INFEZIONE CRIPTICA DA LEISHMANIA INFANTUM

IN PIEMONTEAspetti clinico-epidemiologici

A. BiglinoUniversità di Torino

Scuola di Medicina - Polo “S. Luigi Gonzaga”

Bergamo, 7 giugno 2014

LEISHMANIACaratteristiche del parassita

PROMASTIGOTE

Mobile

Insetto

Intestino (epitelio)

AMASTIGOTE

Immobile

Mammifero

Monociti-macrofagi

•Roditori•Criceti•Pipistrelli•Porcospini•Opossum

•Bradipi•Primati•Cani•Volpi•Formichieri

Genere LeishmaniaOspiti e serbatoi di infezione

UOMO

FORME CLINICHE di Leishmaniosi umana

VISCERALE

Letale > 90%

Sistema R-E

Milza, Linfonodi

Midollo emopoietico

Fegato

CUTANEA LOCALIZZATACute, aree circoscritte, stabili

Autolimitantesi, o stabile nel tempo

CUTANEA DIFFUSACute, diffusa, progressiva (noduli)

MUCO-CUTANEACute e mucose (volto)

Destruente, progressiva

Manifestazioni cliniche di leishmaniosi umana

Leishmaniosi visceraleL. (L.) donovani ( vecchio mondo; Cina, Asia, India, Africa orient.)L. (L.) infantum ( vecchio mondo: Bacino del Mediterraneo;

nuovo mondo: Brasile )L. (L.) chagasi, amazonensis (America Latina in generale)

Leishmaniosi cutanea (localizzata e diffusa) del vecchio mondoL. (L.) major (Medio oriente, India, Pakistan, Africa, Asia)L. (L.) tropica (Litorale mediter., M.O, India, Pakistan, Africa AsiaL. (L.) aethiopica, L. arabica (Etiopia, M.O., Kenya, Somalia)

Leishmaniosi cutanea e mucosa del nuovo mondoL (L). mexicana, amazonensis, venezuelensisL. (V.) guyanensis, panamensis, peruvianaL. (V.) braziliensis: L. mucosa destruente sud-america (Espundia)

Leishmaniosi viscerale

Leishmaniosi viscerale

ciclo replicativo del parassita

Leismaniosi: risposta immune e controllo dell’infezione

Patogenesi della leishmaniosi viscerale

Reticoloendotelite sistemicaInteressamento di midollo osseo, fegato, milza, linfonodi,

tessuto linfatico associato all’intestino (GALT),interstizio polmonare

Nodulo cutaneo (inapparente)Diffusione al reticolo-endotelio

Attivazione risposta immunePrevalente “Th-2”

(IL-4, IL-10)Risposta preval. umorale

Mancato controllo infezioneIper globulinemiaImmunocomplessiCachessia (TNF-)

Prevalente “Th-1”(IL-2, IF-)

Risposta preval. cellulare (CD8)Rapida riduzione parassitemia

Controllo dell’infezioneDecorso pauci- asintomatico

Guarigione spontanea

LEISHMANIOSI VISCERALEDiagnosi (I)

QUADRO CLINICO E BIOUMORALE (sospetto diagnostico)

DIAGNOSTICA INDIRETTA (test immunologici)• Ipersensibilità ritardata: Leishmanina (LST)• EIA /Immunoprecip. (Ag estrattivi/ ricombinanti: rK39)• Agglutinazione diretta (DAT)• Immunofluorescenza indiretta (IFAT)• Immunoblotting (W-B) Ag 14 – 18 KDa

DIAGNOSTICA DIRETTA (amastigoti nel RE / sangue)• Puntura splenica (“gold standard”, ma rischiosa)• Aspirato / Biopsia midollare, Biopsia epatica• Emocolture, Colture tissutali• Amplificazione genica (PCR) su colture o tessuti

Leishmaniosi viscerale:mieloaspirato

• CARATTERISTICHE DEI METODI INDIRETTI– Sensibili e specifici (85-97%) nell’immunocompetente sintomatico– Titolo anticorpale declina lentamente (inutili nel follow-up terapeutico)– Scarsa sensibilità nell’immunocompetente con infezione criptica– Spesso negativi nell’infezione dell’immunocompromesso– W-B: elevata sensibilità (positivo per anni in soggetti esposti)

