L’identificazione delle colonie viene eseguita

ricorrendo a colture pure derivate da ciascun tipo di colonia precedentemente

isolata e si basa sullo studio di alcuni caratteri:

ASPETTO COLONIE

CARATTERI MICROSCOPICI (morfologia e caratteristiche tintoriali)

CARATTERI BIOCHIMICI (fermentazione zuccheri; produzione di

prodotti metabolici peculiari; presenza/assenza di enzimi particolari)

CARATTERI ANTIGENICI

Identificazione dei microrganismi

– METODI FENOTIPICI -

Vocabolario per la descrizione

delle caratteristiche delle

colonie microbiche

Profilo

Piatto

Pulvinato

Convesso

A goccia

Umbonato

Irregolare

Infossato nel

mezzo

Crateriforme

Odore

Penetrante o assente: identificare

se possibile

Dimensione (espressa in

mm) Margine

Liscio (intero)

Ondulato

Lobato

Irregolare

Ciliato

Con ramificazioni

Lanoso

Filiforme

A riccioli

Forma

Rotonda

Rugosa

Concentrica

Irregolare ed invadente

Filamentosa

Forma L

Filiforme

RizoideComplessa

Superficie

Liscia, lucida

Rugosa

Opaca

Secca, polverosa

Consistenza

Butirrosa

ViscidaGranulare

Emulsificabilità

Facile o difficile in acqua

Forma o no sospensioni uniformemente torbide

Forma sospensioni granulari

Non emulsificabile

Colore

Presenza di pigmento solubile del substrato

Presenza di pigmento insolubile nel substrato

Opacità

Trasparente

Traslucida

Opaca

L’identificazione delle colonie viene eseguita

ricorrendo a colture pure derivate da ciascun tipo di colonia precedentemente

isolata e si basa sullo studio di alcuni caratteri:

ASPETTO COLONIE

CARATTERI MICROSCOPICI (morfologia e caratteristiche tintoriali)

CARATTERI BIOCHIMICI (fermentazione zuccheri; produzione di

prodotti metabolici peculiari; presenza/assenza di enzimi particolari)

CARATTERI ANTIGENICI

Identificazione dei microrganismi

– METODI FENOTIPICI -

Diverse morfologie delle

colonie batteriche

Diverse morfologie delle

colonie di lievito

OSSERVAZIONE ALMICROSCOPIO

cellule sferiche (cocchi): diplococchi (in

coppia); streptococchi (aggregate in catene);

stafilococchi (aggregate a forma di grappolo);

micrococchi e sarcine (aggregate in tetradi);

cellule a forma di bastoncino singolo, in

coppia o in catena: batteri, diplobatteri,

streptobatteri;

cellule a forma di bastoncino corto, rigonfio

e con margini arrotondati: coccobacilli;

cellule a forma di bastoncino: ricurvo

(vibrioni); a spirale (spirilli).

Il microscopio è lo strumento che consente di osservareoggetti piccoli e vicini a forte ingrandimento.

MICROSCOPIO OTTICO

L’indice di rifrazione (I.R.) indica la misura di quanto una

sostanza sia capace di rallentarela velocità della luce; la direzionee l’ampiezza sono determinate

dagli indici di rifrazione dei due mezzi che formano l’interfaccia.

Quando un raggio luminoso passa da un mezzo ad un altro, si ha un fenomeno di rifrazione: cioé la direzione del raggio subisce una deviazione all’interfaccia dei due mezzi.

OBIETTIVO: Questa colorazione consente la suddivisione di tutti i batteri in due

categorie: i Gram+ e i Gram-.

PRINCIPIO: La diversa colorazione che assumono i batteri con questa tecnica dipende

dalle differenze esistenti nella loro parete cellulare. La parete dei Gram+ è costituita in

gran parte da uno spesso strato di peptidoglicano che non permette la decolorazione

della cellula batterica (colorata precedentemente con il colorante basico cristal violetto)

da parte del decolorante.

I Gram+ rimangono dunque colorati in violetto.

I Gram- hanno una parete multistratificata che, per la sua composizione chimica, risulta

permeabile all’agente decolorante. Questi batteri dunque si colorano con il colorante di

contrasto, la Safranina, assumendo una colorazione rosa.

