I vantaggi delle colonne Agilent AdvanceBio SEC per le analisi biofarmaceuticheConfronto tra le colonne di diversi fornitori per una migliore qualità dei dati

Caratteristiche tecniche

IntroduzioneLa cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) è una tecnica standard per la determinazione dei valori medi della massa molare e viene spesso utilizzata per illustrare la separazione di biomolecole sulla base delle dimensioni. Nella SEC, l'efficienza della separazione dipende dalla fase stazionaria, mentre la fase mobile non dovrebbe avere alcun effetto. Di conseguenza, la scelta della colonna per una data biomolecola è di importanza fondamentale per la riuscita della separazione. In commercio sono disponibili diversi tipi di colonne SEC, caratterizzate da differenti dimensioni, porosità e dimensioni delle particelle. Le colonne Agilent AdvanceBio SEC integrano tecnologie all'avanguardia per l'analisi SEC. Le colonne sono state progettate e fabbricate da Agilent in modo da offrire la massima efficienza senza il rischio di degradazione durante l’analisi dei campioni o di ostruzione tra le particelle. L'esclusivo metodo di fabbricazione che prevede il controllo delle dimensioni dei pori, della struttura e del volume e quindi l'applicazione di un rivestimento polimerico idrofilo, garantisce picchi delle proteine puliti e con buona risoluzione.

Questa nota tecnica confronta le colonne SEC di diversi fornitori utilizzando una fase mobile di uso comune per la separazione di proteine standard, anticorpi monoclonali e di un anticorpo-farmaco coniugato (ADC). Lo scopo è identificare le differenze tra le prestazioni delle colonne tali da poter determinare effetti sulla qualità dei dati generati. Illustreremo i vantaggi esclusivi delle colonne AdvanceBio SEC per la separazione ad alta risoluzione di biomolecole per applicazioni biofarmaceutiche.

2

Materiali e metodiColonne7,8 × 300 mm

• Agilent AdvanceBio SEC 300 Å, 2,7 µm

• Altro fornitore A 200 Å, 3,5 µm • Altro fornitore B 450 Å, 3,5 µm • Altro fornitore C 250 Å, 5 µm• Altro fornitore D 250 Å, 4 µm• Altro fornitore E 300 Å, 3 µm

4,6 × 300 mm

• Agilent AdvanceBio SEC 300 Å, 2,7 µm

• Altro fornitore F 450 Å, 2,5 µm • Altro fornitore G 200 Å, 1,7 µm

Risultati e discussioneConfronto tra colonne SEC da 7,8 × 300 mm per metodi SEC-DAD affidabiliSeparazione di proteine standardLa Figura 1, che confronta la risoluzione ottenuta per uno standard di riferimento contenente sei proteine utilizzando colonne con diverse dimensioni dei pori, mostra chiaramente l'effetto della dimensione dei pori sulla risoluzione. Le proteine più grandi, la tireoglobulina e il relativo monomero, presentano una buona risoluzione con pori di 450 Å e 300 Å. Tuttavia, con il diminuire delle dimensioni dei pori, le proteine più grandi vengono escluse e la risoluzione peggiora. Mentre per le proteine più grandi la migliore risoluzione si ottiene con la colonna B da 450 Å e con la colonna E da 300 Å, entrambe le colonne producono picchi più larghi, il che rende la quantificazione di bassi livelli di aggregati più difficile e meno accurata. La colonna AdvanceBio SEC offre una migliore risoluzione per le biomolecole di peso basso, intermedio ed elevato, che è di importanza cruciale per la separazione della maggior parte di queste molecole (Figura 1). AdvanceBio SEC offre inoltre una maggiore sensibilità, picchi stretti e un minore volume d’eluizione.

Tabella 1. Condizioni cromatografiche.

Parametro Colonne SEC da 7,8 × 300 mm Colonne SEC da 4,6 × 300 mmFlusso 0,8 mL/min 0,4 mL/minFase mobile Tampone fosfato 150 mM, pH 7,0 Tampone fosfato 150 mM, pH 7,0Strumento Sistema LC quaternario Bio-Inert

Agilent serie 1260 InfinitySistema binario LC Agilent 1290 Infinity con DAD G1315D e cella a flusso Bio-inert (1.200 bar)

Volume di iniezione 5 µL 5 µLTCC Ambiente AmbienteRivelazione UV, 220 nm UV, 220 nmCampioni • Marcatori di peso molecolare proteici (aggregato di tireoglobulina, tireoglobulina,

IgG, albumina da siero bovino, mioglobina) e uracile come marcatore di permeazione totale

• Anticorpi monoclonali ad attività terapeutica (rituximab e trastuzumab)• Coniugato farmaco-anticorpo ad attività terapeutica

Figura 1. Confronto tra profili SEC di proteine standard mediante colonne SEC da 7,8 × 300 mm. Sono stati calcolati i valori della risoluzione tra le coppie di picchi 1 e 2, 3 e 4, 5 e 6.