• CARATTERISTICHE DEI METODI DIRETTI– Puntura splenica: sensibilità >= 95% (anche forme paucisintomatiche)– Mieloaspirato: sensibilità 60-85%– Coltura da mieloaspirato: sensibilità 75%– PCR (minicricle kDNA, n-PCR, medRNA, rRNA) (sens. 80 – 100%)– RT-PCR (kDNA) (0,0125 parassiti /mL)

LEISHMANIOSI VISCERALEDiagnosi (II)

Mary C. J Clin Microbiol 2004; 42:5249Antinori S. Clin Infect Dis 2007; 44:1602

Storia naturaledella leishmaniosi viscerale

Clinicamente manifestaEsordio acuto / Esordio sub-acutoSempre presenti: anemia, leucopenia,

febbre, calo ponderaleepatosplenomegalia

Guarigione

PKDL

Morte

Guarigionespontanea

3%

Infezione: (tasso di attacco negli esposti a rischio: 44%)

AsintomaticaSplenomegalia isolataAmastigoti epato/splenici

Persistenzaamastigoti

Mesi (anni?)

LEISHMANIOSI VISCERALEQuadro clinico

•Incubazione variabile: 3 settimane - 2 anni•Febbre remittente non elevata•(Epato)-splenomegalia, adenopatie•Colorito terreo-grigiastro•Iperplasia midollo emopoietico•Leucopenia, anemia, cachessia•Iper- gammaglobulinemia•Morte per infezioni intercorrenti o emorragie

Casi confermati di leishmaniosi viscerale in Italia 1982-2012

Gramiccia M. et al. Eurosurveillance 2013 (Aug.):32-40

LEISHMANIOSI VISCERALEnell’immunocompromesso

SOGGETTI A RISCHIO:HIV (tutti gli stadi) anche fuori zona endemicaTrapiantati (spec. rene) in zona endemica

MANIFESTAZIONI CLINICHE COINFEZIONE Lv/HIV:Febbre 89%Cachessia 80%Epatomegalia 60%Splenomegalia <50% (può mancare!)Linfoadenopatie 25%Manifestazioni particolari:Infiltrati polmonari, pleuriti, entero-coliti, duodeniti, esofagiti

COINFEZIONE Lv/HIV• Dal 5 al 30% dei casi di Lv nel mondo sono co-infetti HIV

(overlap di aree ad elevata endemia)

• Francia, Italia, Portogallo, Spagna:– 1911 casi di coinfezione Lv/HIV 1996-2001– 299 casi 2001-2006

• Verosimile sottonotifica• In molti casi si tratta di recidive (problemi di sovrastima) • Spagna: 130 casi, di cui 80% infezioni primarie, 20%recidive

Arce A. et al. Euro Surveill. 2013;18(30)

• Brasile: – 500 casi di coinfezione Lv/HIV 2001-2005– 16.210 casi di Lv! (3%). Evidente sottonotifica

• Problemi diagnostici• Quadro clinico atipico (mancanza segni di flogosi)• Sierologie poco sensibili (60%) o negative (W-B, DAT più sensibili)• Diagnostica molecolare (PCR e RFLP)

WHO 5° consultative meeting on Leishmania/HIV coinfection, Addis Ababa, 2007

COINFEZIONE Lv/HIVSituazione immunologica al momento della diagnosi

MORTALITA’Pre- HAART*: 20% 1° episodio; sopravv. mediana 1 annoPost-HAART: <5% 1° episodio; sopravv. mediana 6 anni

(minore se CD4 < 200/L)

*(Highly Active Antiretroviral treatment)

WHO 5° consultative meeting on Leishmania/HIV coinfectionAddis Ababa, 2007

Casi di Leishmaniosi viscerale e coinfezione Lv/HIV in Italia

1986-2006

Dati ISS / Ministero della Salute

020406080

100120140160180200

1987

1988

1989

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

LV LV-HIV+

HAART

Caso clinico, 2003• Maschio, 53 anni, artigiano residente in comune collinare dell’Astigiano.