Materiale occorrente:

✓Colture microbiche Gram+ e Gram –

✓Cristal violetto,

✓ Liquido di Lugol,

✓ Safranina,

✓ Decolorante alcool-acetone,

✓Olio da immersione

✓Vetrini portaoggetto e copri-oggetto;

✓ Anse,

✓Vaschetta per colorazione,

✓Spruzzetta acqua,

✓Pinza

✓Microscopio,

✓Becco bunsen

Procedimento

Prima fase: Fissazione e colorazione:

✓Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale batterico da una colonia isolata o da terreno liquido

✓Distendere il materiale su un vetrino dove era stata precedentemente messa una goccia di acqua distillata.

✓Lasciare asciugare a temperatura ambiente fino a completa evaporazione dell’acqua (essiccamento)

✓ Passare velocemente il vetrino, tenuto con una pinza sulla zona più calda della fiamma, per almeno tre volte (fissazione)

✓Colorare il preparato depositando, mediante una pipetta qualche goccia del 1° colorante (cristal violetto), lasciare agire per 1’

✓Lavare con acqua distillata e poi coprire con il liquido di Lugol e lasciare agire per 1’, lavare ancora con acqua

✓Decolorare con soluzione alcool-acetone e sciacquare immediatamente

✓Colorare con la soluzione di contrasto (safranina) per 1’, sciacquare accuratamente e asciugare il vetrino.

✓Dopo aver lavato abbondantemente con acqua asciugare delicatamente con della carta, senza strofinare

Seconda fase: Osservazione al microscopio:

✓Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino

all’obiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti.

...COLORAZIONE DI GRAM

Gram positivi Gram negativi

Fissazione

al calore

Cristal Violetto

Trattamento con iodio

(Liquido di Lugol)

Decolorazione con

alcool

Colorazione di contrasto

(safranina)

AL LAVORO....

Miscela di composti biologici o sintetici,

organici o minerali, capace di fornire un

ambiente adatto alla crescita di un

particolare tipo di microrganismo

Che cos’è un terreno di coltura?

9

Composizione dei terreni colturali

Il terreno di coltura deve fornire ai microrganismi tutte le

sostanze nutritive necessarie alla crescita, alla produzione

di energia e alla biosintesi dei metaboliti desiderati:

✓Fonti di carbonio

✓Fonti di azoto;

✓Sali inorganici;

✓Vitamine;

✓Altri fattori di crescita...etc.

In base allo stato fisico: Terreni LIQUIDI: componenti sciolti in acqua e sterilizzati. Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali (terreno alla patata) o vengono solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel)

Terreni di coltura - Classificazione

In base alla costituzione chimica: Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti come sali inorganici in composizione e quantità note. Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il batterio necessita sono presenti in quantità note.Terreni COMPLESSI: ignota l’esatta composizione chimica delle sostanze nutritive (estratto di carne di bue, cuore, cervello, ecc.). Comprendono la maggior parte dei terreni usati in laboratorio.

In base alla funzione: Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche.Terreni SELETTIVI: contengono sostanze

batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Utilizzati per l’isolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati. Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Usati per l’identificazione di specifici microrganismi.

Crescita su terreno WLN di microrganismi di interesse

enologico

Componente Quantità (g/L)

Estratto di lievito 4

Peptone 5

Glucosio 50

Potassio fosfato monobasico

(KH2PO4)

0.55

Potassio cloruro (KCl) 0.425

Calcio cloruro (CaCl2) 0.125

Magnesio solfato (MgSO4) 0.125

Cloruro ferrico (FeCl3) 0.0025

Manganese solfato (MnSO4) 0.0025

Verde di bromocresolo* 0.0022

Agar 15-20

Terreno WL Nutrient AgarComposizione

*Il verde di bromocresolo va sciolto in circa 10 mL di etanolo e poi aggiunto al mezzo: l’etanolo si disperderà con la sterilizzazione

Preparazione

Sospendere 80 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.

pH finale 5.5 ± 0.2.

Descrizione ed impiego

WL Nutrient Medium è il terreno raccomandato dal Wallertstein Laboratory per il controllo dei processi di fabbricazione della birra e in generale

dei prodotti delle fermentazioni.

Il verde di bromocresolo è un indicatore di pH che ha un punto di viraggio intorno a pH 5.0-5.5.

Su questo terreno crescono praticamente tutti i lieviti enologici e molti batteri acetici, mentre la crescita dei batteri lattici è stentata. Le colonie di

alcuni lieviti si differenziano agevolmente: i lieviti apiculati danno colonie piatte di colore verde intenso; i lieviti buoni fermentatori

(Saccharomyces, Torulaspora, Zygosaccharmyces),ma anche altre specie, danno colonie color crema, umbonate e di consistenza burrosa.

