valore ottenuto lo stesso e che il numerodelle provette della prova in parallelo sufficiente ad conseguire un adeguatogrado di precisione. Anche per rilevatori i P/A la sensibilit pu analogamenteessere valutata con confronti solido-liquido.

    4.4 Prestazioni caratteristiche

    Per poter essere utilizzate nella validazione le prestazioni caratteristichedovrebbero essere quantificate e definite.

    La terminologia delle prestazioni caratteristiche in questo Rapporto Tecnicosegue prevalentemente quella di tipo chemometrico. Poich la definizioneoriginale della terminologia non sempre si addice in modo completo allamicrobiologia, quando ritenuto necessario, questa stata modificata edadattata.

    Le prestazioni caratteristiche riportate nel Rapporto Tecnico sono indirizzateallobiettivo (serie di condizioni e tipi di campione in cui il metodo applicabile)

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    e ad altri parametri, quali: precisione, linearit, capacit di riscontro, limitioperativi intesi come numero minimo o massimo rilevabili su piastra per ilconteggio delle colonie, selettivit, specificit, insensibilit (ruvidit). Ladefinizione di questa e di altra terminologia riportata al punto 2.

    4.5 Specifiche

    Le specifiche sono espressioni sia di tipo numerico che qualitativo delleprestazioni caratteristiche o dei limiti operativi da queste derivate. Lavalidazione primaria dovrebbe fornire le seguenti indicazioni:

    a) identificazione morfologica presuntiva del microrganismo;

    b) indicazioni concernenti le condizioni di incubazione (temperatura, tempo,atmosfera gassosa, umidit) e le caratteristiche del terreno (pH,stabilit);

    c) informazioni, se possibile, circa laffidabilit dei limiti operativi riferiti alnumero delle colonie o delle piastre per rilevatore (piastra, membrana difiltrazione);

    d) definizione dellincertezza allinterno dei limiti stabiliti

    e) scopo e limitazioni

    5 Limitazioni ed aspetti caratteristici dei metodimicrobiologici

    5.1 Riscontro dellanalita

    Lanalita microbiologico rappresentato da particelle viventi separate, definitein modo diverso come unit formanti colonia (CFU), particelle formanti colonia(CFP), germi, propaguli ecc. (consultare sezione 2). Il numero di colonie

    osservate rappresenta una approssimazione del numero di particelle viventi.

    Lutile diversificazione delle prestazioni delle prove limitata dalla evidenteimpossibilit di conoscere lentit dellanalita presente in un campione od inuna sua parte. Il sistema di rilevazione non pu essere saggiato con un numeroesatto di microrganismi.

    La vitalit rilevata con la crescita, vale a dire tramite il metodo stesso. Lacapacit assoluta di riscontro non definibile e la tracciabilit impossibile.Poich la vitalit pu essere messa in evidenza in modo diverso con i diversirilevatori e/o con le differenti modalit di campionamento, il conteggio relativo

    (che interessa il nuovo metodo e quello di riferimento) una modalit diesecuzione praticabile anche se il reale risultato rimane ignoto.

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    5.2 Variabilit del campione

    Nei campioni ambientali ed anche in quelli approntati in laboratorio, ladistribuzione delle particelle irregolare. La variabilit del campionamentoambientale non dipende dal metodo, mentre lo il frazionamento di un

    campione di laboratorio. Non possibile utilizzare la miscelazione per garantireuna perfetto mescolamento del campione senza alcuna perdita di cellule vitali.La variabilit interna del campione spesso rimane di grado considerevole ecrea problemi ai fini della validazione. La prestazione, in special modo laprecisione ed i limiti superiori di rilevabilit, richiederanno di esseredeterminati separatamente per matrici di tipo diverso.

    5.3 Distribuzione delle particelle e sovradispersione

    La variazione occasionale dovuta ad una irregolare distribuzione di particellefra campioni paralleli, anche in sospensioni miscelate in modo accurato,rappresenta un aspetto peculiare dei metodi microbiologici [31]

    La variazione occasionale di base inevitabile e non influenzata da aspettitecnici o strumentali. Essa segue una regola matematica, la distribuzione diPoisson [28] e risulta pertanto non calcolabile.

    Imperfezioni tecniche e molti altri fattori sono responsabili di variazioniaddizionali. Le determinazioni parallele variano in modo superiore a quantospiegabile con la distribuzione di Poisson. Questa condizione definitasovradispersione (2.20)

    Molti elementi sostengono la distribuzione binomiale negativa (2.19) come

    modello di sovradispersione in microbiologia [11,14,15].

    5.4 Interazione nel rilevatore

    Numerose difficolt insorgono per le interazioni tra fattori vitali e non ed irilevatori. I rilevatori liquidi risentono della possibile coabitazione di unamicroflora di tipo vario presente nella stessa provetta. I rilevatori di coloniemostrano limiti per sovrapposizione di crescita e per mascheramento di quelle

    ricercate da parte di residui di campione o di sviluppi microbici noncaratteristici. La lettura diviene difficile, non affidabile e talvolta impossibile.

    5.5 Insensibilit

    I metodi microbiologici non sono insensibili. Sia lanalita che la maggior partedelle impurit sono entit viventi. Ci pu causare fenomeni inattesi neirilevatori. I microbiologi dovrebbero essere in grado di scoprirli e riconoscerli.Possono inoltre influenzare il risultato le caratteristiche della matrice, eventualistress da incubazione, la qualit e lorigine dei componenti del substrato, laflora microbica concomitante presente nel campione ed il grado di

    addestramento dei tecnici.

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    Lorigine della mancanza di insensibilit risiede in cinque principali variabili:campione (propriet fisico-chimiche proprie e popolazione microbica presente),competenza del personale, preparazione del campione, condizioni diincubazione e caratteristiche del rilevatore. Di queste, le ultime tre dovrebberoessere standardizzate.

    La validazione primaria dovrebbe stabilire i limiti generali entro i quali i metodidevono conseguire buone prestazioni. Gli efficienti piani statistici sviluppati

    dalla AOAC [34] per le prove di insensibilit possono anche essere applicati allamicrobiologia.