Anamnesi negativa. Non vacanze al mare. Da novembre 2002 febbre intermittente con sudorazioni, brividi e calo ponderale (5 Kg in 6 mesi ).

• Un cane del paziente, nato presso allevamento locale, sempre vissuto al domicilio del paziente, era deceduto nell’estate del 2001 dopo malattia protratta con scadimento delle condizioni generali e cachessia.

• Emocromocitometrico, funzione epatica e renale nella norma – (GB 4050/L; Neut 51%, Hb 12.3 g/dL; Creat 0,9; AST 33, ALT 34 ALP 271;

Albumina 4.1 g/dL; PT= 75%) ipergammaglobulinemia (38.5% - 40%).

IFAT: 1/1280W-B positivoMidollo: NEGColture: NEG

Leishmaniosi viscerale subclinicabiopsia epatica

Caso Z. Malattie Infettive, Asti

Leishmaniosi viscerale autoctona in Piemonte ?

• Il Nord-Italia era all’epoca considerato tra le aree prive di rischio di trasmissione, con bassa incidenza di casi non autoctoni contratti in zone tradizionalmente a rischio (aree costiere e pre-appenniniche dell’Italia centro-meridionale, coste mediterranee francesi e spagnole, isole del Mediterraneo ecc).

Ph.perniciosusPh.perfiliewiPh.ariasi

Anni ‘60 – inizio ‘70(Biocca, Coluzzi, Costantini) 

Ph.neglectusPh.ariasiPh.perfiliewiPh.perniciosus

Anni 2000

Leishmaniosi viscerale: il vettore

Distribuzione potenziale dei vettori di CanL nel Nord Italia

Fonte: Ferroglio E., Fac med, Veterinaria, Torino

2003: studio pilota su 100 donatori nel comune di residenza e comuni limitrofi

Studio su diffusione di flebotomo e sieroprevalenza canina nell’ Astigiano

Primo caso autoctono accertato di leishmaniosi viscerale 

nell’Astigiano

Riscontro di una sieroprevalenza (WB) pari al 4.9% nel territorio dell’Astigiano

Tra il 2004 e il 2007 i casi di LV ufficialmente riportati in Piemonte ammontano a 14 mentre

una ricerca da noi svolta sulle SDO ha individuato 35 casi con diagnosi alla dimissione di Leishmaniosi viscerale

Successivo riscontro di alcuni casi autoctoni di leishmaniosi viscerale umana

in alcuni comuni dell’Astigiano

Le tappe successive…

Stimare la prevalenza di infezione asintomatica nella popolazione generale dell’area interessata

con diverse metodiche

Confrontare i ceppi di Leishmania presenti nella popolazione canina e umana (RFLP)

Possibile applicazione di tecniche immunologiche in vitro per la diagnosi di infezione asintomatica

Estendere lo studio di prevalenza a livello regionale

Leishmaniosi autoctona nell’Astigiano ?

526 soggetti randomizzati da liste dei MMG

COMUNI:Asti, Azzano, Belveglio, Castello d’Annone, Cerro tanaro, Incisa, Masio, Mongardino, Montegrosso, Quarto, Refrancore, Rocca, Rocchetta Tanaro, S. Stefano, Valenzani,

Vigliano, Vinchio,

2006: Studio di sieroprevalenzasulla popolazione generale

• RISULTATI:

– 21 positivi ELISA 1– 39 positivi W-B 21– 7 positivi entrambe 3

TOTALE: 53

SIEROPREVALENZA: 10% (7,4% con W-B)PARASSITEMIA: 4,2% (54% dei W-B+)

22 positivi in PCR:

FATTORI ASSOCIATI A POSITIVITA’

Sieroprevalenza e età

INFEZIONE DA L. infantum IN EUROPAStudi di sieroprevalenza umana

• Spagna: 4 – 8%• HIV+ 60% (costa mediterranea / Baleari)• Donatori: 7,6% (Baleari) (W-B)

Riera C Trans Roy Soc Trop Med Hyg 2004; 98:102-10Garrote JI. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2004, 71(4), 403-406

• Italia:• Sud / isole: (Sicilia): 0% -1% (ELISA / IFAT)

Colomba C. Transf Apher Sci 2005; Scarlata F. Trans Royal SocTrop Med Hyg 2008

• Piemonte (Astigiano): 6% (W-B)Ferroglio E, Biglino A et al Parassitologia 2006

Presenza di anticorpi anti-Leishmania in soggetti sani:Infezione pregressa? Infezione criptica in atto?

