Università degli Studi di Roma Tor Vergata

Dipartimento di Biomedicina e Prevenzione

Sezione Medicina legale, Sicurezza Sociale e Tossicologia Forense

Dottoressa Valeria Ottaviano

Interpretazione dei risultati, refertazione

e trasmissione alla Procura della

Repubblica

TOSSICOLOGIA FORENSE

La tossicologia è, etimologicamente, la scienza che si occupa dei tossici e studia gli effetti avversi delle sostanze interagenti con gli organismi viventi

La tossicologia forense è la disciplina che studia gli agenti tossici in relazione al danno sull’uomo quando il fatto assume rilevanza giudiziaria

La terminologia “forense” impone una metodologia vincolata all’ottenimento di risultati “certi” poiché da essi possono conseguire sanzioni, anche gravi, nei confronti dei soggetti coinvolti

Nelle indagini con finalità forensi devono quindi essere utilizzate procedure validate che forniscano risultati tali da poter resistere ad ogni tentativo di confutazione

Compito del tossicologo forense non è solo quello dell’ottenimento di un dato quali/quantitativo attendibile ma, soprattutto, la sua interpretazione

• Conoscenze mediche (anatomia, patologia, tossicologia clinica)

• Farmacologia (farmacodinamica, farmacocinetica)

• Biochimica

• Chimica analitica

• Competenze legali

Procedura Analitica

Analisi di Screening: Test preliminare, immunochimico o colorimetrico, predittivo della

positività o negatività di un campione per una serie di sostanze o classi di sostanze ,

rispetto a valori di cut-off prestabiliti (Semi-quantitativi).

Analisi di Conferma Altrettanto sensibile ma più specifica, identifica singole sostanze

e/o metaboliti. Permette analisi qualitative e quantitative. L’analisi di conferma deve

essere effettuata per verificare gli eventuali «falsi positivi» o «falsi negativi» ottenuti con

l’analisi di screening

Cut-off: rappresenta il valore limite (soglia) di un test analitico. I valori di

concentrazione al di sotto o al di sopra di tale valore sono definiti, rispettivamente,

«negativi» o «non negativi» – definizione attualmente accettata al posto di «positivi»

I valori di cut-off per le analisi di screening sono determinati sperimentalmente dalle

ditte produttrici dei kit immunometrici mentre, per le analisi di conferma, sono valori

convenzionali (sempre di origine sperimentale) suggeriti dalle Linee Guida di associazioni

scientifiche. Oppure, come in questo caso, fissati da norme.

Intervallo di tempo investigabile

Sangue (ore)

Urine (giorni)

eroina (morfina) 6 2

Cocaina (beg) 2 (24) 2 - 4

cannabis 4 - 8 sporadico: fino a 15

cronico: oltre 30

benzodiazepine 6 - 36 Uso terapeutico: 3

Uso cronico: 30 – 45

metadone 24 4

amfetamine 12 - 24 1 – 4

minuti ore giorni settimane mesi anni

sangue

saliva

urina

urina ( THC )

capello

Scelta delle Matrici biologiche

Aria espirata

Alcolemia

Iniziamo dall’alcool etilico in quanto è la sostanza più frequentemente imputata di causare alterazione delle capacità di guida e perché le sanzioni applicate sono strettamente legate ai valori riscontrati nel sangue (esempio di cut-off normativo).

Curva di eliminazione dell’alcool

Misura dell’alcolemia su siero in ospedale

Metodo enzimatico Si basa sulla misura spettrofotometrica a 340 nm del NADH prodotto dalla seguente reazione: CH3CH2OH + NAD →CH 3CHO + NADH La reazione avviene in presenza dell’enzima alcool deidrogenasi (ADH). • L’enzima ADH trasforma l’alcool etilico in acetaldeide. Questa reazione andrebbe all’equilibrio in condizioni normali, ma la presenza di semicarbazide permette di sequestrare l’acetaldeide e la reazione arriva a completezza. La misura spettrofotometrica del NADH fornisce il dato quantitativo relativo all’etanolo (rapporto 1:1)

Vantaggi: facile, rapida, semiquantitativa

Svantaggi: non specifica, elevato rischio di cross-reazioni, deve essere effettuata sul SIERO, NON HA VALORE MEDICO-LEGALE

All Blood is not the Same: Whole Blood v. Serum/Plasma/Supernatant in BAC Analysis (May 2015)

• produced by the Traffic Resource Center for Judges, an initiative of the National Center for State Courts (NCSC)

• Legal Blood v. Medical Blood: What is the Difference?