    In funzione della natura vitale dellanalita, la libert di scelta nei confronti deitempi e della temperatura di incubazione spesso sorprendente. I conteggidelle colonie sono pi sensibili al fattore tempo di quanto solitamenteconsiderato. Per esempio, gli Standard Internazionali, nellintento di proporre

    procedure praticabili nei diversi Paesi, frequentemente delimitano linsensibilitin termini non conseguibili.

    ESEMPIO Le specifiche del metodo per la ricerca ed il conteggio dei coliformi consentonouna incubazione di 18 - 24 ore a 36 1 C. Queste condizioni implicano una considerevolestabilit per quanto concerne il periodo di incubazione e la temperatura; probabilmente oltrequanto attualmente ritenuto possibile.

    Quando la temperatura esercita un ruolo selettivo (come i 44 C per i coliformitermotolleranti) anche la posizione delle piastre all'interno del termostato onella pila posta ad incubare influenza in modo consistente il risultato. Questeosservazioni sono emerse da studi volti a definire la massima altezza possibiledellimpilamento (per esempio 6 piastre). La completa eliminazione degli effettilegati alla sovrapposizione delle piastre richiederebbe l'incubazione su di ununico strato, evenienza ritenuta non praticabile.

    Le modalit di conservazione dei campioni nel periodo precedente l'analisi sonoun altro importante aspetto della insensibilit di un metodo. E' opinionecomune che i campioni possano tollerare la refrigerazione per 24 ore [9]. Lostress da freddo conferito durante il periodo di refrigerazione pu essereininfluente per i conteggi totali, ma dannoso per metodi che esprimono elevaticriteri di selettivit. Gli shock termici o altre condizioni di stress non assumono

    criticit di tipo generale ma sono specifici per ciascun tipo di microrganismo.

    5.6 Errori spuri

    Un aspetto tipico della maggior parte dei metodi per il conteggio delle colonie la loro predisposizione a problemi inattesi, spesso confinati ad una singolapiastra. Sotto questo aspetto le differenti tecniche (inclusione in agar, seminasuperficiale, filtrazione su membrana) possono indurre effetti certamentediversificati. I problemi possono essere legati allo sviluppo anche di una singolacolonia interferente, presenza di umidit, differenze di temperatura, residuisolidi od altri tipi di impurit presenti in una parte del campione,contaminazione ecc.. Questi "inconvenienti" non dipendono in generale dallecaratteristiche del metodo e non sono neppure quantificabili in corso divalidazione ne prevedibili con modelli matematici. Quando si manifestano di

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    frequente dovrebbe essere condotto ogni sforzo per individuare i risultati nondel tutto affidabili, dei quali non si dovrebbe tenere conto.

    I metodi colturali liquidi sono meno suscettibili.

    Lo stato dellarte ritiene opportuno che gli errori spuri propri dei metodimicrobiologici dovrebbero essere inclusi nelle valutazioni dellincertezza di unaprestazione. Ci concorda con lopinione che i metodi dovrebbero esserevalidati secondo le caratteriste emerse dal loro utilizzo.

    L'opinione espressa in questo Documento Tecnico quella che gli errori spuriinteressano il Controllo di Qualit giornaliero. Sebbene il loro rilievo dipenda dalgrado di preparazione degli operatori, nel caso in cui questi siano riconosciuticausa frequente di errore analitico, il metodo non dovrebbe essere consideratoutilizzabile per quella determinata finalit.

    5.7 Carte di controllo e di indirizzo

    Una procedura analitica rappresenta una tipologia di processo e le relativemisurazioni o determinazioni possono esserne considerate il prodotto. L'idea dibase della carta di controllo, nata nellambio del processo industriale, puessere assimilata al controllo di un processo analitico. Dovrebbe aiutare arilevare se si sono verificate improvvise o insidiose modifiche nella qualit delprocesso. Nel caso di una situazione fuori controllo in modo pi o meno certo,il processo pu essere interrotto e ripristinato.Le possibilit di un controllo di processo in fase analitica sono limitate. Le pi

    comuni sono l'uso di campioni di riferimento per saggiare la costanza deirisultati (assenza di errori sistematici) e le determinazioni su campioni identiciin parallelo per verificare la precisione (ripetibilit e/o riproducibilit).

    Queste possibilit si addicono in modo appropriato alle analisi automatizzate ditipo chimico, ma non sono approntate di consuetudine nelle analisimicrobiologiche. Si ritiene di consuetudine che un processo (nel caso specificola procedura analitica) si sviluppi in modo ottimale nella sua fase iniziale esuccessivamente aumentino le possibilit che il medesimo fornisca risultatipeggiori fino ad una condizione di inaccettabilit. In microbiologia non faciledefinire quando un metodo sfugge al controllo. Un risultato analitico di qualit

    non accettabile non pu essere correlato a qualsiasi altro risultato ottenutonello stesso giorno.

    Le rappresentazioni grafiche sono utili non solo per il controllo di qualit maanche nel contesto di alcuni tipi di validazione. Per motivi riportati inprecedenza, il loro utilizzo in microbiologia dovrebbe essere limitato a fornireuna guida nella pratica analitica. Queste non dovrebbero essere utilizzate perpenalizzare il lavoro di un giorno intero o una serie di risultati.

    E' stato suggerito che la dizione "carta di controllo" dovrebbe essere riservataalla situazione di evidente controllo, quale quello sistematico della temperaturadi un incubatore. La dizione "carta di indirizzo" preferita quando l'illustrazionegrafica definisce le possibilit dei metodi microbiologici. Alcuni valori diquest'ultima possono essere selezionati per prendere delle decisioni.

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    6 Modelli matematici di variazioni

    6.1 Variazioni di base non modificabili La distribuzione di Poisson

    6.1.1Generalit

    Anche se una sospensione perfettamente miscelata (del tutto a caso) e non cisono incertezze tecniche di misurazione, si rileva una particolare consistenzadellampiezza delle variazioni del numero di particelle nell'ambito dell'intervalloanalitico; tale ampiezza ottenuta con lausilio di rilevatori microbiologici inprove parallele su parti di uno stesso campione ed in condizioni operativeottimali.