Portatori asintomatici tra i donatori di sangue

2008 - Studio multicentrico piemontese:prevalenza di infezione criptica in donatori

Popolazione asintomatica di donatori AVIS

Sono stati sinora valutati 1113 soggetti rientranti nello studio

Soggetti risiedenti in 5 aree con elevata sieroprevalenza canina, accertata

presenza del vettore e casi recenti di LV

PineroloValle di Susa

Casale MonferratoIvreaAsti

Ad ogni partecipante è stata richiesta:

• la compilazione di un questionario

• la compilazione di un consenso informato

SessoEtà

ProvenienzaResidenza precedenteLocalità di vacanze

HobbyAttività lavorativa

Contatto con animali

Popolazione,

204 WB-positivistudiati mediante PCR

Risultati

1106 soggetti testati mediante WB

Positivi204 soggetti

Negativi902 soggetti

16.4%

Positivi138 soggetti

Negativi68 soggetti

67.6%

Possibili fattori di rischio (I)• Sesso: N. Pos WB %

– Maschi 773 149 19– Femmine 318 53 17

• Età: – <45: 568 101 18– >44: 521 100 19

• Residenza– Pinerolo 169 36 21– Susa 145 32 22– Ivrea 204 46 23– Casale 193 26 13– Asti 395 64 16

Possibili fattori di rischio (II)• Residenza Precedente N° Pos %

– Zona a rischio in Italia / estero 199 41 28– Zona non a rischio in Italia /estero 61 11 18– Da sempre nell’area studiata 845 152 18

• Attività ricreative – A rischio* 688 135 20– Non a rischio 418 69 16

• Vacanze negli ultimi 5 anni– Mai 282 50 18– In zone a rischio 765 144 19– In zone non a rischio 59 10 17

*camping, pesca, caccia, escursionismo

Possibili fattori di rischio (III)• Attività lavorativa N. Pos %

– Non a rischio* 865 144 17– A rischio° 181 47 26

• Contatto stabile con animali– Si 254 50 20– No 847 152 18

• Possesso cani– Si 625 122 20– No 473 80 17

*Artigiano/ commerc., dip pubblico/privato, professionista°Agricoltore, Allevatore, Casalinga, senza occupazione, altro

Variabili χ2 Valore di p O.R. I.C.95%

Sesso (M vs F) 0.595 0.440 1.13 0.59‐1.2

Età (> 44 anni) 0.094 0.758 1.09 0.8‐1.5

Provenienza 8.22 0.004 0.64 0.47‐0.86

Residenza Precedente (zonanon a rischio vs zona a rischio)

1.296 0.522 0.87 0.6‐1.2

Vacanze negli ultimi 5 anni 0.009 0. 923 0.89 0.5‐1.8

Attività ricreative 1.160 0.281 1.23 0.9‐1.7

Attività lavorativa(a rischio vs non 

a rischio)8.7 0.003 1.8 1.2‐2.5

Contatto con animali 0.674 0.411 0.9 0.6‐1.3

Possesso cani 0.138 0.709 1.2 0.9‐1.6

Associazione con possibili fattori di rischioWestern Blot

3.41 1.29-9.01

Variabili χ2 Valore di p

Sesso (M vs F) 1.106 0.292

Età (> 44 anni) 0.323 0.569

Provenienza (AT‐Casale) 7.67 0.006

Residenza Precedente (zona a rischio vs zona 

non a rischio)0.814 0.665

Vacanze negli ultimi 5 anni 0 .125 0.722

Attività ricreative 0.004 0.946

Attività lavorativa(a rischio vs non a rischio)