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

mAU

0250500750

mAU

0250500750

mAU

0250500750

mAU

0250500750

mAU

0250500750

mAU

0250500750

2

34

5

61

2

3

4

5

61

2

34

5

61

23

4

5

61

23

4

5

61

23

4

5

61

Agilent AdvanceBio SEC, 2,7 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore A, 3,5 µm, 200 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore B, 3,5 µm, 450 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore C, 5 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore D, 4 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore E, 3 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

Rs = 1,44

Rs = 0,52

Rs = 2,0

Rs = 0,81

Rs = 0,97

Rs = 1,7Rs = 2,27

Rs = 4,90

Rs = 2,81

Rs = 1,77

Rs = 2,12

Rs = 1,86

Rs = 1,88

Rs = 3,70

Rs = 2,86

Rs = 3,49

Rs = 3,4

Rs = 5,59

N° identificativo picco1. Aggregati di tireoglobulina2. Tireoglobulina (662 kDa)3. IgG (150 kDa)4. BSA (66 kDa)5. Mioglobina (17 kDa)6. Uracile (112 Da)

3

Per valutare gli effetti delle dimensioni dei pori sulla separazione per un intervallo di marcatori proteici, sono state tracciate le curve di calibrazione corrispondenti a ciascuna colonna (Figura 2). Le molecole più grandi rispetto alle dimensioni dei pori vengono escluse, mentre le molecole più piccole penetrano nei pori, permettendo così di definire il limite di esclusione e l'intervallo di permeazione della colonna. La colonna SEC ideale permette di separare le biomolecole nella parte più lineare della curva di calibrazione. Quando abbiamo effettuato una valutazione delle colonne per la separazione di uno stesso intervallo di proteine, AdvanceBio SEC ha presentato una pendenza lineare e poco pronunciata nella maggior parte della curva di calibrazione. Queste prestazioni permettono una migliore separazione dei marcatori proteici nell'intervallo di peso molecolare compreso tra 662 kDa e 112 Da, a cui appartiene la maggior parte dei prodotti bioterapeutici basati su proteine.

Confronto tra i volumi dei poriNella SEC, la capacità del picco e la risoluzione sono determinate principalmente dal volume dei pori. Pori di maggiore volume permettono una migliore risoluzione in un più ampio intervallo di valori di peso molecolare. La Tabella 2 mostra i volumi dei pori, calcolati a partire dal punto di permeazione totale (uracile) e dal limite di esclusione (aggregati di tireoglobulina), per le diverse colonne. Rispetto alle altre colonne, AdvanceBio SEC presenta il maggiore volume dei pori (7,11 mL), quindi offre una migliore risoluzione e una maggiore capacità del picco.

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Log

PM

Volume d'eluizione (mL)

Volume d'eluizione (mL)

Curve di calibrazione per il confronto tra Agilent AdvanceBio SEC e le colonne A e B

Colonna Agilent AdvanceBio SEC, 300 ÅAltro fornitore A, 200 ÅAltro fornitore B, 450 Å

R2 = 0,9868R2 = 0,9538R2 = 0,8175

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

4 6 8 10 12 14

Log

PM

Curve di calibrazione per il confronto tra Agilent AdvanceBio SEC e le colonne C, D ed E

Colonna Agilent AdvanceBio SEC, 300 Å

Altro fornitore C, 250 ÅAltro fornitore D, 250 Å

Altro fornitore E, 300 Å

R2 = 0,9868

R2 = 0,9201R2 = 0,8862

R2 = 0,9123

Figura 2. Curve di calibrazione per proteine standard ottenute mediante diverse colonne SEC da 7,8 × 300 mm.

Tabella 2. Confronto tra i volumi totali dei pori delle colonne.