    Questa condizione crea un tipico dilemma microbiologico. I metodi di conteggiodelle colonie sono, principalmente sotto il profilo biologico e tecnico, nella loromigliore condizione quando i numeri sono cos piccoli che la precisionestatistica risulta inadeguata.

    6.1.2Precisione del rilevatore del conteggio delle colonie

    La precisione di solito espressa in termini di deviazione standard. Le basistatistiche delle variazioni dei conteggi possono essere matematicamenterappresentate con la distribuzione di Poisson.

    La varianza (s2) della distribuzione di Poisson equivale numericamente alvalore della media (m). (L'equivalenza della media e della varianza non provache i risultati seguono la distribuzione di Poisson). La deviazione standardrelativa (RDS) esprime il valore reciproco della media del conteggio o pigeneralmente del conteggio totale c del sistema di rilevazione:

    s c 1RDS = -- = ------ = ---- (1)

    c c c

    ESEMPIO Il conteggio di un campione da una singola piastra preparata da una sospensioneperfettamente miscelata dichiara la presenza di 48 colonie: questo numero ha un valore diprecisione teorica relativa (RSD) di 1/ 48 = 0.14, (CV =14%). Se il medesimo conteggiototale di 48 colonie deriva da tre piastre parallele 12 + 16 +20 = 48, la deviazione standardrelativa della media 48/3 =16 dovrebbe essere la stessa.

    La dipendenza della precisione relativa (CV, coefficiente di variazione) sulconteggio delle particelle rappresentato nella figura 1.

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    Figura 1 - Il coefficiente di variazione del numero di colonie c in unasospensione perfettamente miscelata secondi la legge di distribuzione diPoisson

    Il grafico pone in evidenza il motivo per cui il numero di colonie corrispondentea 20, 25 o 30 stato tradizionalmente considerato il pi basso conteggiostatisticamente affidabile.

    Il modello di Poisson pu essere utilizzato per valutare l'incertezza teoricastatistica di qualsiasi conteggio di colonie e di conseguenza per prenderedecisioni per definire i limiti operativi pi bassi valutati sulla precisionestatistica desiderata.

    L'incertezza casuale aumenta rapidamente con il decrescere del conteggiodelle colonie (Figura 1). Nell'intervallo dei conteggi inferiori a 10, evenienza chepu essere considerevole per quanto riguarda la saluta pubblica, ciascunadeterminazione cos imprecisa che pu essere difficilmente caratterizzatacome migliore rispetto ad una valutazione semi-quantitativa.

    L'intervallo di conteggio da 1 e 10 corrisponde approssimativamenteall'intervallo che definisce le caratteristiche di precisione del conteggio del MPNeseguito con 3 x 5 provette. Classificando i conteggi delle colonie inferiori a 10come valutazioni semi-quantitative si concorda con i giudizi espressi da moltispecialisti in statistica per i quali i metodi MPN eseguiti di solito con il metodo 3x 3 o 3 x 5 sono pi propriamente considerate prove per definire ordini digrandezza piuttosto che valutazioni quantitative. (La prova 3 x 5 provette delMPN si valuta che abbia un intervallo di confidenza del 95% di circa 0.5 unitlogaritmiche conteggio.[12]))

    6.1.3Precisione dei rilevatori MPN

    La precisione delle stime del MPN dipende dal conteggio stesso, ma , sottoqualche aspetto, una procedura pi complicata rispetto al conteggio dellecolonie. La deviazione standard del logMPN una curva ondulata. Questapresenta un numero di valori minimi equivalente al numero di diluizioni delsistema di rilevamento. Per esempio, la deviazione standard di tipo logaritmico stata calcolata per il sistema di rilevazione MPN 3 x 10 con l'ausilio di unprogramma computerizzato [19] (Figura 2)

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    Figura 2 Deviazione standard logaritmica del MPN a 3 x 10 provette

    Il numero delle provette positive dell'intero sistema riportato in ascissa. Lacurva ad andamento ondulante pone in evidenza il valore reale delladeviazione standard. La linea retta orizzontale esprime l'approssimazione diCochran [12]).Cochran [12] ha proposto una costante approssimata della deviazione standardper l'intero intervallo del MPN. Questa approssimazione rappresentata dallaretta orizzontale della Figura 2. E' stato notato che il risultato esatto deviamaggiormente dal valore approssimato quando la maggior parte delle provette

    del sistema di rilevazione esprime risultato negativo.

    In accordo con la formula di Cochran [12], la precisione della valutazione delMPN in scala logaritmica dipende in modo diretto dal numero di provette (n) edal fattore di diluizione fra diluizioni successive (f). La costante 0.58 statascelta "ad occhio" per le diluizioni a base dieci per renderla idonea allapresentazione della Figura 2. Se il fattore di diluizione inferiore a dieci puessere utilizzato il valore della costante 0.55 [12].

    lg f

    SD di lg MPN = 0.58 ------ (2) n

    Il 95% dei limiti di confidenza di molte tabelle del MPN si avvalgono nella loroequazione dell'approssimazione di Cochran (2), ma stanno per essere sostituiti,nelle tavole di recente pubblicazione, da limiti pi esatti "veri".La deviazione standard di qualunque singolo valore di MPN attualmenteottenuto in modo semplice con programmi computerizzati dedicati [19].Nonostante il carattere approssimativo, la formula di Cohran risulta essere utilenella programmazione sperimentale della comparazione dei metodi (consultare

    lesempio seguente).