6.604 0.010

Contatto con animali 0.705 0.400

Possesso cani 1.017 0.313

PCROR IC 95%

0.58 0.4‐0.85

80.73%64.28%

35.72%19.27%

Eporediese

78.32%61.11%

38.89%21.68%

Pinerolo

86.53%87.5%

12.5%13.47%

Casale Monferrato

87.66%

92.85%

7.15%12.34%

Astigiano

77.7%

78.57%

21.43%22.30%

Bassa Val di Susa

PCR positiviWB negativi WB positivi PCR negativi

Associazione con possibili fattori di rischio

Leishmaniosi viscerale in immunodepressioni non-HIV correlate (I)

• Trapianti di organo solido:– 80 casi di Lv dopo trapianto di rene, fegato, cuore

• Trapianti di midollo

• Terapie immunosoppressive– Anti- CD20 (Rituximab)– Anti-TNF (Infliximab, Adalimumab)

Antinori S. Lancet Infect. Dis. 2008Campos-Varela I. Liver Transpl 2008Basset D. Microb Infect 2005

Sirvent A. Bone Marrow Transpl 2004Sabbatini M. Transplantation 2002

Pizzorni C. Reumatismo, 2007Tektonidou Clin Rheumatol 2008

• Leishmaniosi viscerale e anti-TNF:– 19 casi in letteratura nel periodo 2004-2011

• 2/3 dei casi nel periodo 2010-2011)• 14/18 da regioni endemiche del sud-Europa

– 18/19 casi trattati con Adalimumab (Humira);– un solo caso con Etanercept (Enbrel)

SCREENING PER INFEZIONE CRIPTICA?CON QUALE TEST?

Leishmaniosi viscerale in immunodepressioni non-HIV correlate (II)

• Immunosoppressione prolungata:RITUXIMAB (anti-CD20) Trattamento Linfomi B-cellEffetto soppressivo sino a 1 anno post-terapia

Leishmaniosi viscerale in immunodepressioni non-HIV correlate (III)

Rituximab e Leishmaniosi viscerale autoctona

• Paziente 70enne residente nell’Astigiano (no cani)• Mai soggiorno in zone endemiche negli ultimi 10 aa• 2003: Dx Linfoma follicolare: CNOP + Rituximab• 2006: Recidiva: FND + Rituximab.• Neutropenia febbrile . Emocolture negative• Sfebbramento con LAmB• 2008: febbre, linfopenia T, pancitopenia• BOM: amastigoti*• IFAT, WB, NNN: Negativi. PCR positiva• Sfebbramento con LAmB• 2009: febbre, diarrea. BOM: amastigoti#

• Decesso (shock settico) nonostante LAmB

*

#

Leishmaniosi visceralepost- trasfusionale

• Presupposti teorici: – Sopravvivenza di amastigoti in monociti sino a 30 gg a +4°– Trasmissione possibile in pz. recettivi: immunodepressi, neonati– Positività di donazioni in aree ad alta endemia:

• 6 % PCR, 0,6% coltura, 11% DTH. Riera C. Transfusion 2008; 48

12 case-reports in Paesi ad alta endemia sino al 2006 (alcuni risalenti a ≥40 aa orsono), senza dimostrazione molecolare di identità di stipite. Dey A., Singh S. Ind. J. Med. Microbiol. 2006; 24 (3): 165

• Nelle emazie deleucocitizzate viene meno il presupposto teorico– 100% dei campioni PCR-positivi negativizzati dopo leucodeplezione (Riera, v. s.)

• Possibile screening su donazioni a soggetti altamente recettivi– No test basati su anticorpi; ideale PCR per sensibilità e specificità

Screening per infezione cripticada L. infantum?

• Screening di popolazione:– generalmente poco utili a fronte dei costi elevati

• Screening mirati su popolazioni a rischio:– Efficaci (riduzione del rischio) e efficienti

• Quali candidati allo screening? – Candidati a trapianto di OS / midollo– Candidati a terapie fortemente immunosoppressive– Donatori di sangue (NO) / organi (rischio elevato)

• Quale / quali tests diagnostici?– Sierologia (W-B, DAT, ELISA)? LST? Coltura? Test molecolari?

Non solo forme viscerali…Leishmaniosi cutanea centro-sudamericana:interessamento linfonodale. E nel sangue??

Yucatan, ott. 2012- Asti, ott. 2013