Colonna Volume dei pori (mL)7,8 × 300 mmAgilent AdvanceBio SEC 300 Å, 2,7 µm 7,11Altro fornitore A 200 Å, 3,5 µm 6,25Altro fornitore B 450 Å, 3,5 µm 4,57Altro fornitore C 250 Å, 5 µm 6,51Altro fornitore D 250 Å, 4 µm 6,70Altro fornitore E 300 Å, 3 µm 5,624,6 × 300 mmAgilent AdvanceBio SEC 300 Å, 2,7 µm 2,36Altro fornitore F 450 Å, 2,5 µm 2,06Altro fornitore G 200 Å, 1,7 µm 2,20

4

D presentano i fattori di risoluzione più elevati, pari rispettivamente a 2,37 e 2,41, per il monomero di trastuzumab e per il relativo aggregato. La colonna E, che il produttore dichiara essere in grado di separare proteine più grandi o dimeri e aggregati superiori di anticorpi, non è riuscita a risolvere l'aggregato, e non è stato possibile integrare il monomero e l'aggregato per determinare la risoluzione.

Separazione di anticorpi monoclonali ad attività terapeuticaLa Figura 3 mostra la migliore qualità dei dati ottenuti con la colonna AdvanceBio SEC 2,7 µm per la separazione del prodotto terapeutico trastuzumab. Il cromatogramma mostra i valori di risoluzione di diverse colonne per la separazione del monomero e degli aggregati. AdvanceBio SEC e la colonna

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

mAU

024

mAU

024

mAU

024

mAU

024

mAU

024

mAU

024

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

mAU

0500

1.000

mAU

0500

1.000

mAU

0500

1.000

mAU

0500

1.000

mAU

0500

1.000

mAU

0500

1.000

Agilent AdvanceBio SEC, 2,7 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

Rs = 2,37

Rs = 1,89

Rs = 1,70

Rs = 2,1

Rs = 2,41

Altro fornitore A, 3,5 µm, 200 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore B, 3,5 µm, 450 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore C, 5 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore D, 4 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore E, 3 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

Figura 3. Analisi di monomero e di aggregato di trastuzumab mediante colonne SEC da 7,8 × 300 mm.

5

Sono stati inoltre effettuati confronti tra le colonne per la separazione dell'anticorpo monoclonale ad attività terapeutica commerciale rituximab, in modo da mostrare le prestazioni delle colonne in situazioni reali. L'area evidenziata nella Figura 4 mostra la maggiore capacità di AdvanceBio SEC,

Figura 4. Confronto tra profili di rituximab utilizzando diverse colonne SEC da 7,8 ×300 mm.

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

min5 10 15

Agilent AdvanceBio SEC, 2,7 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore A, 3,5 µm, 200 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore B, 3,5 µm, 450 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore C, 5 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore D, 4 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

Altro fornitore E, 3 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

mAU

0100200300

mAU

0100200300

mAU

0100200300

mAU

0100200300

mAU

0100200300

mAU

0100200300

mAU

-1012

mAU

-1012

mAU

-1012

mAU

-1012

mAU

-1012

mAU

-1012

Ingrandimento

rispetto alle colonne A, B, C, D ed E, di risolvere aggregati e frammenti. Le dimensioni e il volume ottimali dei pori di AdvanceBio SEC offrono una migliore risoluzione, necessaria per la separazione di prodotti terapeutici monoclonali, dei loro aggregati e dei prodotti di degradazione.

6

con una fase mobile acquosa (tampone fosfato 150 mM), i picchi sono risultati simmetrici. Questo metodo ha dato inoltre la migliore risoluzione del monomero e dell'aggregato (Rs = 1,75), a indicare che non si ha interazione non specifica tra il farmaco idrofobico e la fase stazionaria (Figura 5). Inoltre, AdvanceBio SEC è stata in grado di separare e risolvere gli aggregati di ADC meglio delle altre colonne, il che ne dimostra l'idoneità per l'analisi di ADC e aggregati. La maggiore larghezza dei picchi prodotti dalle colonne di altri fornitori non soltanto compromette la sensibilità e limita la rivelazione di bassi livelli di aggregati, ma rende anche difficile l'integrazione dei picchi.

effetto, ma la maggiore viscosità della fase mobile e quindi la maggiore pressione possono compromettere il flusso o la durata della colonna. Può inoltre risultare compromessa l'integrità del campione, in quanto le sostanze organiche possono avere effetti sull'aggregazione del campione.