    ESEMPIO Determinazione con sistema MPN di 3 x 32 in piastra microtiter da 96 pozzetti.Diluizioni successive con fattore di diluizione f = 3. La deviazione standard del lgMPN, inaccordo alla formula con approssimazione di Cochran

    lg 3SD di lgMPN = 0.55 ------- = 0.55 0.0149 = 0.0672(3)

    32

    Con un numero elevato di provette parallele e con fattori di diluizione inferiorea 10 il sistema MPN ottiene risultati equivalenti o migliori rispetto ai metodi di

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    conta delle colonie per le sue migliori condizioni di crescita, facilitd'interpretazione ed assenza di errori da sovrapposizione.

    6.1.4Limiti del rilevamento - modello di Poisson

    A concentrazioni particolarmente basse tutti i metodi microbiologici, inclusi iconteggi di colonie ed il MPN, assumono essenzialmente le caratteristiche deimetodi P/A. E' ininfluente, tranne che non si tratti di problemi connessi allasalute pubblica o al controllo di qualit dei prodotti, considerare qualsiasiconteggio inferiore di tre o quattro equivalente ad un semplice riscontropositivo.

    Se il limite di rilevamento definito in termini di probabilit di rilievo di unrisultato positivo, questi non pu essere desunto dal grafico della Figura 1. Laprobabilit di un risultato positivo p(+) quando la distribuzione di Poissonprevale pu essere calcolato con la formula

    p(+) = 1 - e-m (4)

    dove

    e base del logaritmo naturale

    m media del numero di particelle per porzione di analitica

    ESEMPIO Una delle pi comuni definizioni per il limite di rilevazione rappresentata dallaconcentrazione alla quale la probabilit di riscontro di presenza dell'analita uguale al 95% [p(+) = 0.95]

    Se p (+) valutato con valore di 0.95, allora e-m = 0.05. Risolvendo l'equazione per m siottiene m = - In(0.05) = 3.0. Pertanto, ad un conteggio medio di 3, le probabilit di riscontrareuna particella in una porzione di prova sono di 0.95 (ammesso che prevalga la distribuzione diPoisson).

    6.2 Sovradispersione - Modello binomiale negativo

    6.2.1Generalit

    La preparazione della sospensione iniziale, della diluizione, inoculo e conteggiodelle colonie sono operazioni non completamente esenti da margini diincertezza. Ogni fase di tipo tecnico condiziona una progressione dellavariabilit complessiva della determinazione. Non prevedibile chedeterminazioni di tipo parallelo che interessano complessivamente una interaprocedura analitica siano influenzate solo dalla distribuzione di Poisson.Nell'ambito delle determinazioni parallele sar osservata la sovradispersione,vale a dire un grado di variazione superiore a quella completamente affidata alcaso (nel senso di Poisson).

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    Nelle determinazioni microbiologiche la sovradispersione rappresenta lacondizione normale e la distribuzione di Poisson si configura come unaeccezione.

    Le cause comuni di sovradispersione, senza considerare gli errori spuri,

    esercitano effetti consistenti sulla media o sul numero reale di colonie (c)conteggiate con un sistema di rilevazione. Altre motivazioni del perch lasovradispersione dei conteggi microbiologici condizionata da questi fattori stata descritta da altri [11, 14]. Come l'incertezza di fondo dovuta alladispersione randomizzata delle particelle in sospensione segue la distribuzionedi Poisson, la varianza totale s2 pu essere calcolata nel modo seguente:

    s2 = c + u2c2 (5)

    dove

    u il fattore di sovradispersione, deviazione standard relativa o addizionaledi

    incertezza

    c il conteggio delle colonie nellintero sistema di rilevamento

    La prima componente della varianza (c) dovuta all'effetto di Poisson, larestante parte u2c2 dovuta all'effetto combinato di tutti i fattori disovradispersione. Una distribuzione statistica con questo modello di varianza definito

    distribuzione binomiale negativa (oppure distribuzione eterogenea o compositadi Poisson).

    Di conseguenza, la deviazione standard relativa pu essere espressa nel modoseguente

    1

    RDS = -- + u2 (6)

    c

    La Figura 3 mostra l'effetto di differenti gradi di sovradispersione nei confrontidella precisione relativa complessiva (coefficiente di variazione)

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    NOTA Dipendenza del coefficiente di variazione (CV) dal numero di particelle (c)conteggiate e

    da una moderata variazione addizionale. Curva inferiore: modello di Poisson senzasovradispersione. Curve superiori: negativit binomiale con 15% e 30% disovradispersione (u = 0.15 e 0.30)

    Figura 3 - Effetto della sovradispersione sul CV

    Il numero di colonie richiesto per raggiungere un dato valore di precisionetotale relativa considerevolmente maggiore in condizione di sovradispersionerispetto alla condizione completamente casuale (Poisson). Questultimo puessere calcolato con la formula (6) per il conteggio di colonie c:

    1c = ------------- (7)

    RSD2 - u2

    ESEMPIO Per ottenere una deviazione standard relativa RSD = 0.2 con unasovradispersione u =

    0.15, in accordo all'equazione (7) il numero di colonie c = 1/(0.22 - 0.152) = 1/(0.04 -

    0.0225) = 57. Lo stesso grado di precisione ottenuto in una condizione

    completamente randomizzata (Poisson) con il numero di colonie c = 1/0.22 =

    1/0.04 = 25

    NOTA Appare ovvio che una precisione totale inferiore rispetto alla sovradispersionenon pu

    essere raggiunta ricorrendo ad una singola determinazione. L'intera proceduradeve

    essere ripetuta se si richiede un tipo di precisione migliore. Ponendo n il numerodi

    determinazioni parallele, la deviazione totale relativa pu essereapprossimativamente

    calcolata da:

    1 u2RSD = ----- + ---- (8)

    C n

    dove C rappresenta il numero totale delle colonie conteggiate

    u la costante di sovradispersione

    n e il numero di determinazioni parallele

    6.2.2Limiti del rilevamento - Modello binomiale negativo

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    Il rilevamento del limite, se inteso come probabilit di risultato positivo, puessere calcolato con la probabilit dei negativi. Secondo Anscombe [11] mamodificando il simboli in conformit a quelli utilizzati in questo Documento

    Tecnico, la probabilit di un risultato negativo (probabilit di uno zero)

    determinata con la formula seguente:

    -1/ u2

    p0= (1 + u2c) (9)

    Risolvendo per c si ottiene il limite quando sono note la probabilit dei negativied il fattore di sovradispersione.