• “Legal blood” is blood that has not been broken down into its solid and liquid components—it is whole.

• By contrast, “medical blood” is the result of separating whole blood into its solid and liquid components.

….. “found that disparity can be even higher, up to 20 percent higher, in serum-alcohol concentration than in whole blood-alcohol concentration”

Misura dell’alcolemia in ospedale

• Journal of Analytical Toxicology, Vol. 31, January/February 2007 (Barnhill et. Al.)

• Comparison of Hospital Laboratory Serum Alcohol Levels Obtained by an Enzymatic Method with Whole Blood Levels Forensically Determined by Gas Chromatography

• “Contrary to previously published conclusions, it was found that the serum/whole blood alcohol ratio (SAC/BAC) is concentration dependent, with average values ranging from around 1.12 to as high as around 1.18, depending on SAC, thus precluding a generally applicable SAC/BAC conversion factor.”

• Cfr. anche: Penetar et al. J. Anal.Toxicol. 32(1):505-510 (2008) – Rainey P.M. Clin. Chem. 39(11):2288-2292 (1993)

Misura alcolemia nel siero

"Linee guida per le strutture dotate di laboratori per gli accertamenti di sostanze d'abuso con finalità tossicologico-forensi e medico-legali su campioni biologici prelevati da vivente", […] "la determinazione dell'alcol etilico sui derivati del sangue (plasma, siero) produce una sovrastima (fino anche del 20%) rispetto alla sua determinazione su sangue intero e quindi non è idonea – ad esempio – per la valutazione dei limiti normati dal Codice della Strada; pertanto una determinazione alcolimetrica su plasma o siero può avere valenza esclusivamente diagnostico-clinica". GTFI Revisione n. 4 del 6 dicembre 2012

Perché in ospedale si usa il siero e non sangue intero? Per ridurre le interferenze con il metodo di rivelazione della reazione (detector) che è spettrofotometrico a 340 nm.

Perché tanta discrepanza di valori e perché solo in eccesso?

Principalmente perché il siero (o il plasma) è solo una parte del volume di sangue e, esprimendosi l’alcolemia come concentrazione (grammi/litro), se il volume diminuisce il suo valore aumenta. Secondariamente, perché, molte reazioni enzimatiche biologiche producono NADH

Misura alcolemia nel siero

Misura dell’alcolemia nel siero

Falsi risultati con metodo enzimatico ADH Etanolo + NAD Acetaldeide + NADH La reazione avviene in presenza dell’enzima lattico deidrogenasi (LDH) che trasforma l’acido lattico in acido piruvico producendo NADH. LDH Ac.Lattico + NAD Ac. Piruvico + NADH Se il pz è traumatizzato o epilettico o gli è stato somministrato Ringer Lattato, il valore dell’alcolemia è aumentato o, addirittura falsato.

Se la cute viene disinfettata prima del prelievo con presidi contenenti anche minime tracce di alcol.

ATTENZIONE alle UNITA’ DI MISURA

= 0,000011 g/l

Metodo gascromatografico con campionamento dello spazio di testa (GC-HS)

E’ la tecnica di elezione per la determinazione dell’alcool etilico nel sangue, in quanto, essendo una tecnica separativa permette l’identificazione e la misura diretta dell’analita nel sangue intero.

La tecnica prevede il desorbimento, per effetto della temperatura, dell’etanolo dalla matrice biologica acquosa (sangue, saliva, siero, urina, etc.) contenuta in uno spazio sigillato, la sua separazione cromatografica dagli altri eventuali volatili, l’uso di uno standard interno e la rivelazione con detector a ionizzazione di fiamma (FID) e/o spettrometria di massa.

La valutazione quantitativa deve essere effettuata per

confronto con una curva di calibrazione ad 8 punti :

0,0 – 0,3 – 0,5 - 0,8 – 1,0 – 1,5 – 2,0 – 3,0

• Vantaggi: specifica, quantitativa con affidabilità >99,0%, nessun rischio di cross-reazioni, può essere applicata a qualsiasi matrice, HA VALORE MEDICO-LEGALE .

• Svantaggi: richiede tempi più lunghi, strumentazione costosa, standard certificati, personale specializzato.

Gascromatografia dello spazio di testa (GC-HS)

Per queste sostanze né l’art. 187 C.d.S. né il DCA U00288 pongono limiti quantitativi.

Nella circolare applicativa del DCA, per il II livello sono specificate solo alcune delle possibili sostanze psicotrope che possono influenzare negativamente le capacità di guida:

6-m.a.m, morfina, codeina, metadone, EDDP, cocaina, b.e.g, THC e THCCOOH, MDMA, MDA, MDEA, amfetamina e metamfetamina.