Candida stellata cresce con colonie a cupola/umbonate di colore verde più chiaro rispetto ai lieviti apiculati; Pichia anomala dà colonie azzurrine

o grigiastre, farinose o talvolta mucose; lieviti ossidativi (Pichia membranifaciens, Candida vini) danno colonie chiare o grigiastre, dall’aspetto

rugoso; Brettanomyces/Dekkera da colonie chiare a cupola a crescita lenta.

Le colonie di alcuni lieviti che producono molto acido acetico come i Brettanomyces/Dekkera o certi Zygosaccharomyces si circondano di un

evidente alone chiaro e tendono a perdere rapidamente vitalità per l’accumulo dell’acido. Per evitare questo problema si possono aggiungere al

terreno 40 g/L di calcio carbonato (CaCo3) per neutralizzare l’eccesso di acidità. Il carbonato di calcio, insolubile in acqua, mantiene opaco il

terreno, mentre i lieviti forti produttori di acido acetico sono circondati da un alone trasparente, dovuto alla reazione del carbonato di calcio con

l’acido acetico, che dà acetato di calcio (solubile in acqua e quindi trasparente) e acido carbonico, che si allontana dal terreno come CO2, e le

colonie possono crescere fino a maggiori dimensioni.

Componente Quantità (g/L)

Estratto di lievito 10

Peptone 20

D-Glucosio 20

Agar 15Preparazione

Pesare 10g di estratto di lievito, 20g di peptone, 20g di D-glucosio e 15g

di agar (solo nel caso di terreno solido) e risospendere in 1000 ml di

acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione ed

autoclavare a 121°C per 15 minuti.

Descrizione ed impiego

L’estratto di lievito è ottenuto dall’idrolisi di cellule di lievito ed è fonte

di precursori di nucleotidi e vitamine.

Il peptone è una fonte di amminoacidi in quanto è ottenuto dalla

digestione parziale di proteine contenute nel latte o nella carne animale.

Il D-glucosio o destrosio è la fonte di carbonio.

Questo terreno è comunemente usato per il mantenimento delle colture

di collezione, per gli isolamenti e per i conteggi.

Terreno YPDComposizione

Fasi delle operazioni per la preparazione dei terreni di coltura

AL LAVORO....

Pesare esattamente i componenti secondo la ricetta;

Aggiungere acqua distillata nella misura richiesta;

Sciogliere gli ingredienti riscaldando fino a 40-50°C per i terreni liquidi e fino all’ebollizione per i terreni contenenti

agar;

Dispensare il terreno in bottiglie o in provette munite di tappo;

Sterilizzare in autoclave a 121°C (1 atmosfera di sovrapressione) per 15 minuti, in modo da eliminare tutti i

microrganismi, sporigeni e non, contaminanti. Alcuni terreni nutritivi contengono sostanze che sono alterate da

trattamenti termici drastici come la sterilizzazione. Per questi terreni è sufficiente riscaldare fino ad ebollizione oppure

sterilizzarli per filtrazione;

Aggiungere al terreno sterile e raffreddato a 45-47°C gli eventuali supplementi selettivi sterili.

Dopo sterilizzazione i terreni agarizzati possono essere dispensati in piastre di Petri sterili.

Pastorizzazione vs Sterilizzazione

PASTORIZZAZIONE: Attualmente la pastorizzazione è ottenutamediante un trattamento che si realizza condiverse combinazioni tempo-temperatura, edin particolare: temperatura elevata per unbreve periodo (High temperature Short Time -75-85 °C per 10-15 secondi), usataprevalentemente per latte e derivati,temperatura moderata lungo periodo (LowTemperature Long Time - 60-65 °C per 30minuti), usata prevalentemente per vino ebirra. Tali trattamenti hanno l’obiettivo didistruggere tutti i microrganismi patogeni eparte rilevante della flora microbica saprofita,con limitate alterazioni delle caratteristicheorganolettiche del prodotto.

72°C per 15 minuti

STERILIZZAZIONE:Questo trattamento, se efficacementeapplicato, è in grado di distruggere imicrorganismi, comprese le spore, edinattivare enzimi e tossine in grado didanneggiare la salute dei consumatorie/o alterare i prodotti confezionati. Letemperature impiegate nellasterilizzazione sono legate allecaratteristiche dell'alimento edipendono inoltre dalla pressione a cuila confezione è sottoposta durante iltrattamento termico.

121°c per 15 minuti