    -u2

    p0-1c = ------------ (10)

    u2

    Come evidenziato nella Figura 2, il limite di rilevamento scarsamenteinfluenzato da valori modesti di sovradispersione (consultare il seguenteesempio)

    ESEMPIO Il conteggio medio delle colonie richiesto in condizione di sovradispersione perottenere un risultato positivo con 95% di probabilit dipende dal fattore di sovradispersione. Sisupponga un valore di sovradispersione u = 0.30. La diretta sostituzione di questi valori nella

    formula della probabilit di un risultato negativo fornisce p0= 1 - p(+) = 1 - 0.95 = 0.,05 econ l'equazione (10) si ottiene

    2 2

    c = (0.05 - u -1) / u = (0.05 -0.09-1) / 0.09 = 3.44. Il valore corrispondente della distribuzionedi Poisson (senza sovradispersione) risulta c = ln(1-0.05) = 3.00 (consultare l'esempio in6.2.4).

    6.2.3Quantificazione della sovradispersione

    Sono note tre principali possibilit per la definizione del parametrou

    [20].

    Il metodo di Ascombe [11] efficiente nell'ambito dell'intervallo della media deivalori e dei fattori di sovradispersione che sono riscontrati nella validazione deimetodi per il conteggio delle colonie. Si deve risolvere l'equazione (5) per u.

    Per poter utilizzare il Metodo I di Anscombe si deve eseguire una serieconsistente di prove indipendenti (preferibilmente pi di 30) su un singolocampione per definire una stima affidabile della varianza (s2 ) e la media (m).

    Sostituendo m a c nell'equazione (5)

    s2 - mu2 = ----------

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    m2

    Per essere efficienti, le osservazioni dovrebbero essere limitate a conteggi dicolonie che ricadono all'interno dell'intervallo ottimale. La media non dovrebbemai essere inferiore a 30. Questo requisito si applica in modo particolare se la

    valutazione di u limitata ad una solo prova.

    ESEMPIO Per dimostrare la fattibilit dei calcoli relativi alla sovradispersione stataeseguita una prova con una serie parallela di conteggi nella quale stato introdotto in modopredeteminato un fattore di sovradispersione. Sono state utilizzate 24 membrane filtrantiseminate con una sospensione accuratamente miscelata di una coltura pura di Enterococcusfaecium in modo che 8 piastre di ciascun gruppo sia inoculato rispettivamente con 8 ml, 10 mle 12 ml di sospensione. Questa procedura introduce una imprecisione correlata al volume cheinduce una prevedibile grossolana espressione della sovradispersione nei 24 conteggi di tipoparallelo.

    Il volume complessivo di 8 x 8 ml, 8 x 10 ml e 8 x 12 ml esprime una media di valore 10 eduna deviazione standard = 1.633. Il corrispondente standard di incertezza attribuibile allasovradispersione dovrebbe essere u = s/m = 0.1633 (CV = 16.33%), se il volume utilizzato esattamente quello previsto.

    I 24 conteggi di colonie osservati esprimono una media m = 379,29 ed un valore di varianza di

    s2

    = 4586,54. Secondo lequazione (11), u2 = (4.585,54 379,29)/379,292= 0.0292. Pertanto , ilcoefficiente di sovradispersione u = 0.0292 = 0.1710 che esprime un valore strettamentecorrelato al valore atteso, considerando che include anche il possibile conteggio dellincertezzadi volume non considerata nel u = 0.1633 atteso. (Tutte le misurazioni dei volumi di 8 ml, 10ml e 12 ml sono state ritenute esatte).

    Le determinazioni delle incertezze calcolate in precedenza non sono ritenutegeneralmente valide, poich calcolate su di un campione unico.

    La seconda soluzione si avvale anchessa di una equazione (5) ma prende inconsiderazione pi campioni. Dividendo lequazione per il fattore c si ottiene

    s2

    Y= ---- = 1 + u2 c c

    Nel caso in cui siano disponibili le determinazioni parallele si possono calcolarela varianza e la media. Dal rapporto Y =s2 / cdi ciascun insieme si ricava unelevato numero di coppie (Y,c). Linclinazione della linea diregressione riferitaai diversi punti consente una stima di u2. La distribuzione randomizzata considerata inevitabile quando la stima della media e della varianza sonoriferite a pochi campioni (numero esiguo di determinazioni parallele)(consultare lesempio B.7). Il vantaggio di questo tipo di approccio quello chela valutazione della sovradispersione correlata ad unampia selezione didifferenti campioni assumendo pertanto una considerevole utilit generale.

    NOTA Il suddetto approccio raggiunge i migliori risultati se la media (m) rappresenta un

    numero non modificato di colonie (o particelle) per sistemi di rilevazione e questiultimi sono per altri aspetti identici in tutte le determinazioni parallele.

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    6.2.4Sovradispersione a livello di rilevatore

    Conteggi paralleli eseguiti da una sola sospensione possono variare in modopi consistente rispetto alla distribuzione di Poisson. Questa unaosservazione nota [16]. In questa condizione le uniche cause di

    sovradispersione sono gli errori di misurazione dei volumi con le pipette, quellidi incertezza dei conteggi e gli errori spuri (accidentali). La sovradispersione una misura utile dellaffidabilit complessiva. Questa pu essere rilevata congli indici di dispersione (X2, G2) (consultare lesempio B.6 dellallegato B).

    6.3 Statistica e limiti pratici

    6.3.1Generalit

    I limiti operativi inferiori dei metodi microbiologici sono in gran parte in corso didefinizione.

    I limiti superiori sono definiti dalla richiesta di spazio e dalle conseguentiinterazioni fra le colonie microbiche. Una particella microbica richiede milioni diprocessi di moltiplicazione per essere rilevata ad occhio nudo.