Sono, ad esempio, esclusi molti farmaci con noti effetti negativi sulla guida: benzodiazepine, barbiturici, antistaminici, antidepressivi, antidolorifici (tramadolo), sedativi (zolpidem), buprenorfina.

Trattandosi di un decreto regionale, sarebbe opportuno armonizzare a livello nazionale almeno la lista delle sostanze (come per i lavoratori)

Sostanze psicotrope

Classificazione farmacologica delle principali droghe psicoattive

Deprimenti l’attività del

S.N.C

Stimolanti l’attività del

S.N.C

Psicodislettici o allucinogeni

Alcool etilico Cocaina

Cannabis

(hashish, marijuana)

Cannabinoidi sintetici

Narcotici (oppio,

morfina, eroina)

Amfetamina,

metamfetamina

LSD, mescalina,

psilocibina, scopolamina

Inalanti, solventi

organici Antidepressivi

MDA, MDMA, MDEA,

TMA, ecc.

Barbiturici

Benzodiazepine

Nicotina

Caffeina PCP

Metodi diretti di screening

Vantaggi: Limiti:

Nessuna manipolazione del campione

Sensibilità adeguata alla finalità dell’indagine

Specificità sufficiente

Bassi costi di esercizio

Possibile automazione

identificano gruppi analitici e non singole sostanze

possibilità di falsi positivi o falsi negativi

Non esistono test per tutte le sostanze di interesse tossicologico

NON HANNO VALORE MEDICO-LEGALE

Si basano sulla competizione di legame con l’anticorpo tra l’antigene Ag del campione in esame (analita da cercare) e l’antigene marcato Ag* (cioè lo stesso tipo di analita, aggiunto a concentrazione nota e marcato con un tracciante - iodio 125, fluoresceina, enzimi, ecc.) con un anticorpo (Ab) specifico con una concentrazione inferiore rispetto a Ag*+Ag

Nella letteratura scientifica internazionale sono riportati numerosi casi di

reazioni crociate, (falsi-positivi) ad esempio, tra:

kit amfetamine/metamfetamina e la ranitidina (p.a. anti-acido/

antiulcera) od il buflomedile (p.a. sistema cardiovascolare)

kit oppiacei e l’ofloxacina (principio attivo antibiotici)

kit cocaina e l’acqua tonica (!)

kit metadone e la quetiapina (neurolettico/antipsicotico)

kit per i cannabinoidi ed il ketorolac (principio attivo del farmaco

antidolorifico Toradol) o il ketoprofene (principio attivo del farmaco

antiinfiammatorio Oki).

Metodi di Screening e di Conferma per le sostanze d’abuso

Veri, falsi-positivi

Caso Tachidol: p.a. antidolorifico contenente codeina

Caso Selegilina: p.a. anti-Parkinson che metabolizza a L-metamfetamina e L-amfetamina

Caso panino con semi di papavero: metaboliti morfina e codeina

Caso Paracodina: p.a. diidrocodeina, oppiaceo non previsto tra le conferme

Metodi di Screening e di Conferma per le sostanze d’abuso

La cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa consente l’identificazione delle molecole per mezzo di due parametri caratteristici di ciascuna molecola: il tempo di ritenzione (Rt) e lo spettro di massa

Metodi di Screening e di Conferma per le sostanze d’abuso

Nella modulistica indicativa allegata al DCA il campione di urina non entra nella catena di custodia, probabilmente per una svista.

Il confronto analitico tra sangue ed urina, specie nella fase di analisi di conferma è invece molto importante e, a volte, dirimente:

• Tempi del prelievo ematico dopo l’incidente (Pk di eliminazione sostanze)

• Somministrazione iatrogena di farmaci o medicazioni tra l’incidente ed il prelievo

UTILITA’ DEL CAMPIONE DI URINA

• 5.1 ITER PROCEDURALE

• Visita medica

• L’operatore sanitario delle strutture pubbliche, cui viene richiesta la valutazione clinica deve compilare la «Scheda di Esame Clinico per la Valutazione dello Stato di alterazione psico-fisica da Sostanze Stupefacenti e/o Psicotrope», che deve essere allegata al referto sanitario.

• Quest’ultimo deve comprendere anche l’esito degli esami eseguiti e deve essere trasmesso all’organo di polizia che ha richiesto gli accertamenti.

Decreto del Commissario ad Acta 27 settembre 2016, n. U00288 06/10/2016 - BOLLETTINO UFFICIALE DELLA REGIONE LAZIO - N. 80