Come illustrato nella Figura 5, l'analisi di ADC effettuata utilizzando le colonne A, B, C, D ed E con fase mobile acquosa ha dato come risultato picchi di forma scadente, a causa dell'interazione non specifica tra il carico idrofobico e la fase stazionaria. Quando invece l'ADC è stato analizzato utilizzando AdvanceBio SEC

Separazione di coniugati farmaco-anticorpoL'analisi SEC di coniugati farmaco-anticorpo (ADC) richiede colonne con interazioni secondarie ridotte tra i carichi idrofobici e la fase stazionaria della colonna. La maggior parte dei metodi pubblicati per l'analisi SEC di ADC, eseguiti utilizzando fasi acquose, ha dato per risultato picchi di forma scadente e una separazione incompleta dell'aggregato rispetto al coniugato monomero. Questo effetto è dovuto all'interazione non specifica tra il carico idrofobico e la fase stazionaria. Si è dimostrato che l'aggiunta di modificatori organici corregge questo

min5 10 15

mAU

0

20

40

min5 10 15

mAU

0

20

40

min5 10 15

mAU

0

20

40

min5 10 15

mAU

0

20

40

min5 10 15

mAU

0

20

40

min5 10 15

mAU

0

20

40

Rs = 1,75

Rs = 1,11

Rs = 1,40

Rs = 1,28

Ingrandimento

min5 10 15

mAU

0200400600 Agilent AdvanceBio

SEC, 2,7 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

min5 10 15

mAU

0200400600 Altro fornitore A,

3,5 µm, 200 Å, 7,8 × 300 mm

min5 10 15

mAU

0200400600 Altro fornitore B,

3,5 µm, 450 Å, 7,8 × 300 mm

min5 10 15

mAU

0200400600 Altro fornitore C,

5 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

min5 10 15

mAU

0200400600 Altro fornitore D,

4 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

min5 10 15

mAU

0200400600 Altro fornitore E,

3 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

Figura 5. Confronto tra profili di ADC ad attività terapeutica utilizzando diverse colonne SEC da 7,8 × 300 mm.

7

Confronto tra colonne SEC da 4,6 × 300 mm per metodi sensibili Separazione di proteine standardLa Figura 6 confronta la risoluzione ottenuta per uno standard di riferimento contenente cinque proteine utilizzando la colonna AdvanceBio SEC 300 Å, 4,6 × 300 mm, 2,7 µm e le colonne F e G. La proteina più grande, l'aggregato di tireoglobulina (picco 1), è stata efficacemente risolta, con una migliore sensibilità e picchi più stretti rispetto alle altre colonne. Nel complesso, per marcatori di peso molecolare basso, intermedio ed elevato, AdvanceBio SEC offre una risoluzione migliore rispetto a quella della colonna F e confrontabile con quella della colonna G da 1,7 µm.

La curva di calibrazione di AdvanceBio SEC ha una pendenza minore e il valore del coefficiente di linearità è eccellente per una determinazione più accurata del peso molecolare (Figura 7). AdvanceBio SEC presenta inoltre un maggiore volume dei pori (2,36 mL), rispetto alla colonna F (2,06 mL) e alla colonna G (2,20 mL), quindi offre una migliore risoluzione e una maggiore capacità di picco. Inoltre, la colonna F richiede un maggiore tempo di analisi per risolvere lo stesso intervallo di marcatori. L'intervallo di permeazione della colonna (5,48 mL) inoltre è maggiore rispetto al volume della colonna (4,9 mL), il che suggerisce il verificarsi di una qualche interazione non specifica durante l'eluizione.

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0250500750

1.0001.2501.5001.750

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0250500750

1.0001.2501.5001.750

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0250500750

1.0001.2501.5001.750

380 bar

176 bar

174 bar

2

3

4

5

6

Agilent AdvanceBio SEC, 2,7 µm, 300 Å, 4,6 × 300 mm

Altro fornitore F, 2,5 µm, 450 Å, 4,6 × 300 mm

Altro fornitore G, 1,7 µm, 200 Å, 4,6 × 300 mm

Rs = 2,11

Rs = 2,52

Rs = 3,61

Rs = 2,20

Rs = 1,89

Rs = 1,44

Rs = 2,90

Rs = 4,10

1

2

3

4

5

61

2

3

4

5

61

N° identificativo picco1. Aggregati di tireoglobulina2. Tireoglobulina (662 kDa)3. IgG (150 kDa)4. BSA (66 kDa)5. Mioglobina (17 kDa)6. Uracile (112 Da)

Figura 6. Confronto tra profili di proteine standard mediante diverse colonne SEC da 4,6 × 300 mm. Sono stati calcolati i valori della risoluzione tra le coppie di picchi 1 e 2, 3 e 4, 5 e 6.