    6.3.2Limite inferiore

    Quando si esamina una sola parte dellanalisi (una piastra) il limite statisticoinferiore pu essere convenientemente definito come il numero pi bassorilevabile con un conteggio in piastra; laffidabilit essendo definita come

    espressione della precisione.

    Considerati molteplici aspetti, per un sistema di prova il limite inferiore puessere talvolta scelto in prossimit delle 20 colonie. A questi valori diconcentrazione delle colonie il coefficiente di variazione, in condizione dicompleta distribuzione casuale (Poisson), assume il valore di circa 25%(6.1.4). Se il valore della sovradispersione noto, il calcolo del limite inferioredella determinazione pu avvalersi del modello binomiale negativo (6.2.2).

    6.3.3Limiti superiori

    Le analisi di tipo P/A non dispongono un limite superiore. La probabilit dirilevare la presenza di microrganismi in una quota di materiale si accresce inmodo certo con laumento del loro numero.Con il MPN, il limite superiore superato quando tutte le provette di tutte lediluizioni sono riscontrate positive. Questa condizione non esprime il valore dellimite superiore del metodo stesso, ma solo un errore nelle diluizioniapprontate. Peraltro non pu essere definito un limite superiore per motivazionidi calcolo statistico ed anche perch la precisione non dipende in modo direttodal numero delle particelle presenti nel sistema di rilevazione. Un aspettocaratteristico dei i sistemi MPN rappresentato dalla possibilit di migliorare la

    loro precisione modificando la configurazione del sistema di rilevazione(consultare 6.1).

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    Da un punto di vista teorico i metodi di conteggio delle colonie migliorano ilgrado di precisione con laumento del numero delle colonie oggetto dellaricerca presenti nel sistema di rilevazione. In pratica, i metodi di conteggiodelle colonie manifestano un limite superiore di rilevamento variabile chedipende dalle condizioni operative. Il rilevatore delle colonie (piastra di agar,

    membrana filtrante) diviene intasato o saturato per motivi di diverso tipo, deiquali il numero delle colonie bersaglio solo uno dei tanti.

    Numerose sono le cause che in diverso modo possono determinare il limitesuperiore. Una delle possibilit quella di determinare il conteggio dellecolonie per piastra ove il limite di incertezza totale (incluso lerrore sistematico)sale nuovamente allo stesso livello di quello presente per la determinazione dellimite inferiore [30].

    Si deve inoltre considerare laffollamento od il mascheramento delle coloniericercate a causa di fattori indipendenti dalla crescita. Questa condizione puessere quantitativamente correlata alla selettivit del metodo o, in modo pispecifico, alla copertura, vale a dire alla frazione di spazio disponibile peressere occupata dalle colonie. Anche le colture pure sono assoggettate allospazio di copertura.

    Un terzo aspetto rappresentato dalla perdita di proporzionalit (o perdita dilinearit) che si riscontra nella piastra ad elevate concentrazione di colonie.

    6.4 Prove generali di randomizzazione Rilievo dellasovradispersione

    Deviazioni dalla distribuzione randomizzata (presenza di sovra osottodispersione) possono essere efficacemente rilevate con una o due proveappropriate quali lindice di dispersione di Poisson (X2, D2) oppure con ilrapporto statistico di tipo logaritmico (G2). Il calcolo degli indici riportatonellallegato A.

    In poche circostanze (come nellutilizzo delle piastre parallele) in cui grossolanivalori di sovradispersione non sono accettabili per motivi di tipo tecnico, laconcordanza con la distribuzione di Poisson pu essere utilizzata come provadel metodo o analisi di prestazione [16, 33]. Per la sua semplicit questacaratteristiche pu essere particolarmente utile come strumento del Controllodi Qualit.

    7 Specifiche Pratica corrente

    Un esempio di come i migliori protocolli di riferimento valutano di consuetudinele caratteristiche delle prestazioni dei metodi pu essere riscontrato nellemodalit con cui gli Standard Methods for the Analysis of Water andWastewater[8] istruiscono lutilizzatore sui metodi consigliati. In differenti partidelle procedure per il conteggio totale dei coliformi con il metodo di filtrazione

    con membrana, lutilizzatore trover le seguenti parti con le relative specifiche.

    a) Scopo

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    Lo scopo del metodo del metodo pu essere desunto da una tabella incui sono specificati i volumi dei campioni raccomandati per i diversitipi di acqua. La stessa tabella pu includere i diversi tipi di acquapotabile, di svago ed anche di scarico.

    b) Insensibilit dellincubazione e dipendenza dal tempo

    Lindicazione principale fornita nel modo seguente: Incubare da 20a 22 ore a (35 0.5) C. In un'altra parte del documento presentatoil ruolo principale delle eccezioni: I campioni di acque disinfettatepossono includere microrganismi in condizioni scarsamente vitali checrescono in modo relativamente lento producendo il picco di crescita a22 24 ore. I microrganismi provenienti da fonti non trattateproducono il picco di crescita a 16 18 ore e lattivit dimoltiplicazione pu iniziare a decrescere dopo 24 30 ore.

    c) Affidabilit dei limiti operativi

    I limiti operativi affidabili possono essere desunti da Calcolare ilconteggio utilizzando le membrane da filtro con 20 80 colonie.Questa dizione seguita da ulteriori annotazioni che indicano i limitioperativi con criteri selettivi: e non pi di 200 colonie di ogni tipoper ciascuna membrana filtrante. Altre motivazioni sono riportate inunaltra parte del documento: Le dimensioni del campione di provasaranno definite in funzione della densit batterica attesa, che nel

    caso di campioni di acqua potabile saranno limitate solo dal grado ditorbidit o dalla crescita sul terreno di batteri non coliformi.

    d) Definizione ed identificazione di un particolare microrganismo

    Tutti i batteri che producono colonie rosse con lucentezza metallicaentro 24 ore di incubazione a 35 C su terreno tipo Endo, sonoconsiderati appartenere al gruppo dei coliformi. La lucentezza puessere diffusa sullintera colonia o pu manifestarsi solo nellareacentrale o alla periferia. Possono essere descritte altre informazioni:I terreni tipo Endo possono produrre occasionalmente colonie

    atipiche, di colore rosso scuro, senza lucentezza metallica. La verificadelle diverse tipologie delle colonie, quelle con la caratteristicaspecifica (lucentezza) o quelle atipiche (assenza di lucentezza)consentir di riconoscere i falsi negativi e fornir utili esperienze nelriconoscimento delle colonie.

    e) Altre limitazioni e formulazione di specifiche.

