Tesi di Laurea

FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA

Corso di laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico

IL CONTROLLO QUALITÀ NELLA

PRODUZIONE FARMACEUTICA

INDUSTRIALE: APPLICAZIONE DI UNA

METODICA PER L’ANALISI DEI

PROBIOTICI VALIDATA DALL’ISTITUTO

SUPERIORE DI SANITÀ

Relatore: Dott. Renzo Peressoni Correlatore: Dott. Franco Del Bianco Laureando: Luca Michelutti

CENNI STORICI

1892 Döderlein propone l’uso di lattobacilli nelle

infezioni vaginali

1900 Henry Tissier isola bifidobatteri da feci di neonati

allattati

1907 Metchnikoff teorizza l’uso di batteri utili nel

rimpiazzo di batteri dannosi nell’intestino umano

1917 Nissle tratta salmonellosi e shigellosi con un ceppo

di Escherichia coli non patogeno

Ad oggi numerosi sono i microrganismi batterici e non

definiti probiotici, e il numero è continuamente in

crescita

DEFINIZIONE

Microrganismi vitali che, somministrati

in quantità adeguate, apportano

benefici alla salute dell’ospite

(FAO/WHO, 2002)

IL MICROBIOTA INTESTINALE

L’apparato gastroenterico è colonizzato da 1013-1014 cellule

batteriche, con oltre 500 specie complessivamente

Oltre a batteri sono presenti

anche archeabatteri,

eucarioti e virus

Fornisce diversi contributi:

Attività metaboliche

Funzioni trofiche

Funzione protettiva

MICRORGANISMI PROBIOTICI

Un probiotico deve essere:

Sicuro per l’uomo

Vitale ed efficace nell’intestino umano

Conferire benefìci fisiologici

ALCUNI MICRORGANISMI PROBIOTICI

Bifidobacterium spp

Sono microrganismi

Gram-positivi, a morfologia

bastoncellare, anaerobi. Si

trovano in diverse nicchie

ecologiche tra le quali vi è

l’intestino umano.

Lactobacillus spp

Sono microrganismi Gram-positivi,

anaerobi facoltativi o microaerofili,

a morfologia prevalentemente

bastoncellare. Sono presenti anche

nell’uomo, soprattutto nel tratto

gastrointestinale e nel tratto

genitale femminile.

Si suddividono in base alle loro

caratteristiche in: omofermentanti

(L. acidophilus), eterofermentanti

facoltativi (L. paracasei) ed

eterofermentanti obbligati (L. reuteri)

Bacillus coagulans

È un microrganismo

Gram-positivo,

anaerobio tollerante,

sporigeno.

È una specie

ubiquitaria in natura

IL RAPPORTO ISTISAN 08/36

MATERIALI E METODO DI LAVORO

Prelievo e campionamento

Identificazione genetica

Conta batterica probiotica

Conferma genetica e conta differenziale

Controllo microbiologico

Carica totale, carica di lieviti e muffe, carica di

enterobatteri.

Presenza di Staphylococcus aureus, Escherichia coli e

Salmonella.

RISULTATI

Reagenti di PCR Concentrazione finale

H2O distillata sterile ----

Buffer 10X 1 X

MgCl2 25 mM 1,5 mM

dNTPs 2,5 mM 0,2 mM

Primer senso 100 µM 0,5 mM

Primer antisenso 100 µM 0,5 mM

DNA Da 1 µL a 5 µL

Taq DNA polymerase 5U/µL 1,25 U

Volume finale di 50 µL

Specie Primer Ciclo

iniziale

Denatu-

razione

Annealing Estensione Cicli

totali

Ciclo

finale

B.

coagulans Spo3 +

Spo4

95°C x

5 min

95°C x

1 min

65°C x 1

min

72°C x 1

min

30 72°C x

10 min

Bifidobac-

terium spp BifidF

+

BifidR

96°C x

2 min

94°C x

30 sec

63°C x

40 sec

72°C x 30

sec

35 72°C x

5 min

L.

acidophilus Idlc4F

+

Idl22R

94° C x

2 min

94°C x

20 sec

51°C x

40 sec

68°C x 30

sec

35 68°C x

7 min

L.

paracasei W2 +

Y2

94°C x

3 min

94°C x

45 sec

50°C x

45 sec

72°C x 1

min

45 72°C x

5 min

RISULTATI

Microrganismo Terreno

di

coltura

Condizioni

di

incubazione

Temperatura

di

incubazione

Tempo di

incubazione

Bifidobacterium

spp. MRS Anaerobiosi 37°C 72 h

HHD Anaerobiosi 37°C 72 h

Lactobacillus

acidophilus MRS Anaerobiosi 37°C 72 h

HHD Anaerobiosi 37°C 72 h

Lactobacillus

paracasei MRS Anaerobiosi 37°C 72 h

HHD Anaerobiosi 37°C 72 h

RISULTATI

Microrganismo Terreno

di coltura

Condizioni di

incubazione

Temperatura

di incubazione

Tempo

di incubazione

Bacillus coagulans

TSA Aerobiosi 37°C Almeno 24 h

Nutrient

Agar

Aerobiosi 37°C Almeno 24 h

GYE Aerobiosi 37°C Almeno 24 h

TSA Aerobiosi 44°C Almeno 24 h

Nutrient

Agar

Aerobiosi 44°C Almeno 24 h

GYE Aerobiosi 44°C Almeno 24 h

TSA Aerobiosi 50°C Almeno 24 h

Nutrient

Agar

Aerobiosi 50°C Almeno 24 h

GYE Aerobiosi 50°C Almeno 24 h

RISULTATI

Brodo di coltura Specie

HHD Bifidobacterium spp.

Lactobacillus spp.

MRS Lactobacillus spp.

TSB Bacillus coagulans

CONCLUSIONI

Aspetti positivi del metodo

Facilità d’utilizzo

Applicabilità per numerosi prodotti commerciali

Limiti del metodo

Tempi lunghi di analisi e metodiche superate

Protocolli non sempre adatti

Assenza di indicazioni per nuove specie

probiotiche