    I documenti di riferimento forniscono anche informazioni e formulanoquesiti sul controllo di qualit del terreno e della strumentazione.

    8 Informazioni specifiche Raccomandazioni

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    Di solito i campioni di riferimento forniscono un aiuto limitato per garantirelapplicazione ottimale dei metodi ed il conseguimento di validi risultati.

    Ci che sembra mancare sono direttive concise relativamente a ci che i

    laboratori dovrebbero approntare per verificare che i metodi adottati nelle lorosedi funzionino in modo appropriato e sulle modalit operative idonee adiscriminale le buone prestazioni da quelle non soddisfacenti.

    Alcune specifiche scritte dovrebbero essere aggiunte a tutti i documenti diriferimento.

    Il documento che descrive i metodi di conteggio delle colonie dovrebbeincludere le seguenti informazioni:

    a) Sensibilit: con poche eccezioni (casi menzionati), sono confermati pidel 90% dei risultati presuntivamente positivi.

    b) Selettivit: solitamente superiore a 1 (consultare la definizione di

    selettivit). Non sono validi risultati con selettivit minore di 2.

    c) Incertezza del conteggio: la deviazione standard relativa del conteggioduplicato (replicato) allinterno di un laboratorio generalmente inferiorea uZ = 0.05. Il grado di incertezza individuale (una persona) di solito

    inferiore a uZ = 0.03.

    d) Semina parallela in piastra: la variazione compresa nella distribuzionedi Poisson. (In caso contrario, dovrebbe essere fornita lestensione dellasovradispersione)

    e) Nei campioni di acqua la variazione allinterno del campione produce unulteriore coefficiente di incertezza inferiore a uZ = 0.10. Nei campionisolidi, il fattore di incertezza addizionale deve rimanere inferiore a 0.15.

    f) Proporzionalit (linearit) del sistema di rilevazione dipende dallaselettivit. E adeguata ai limiti di conteggio di seguito riportati:

    Selettivit Limite superiore di

    linearit(N colonie tipiche/piastra)

    0 500 (colture pure)-0.5 a 1 200 a 100-1 a 2 100 a 25

    Inferiore a 2 Solo rilevazione P/A

    In presenza di eccesso di crescita, il limite funzionale superiore pu essereprecocemente raggiunto. Senza tener conto del valore della selettivit, iconteggi non sono ritenuti validi quando pi di 1/3 dello spazio a disposizione

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    occupato da sviluppo di colonie (microrganismi tipici e non per la ricerca inoggetto).

    Quanto sopra riportato costituisce un esempio di come possono essererappresentate le specifiche delle caratteristiche metodologiche. I valori

    numerici della tabella devono essere considerati solo un esempio. Attualmentenon possono essere considerati come valori di riferimento.

    Se disponibile il dato sul valore relativo di riscontro ottenuto con unostandard di riferimento, questo stesso deve essere esplicitato.

    Se sono disponibili i risultati delle prestazioni dei metodi espressi da studi acarattere collaborativo, questi ultimi dovrebbero essere esplicitati comeinformazioni aggiuntive.

    Inoltre dovrebbero essere specificate le condizioni analitiche, la descrizionedelloggetto della ricerca e le condizioni di conservazione dei campioni diprova.

    9 Determinazione ed espressivit delle caratteristichedelle prestazioni

    9.1 Generalit

    Le caratteristiche delle prestazioni sono determinate sulla frequenza diparticolari aspetti nellambito delle categorie qualitative e di conseguenza sono

    definite di categoria.

    In relazione ai metodi selettivi queste sono definite da verifiche eseguite concolture presuntivamente positive e negative.

    9.2 Caratteristiche di categoria delle prestazioni relative allaspecificit e selettivit

    9.2.1Generalit

    Laspetto qualitativo pi completo delle prestazioni dei metodi deriva dallostudio dei campioni naturali. I campioni dovrebbero rappresentare la finalitomnicomprensiva del metodo, includendo un numero diverso di campioni econdizioni di inquinamento, come pure i risultati ottenuti in differenti stagionidellanno.

    Il riscontro di una colonia o di una placca equivalente ad una prova P/A o aduna provetta in una serie MPN. Nella fase di validazione primaria dovrebberoessere verificate sia le colture presuntivamente positive sia quelle con risultatonegativo.

    La miglior efficacia riferita ai costi ed agli aspetti positivi dei metodi di colturain fase liquida (P/A e MPN) rappresentata dallutilizzo del sistema del MPN. Leprovette di diluizione in cui si manifestano risultati positivi o negativi devono

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    essere selezionate per la verifica. Sono presenti diluizioni alle quali le provettepositive derivano da una o da poche cellule.

    Le caratteristiche delle prestazioni associate alla selettivit ed alla specificitpossono essere determinate in modo numerico [17]. Queste sono riferite al

    numero delle colonie o delle provette ritenute positive o negative in funzione diuna valutazione (presuntiva) confrontata con un campione di riferimento. Aseguito delle verifiche di n prove, i risultati sono suddivisi in quattro categorie.

    a) Numero di presunti positivi riscontrati come positivi (veri positivi)

    b) Numero di presunti negativi riscontrati come positivi (falsi negativi)

    c) Numero di presunti positivi riscontrati come negativi (falsi positivi)

    d) Numero di presunti negativi riscontrati come negativi (veri negativi)

    Queste frequenze possono essere opportunamente riportate in una tabella 2x 2

    Conteggi presuntivi+ -

    +Conteggi confermati

    -

    a b

    c d

    a + b

    c + d

    a + c b + d n

    Le caratteristiche delle prestazioni calcolate secondo queste osservazioni sonodefinite nel modo seguente:

    1. sensibilit = a/(a + b), frazione del numero totale dei positiviidentificati in modo corretto con il conteggio presuntivo;

    2. specificit =d/(c + d), frazione del numero totale dei negativi

    identificati in modo corretto con il conteggio presuntivo;

    3. quota di falsi positivi = c/(a + c), frazione di positivi assegnati inmodo erroneo;

    4. quota di falsi negativi = b/(b + d), frazione di negativi assegnati inmodo erroneo

    Il numero totale delle prove a + b + c + d = n

    5. Efficienza E: parametro singolo a carattere generale che identificale colonie o le provette correttamente rilevate

    E = (a + d)/n

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    Le colonie dovrebbero essere saggiate in modo casuale fra tutte le colonie (cone senza caratteri specifici, considerate nella loro totalit. Con le colture in faseliquida tutti i rilievi positivi e negativi dovrebbero essere saggiati secondo uncriterio di proporzionalit.

    In funzione delle consistenti variabili che coinvolgono la parte operativa e lacomponente microbiologica, nessuna delle caratteristiche delle prestazionisopra specificate pu essere considerata una costante metodo-specifica.

    Si ritiene che la validazione secondaria debba essere correlata ai risultati falsipositivi, a meno che non si rilevi un valore di sensibilit inferiore a quellospecificato.

    9.2.2Selettivit

    La selettivit del metodo microbiologico definita in questo DocumentoTecnico come valore logaritmico delle frazione delle presunte colonie tipichericercate (presunte positive) sul totale:

    F= lg [(a + c)/n].

    In alcuni tipi di campioni o durante alcune stagioni la selettivit pu risultarecos bassa da impedire un conteggio attendibile. Il limite superioredellintervallo dei risultati influenzato i modo significativo dalla selettivit.

    La selettivit presunta di seguito definita un livello di selezione utilizzatoper convenienza. Se sono disponibili delle risorse, il valore reale dellaselettivit, verificato su conteggi di campioni sicuramente positivi, rappresentalapproccio scientifico migliore. Difficolt di tipo economico possono limitare ilsuo utilizzo per il confronto definitivo fra metodi diversi.

    La selettivit varia in modo considerevole sotto linfluenza di fattori stagionali edi altre cause che possono modificare la concentrazione di un determinatomicrorganismo e della popolazione batterica concomitante. Non si tratta di unacostante dipendente dal metodo. Ciononostante la selettivit consente divalutare le prestazioni del metodo e pu essere di aiuto a scegliere fra diverse

    alternative. Dovrebbe essere studiati un numero rilevante di casi. Nondisponendo di criteri di scelta, non si dispone di parametri per decidere qualenumero specifico sia da considera sufficiente. Si dovranno produrre dati innumero adeguato per decidere quale soluzione adottare.

    9.3 Limiti operativi

    9.3.1Limiti inferiori di riscontro e di determinazione

    Il limite operativo inferiore una definizione che coinvolge tutti i tipi di metodo

    (consultare paragrafo 6). Questo dovrebbe essere espresso come il numero pibasso di colonie o particelle rilevabile con il sistema di rilevazione o piastreparallele.

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    9.3.2Limiti superiori

    Ogni metodo, in particolare ogni singola determinazione, possiede un limitesuperiore. Non si tratta di un numero chiaramente definito, ma di una zona

    indefinita nellambito del numero delle colonie dove i conteggi per piastradivengono eccessivamente incerti se riferiti ad una valida determinazione.

    Il limite operativo superiore di un rilevatore di colonie caratterizzato nel modoseguente.

    a) La sovradispersione dei conteggi paralleli pu divenire pi consistentee pi frequente. La condizione pu essere valutata con lausiliodellindice di dispersione di Poisson (Esempio B.3).

    b) I conteggi delle colonie a diluizioni differenti (volumi) non sonoconcordanti. La proporzionalit (linearit) viene a mancare. Laproporzionalit pu essere saggiata con metodi che si avvalgonodellindice G2 (allegato A, ed esempio B.4)

    La prova di proporzionalit (linearit) la pi efficace fra queste due. Entrambele condizioni possono essere valutate utilizzando una singola prova diproporzionalit, specificamente predisposta per questa valutazione (allegato C)[27,33] o ricorrendo a dati sui precedenti elementi con prove separate.

    9.4 Intervallo operativo con procedure MPN

    I limiti di valutazione superiore ed inferiore delle determinazioni MPN sonorappresentati da casi estremi quando una sola provetta del sistema dirilevazione risulta positiva o negativa.

    Lintervallo ritenuto applicabile per un sistema di rilevazione di 3 x 5 unit dirilevamento compreso fra 0.2 e 160 particelle per unit di volume (porzioneanalitica) della prima (ultima diluizione) delle serie, indipendentemente dal tipodi terreno di coltura o specifica popolazione microbica ricercata.

    9.5 Precisione

    9.5.1Generalit

    Ogni misurazione di tipo analitico dovrebbe essere correlata ad una valutazionedi precisione, anche se non risulta possibile determinare la stessa per ognisingola prova. E tuttavia di considerevole importanza la definizionegeneralizzata di precise indicazioni per i diversi metodi.

    In linea teorica, sarebbe opportuno che la validazione primaria potesse disporre

    di una valutazione di precisione per ciascun tipo di determinazione. Questapossibilit in microbiologia pu essere raggiunta in due modi. Il primo devetenere conto della dispersione totale, e di conseguenza, della validit della

    43

  • 7/22/2019 ISO-TR 13843 Ultimo

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    ISO/TR 13843:2000(E)

    distribuzione di Poisson, oppure della determinazione di una costante disovradispersione per via sperimentale.

    Le stime della precisione possono essere ottenute in due modi diversi che sonodefinite di tipo A e B (consultare il paragrafo 2) [5, 6].

    9.5.2Valutazione della precisione di tipo A


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