Figura 7. Curve di calibrazione per proteine standard ottenute con diverse colonne SEC da 4,6 × 300 mm.

1,52,02,53,03,54,04,55,05,56,06,5

1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0

Log

PM

Volume d'eluizione (mL)

Curve di calibrazione per il confronto tra Agilent AdvanceBio SEC e le colonne F e G

R2 = 0,9868R2 = 0,816R2 = 0,9716

Agilent Advance Bio SECAltro fornitore F, 450 ÅAltro fornitore G, 200 Å

8

Separazione di anticorpi monoclonali ad attività terapeutica La Figura 8 mostra la separazione dell'anticorpo monoclonale (mAB) trastuzumab nelle colonne da 4,6 × 300 mm. Il cromatogramma mostra i valori di risoluzione per la separazione del monomero e degli aggregati. AdvanceBio SEC presenta una risoluzione del picco del monomero confrontabile con quella della colonna F da 2,5 µm, 450 Å e con quella della colonna G da 1,7 µm, 200 Å. Inoltre, AdvanceBio SEC e la colonna F sono riuscite a individuare il trastuzumab degradato, evidenziato in blu, mentre la colonna G non è stata in grado di separarlo.

min5 10 15

mAU

0500

1.0001.5002.000

min5 10 15

mAU

0500

1.0001.5002.000

min5 10 15

mAU

0500

1.0001.5002.000

min4 6 8 10

mAU

02468

min4 6 8 10

mAU

02468

min4 6 8 10

mAU

02468380 bar

176 bar

174 bar

Agilent AdvanceBio SEC, 2,7 µm, 300 Å, 4,6 × 300 mm

Altro fornitore F, 2,5 µm, 450 Å, 4,6 × 300 mm

Altro fornitore G, 1,7 µm, 200 Å, 4,6 × 300 mm

Rs = 1,70

Rs = 1,71

Rs = 1,91

Figura 8. Analisi di monomero e di aggregato di trastuzumab utilizzando colonne SEC da 4,6 × 300 mm di diversi produttori.

9

aggregati e frammenti, consentendo separazioni affidabili ed efficaci. Per ottenere una migliore sensibilità, il metodo è stato applicato a una colonna da 4,6 × 300 mm e confrontato con i risultati di colonne da 2,5 µm, 450 Å e 1,7 µm, 200 Å, ottenendo nuovamente una migliore risoluzione. Inoltre, è possibile migliorare significativamente la risoluzione e la capacità di picco accoppiando due colonne in serie. Ciò è possibile solo con le colonne AdvanceBio SEC, che possono operare a pressioni inferiori. Infine, le colonne AdvanceBio SEC offrono una migliore forma dei picchi e una maggiore certezza nella risoluzione di monomeri di ADC e dei relativi aggregati usando una fase mobile acquosa, senza compromettere la durata della colonna e l'integrità del campione.

dimensioni inferiori a 2 µm. Quest'ultima richiede sistemi LC in grado di tollerare valori di contropressione elevati.

ConclusioniL'applicazione della cromatografia ad esclusione dimensionale per la caratterizzazione delle biomolecole ha un grandissimo potenziale. Le caratteristiche tecniche qui illustrate mostrano i diversi vantaggi per le analisi biofarmaceutiche offerti dalle colonne AdvanceBio SEC rispetto alle colonne SEC di altri fornitori. Per prima cosa abbiamo utilizzato le colonne da 7,8 × 300 mm per separare svariate proteine e monomeri, aggregati e frammenti di anticorpi monoclonali. I valori ideali di dimensioni e volume dei pori di AdvanceBio SEC offrono separazione e capacità di picco eccellenti per l'identificazione di monomeri,

Separazione di coniugati farmaco-anticorpo La Figura 9 mostra la separazione SEC di ADC mettendo a confronto diverse colonne da 4,6 × 300 mm. È evidente che, rispetto alle colonne F e G, AdvanceBio SEC presenta il fattore di risoluzione più elevato (Rs = 1,47) per il monomero di ADC e per il relativo aggregato. Le colonne F e G presentano picchi di forma scadente a causa dell'interazione tra i carichi idrofobici e la fase stazionaria della colonna. La colonna AdvanceBio SEC inoltre presenta una migliore forma dei picchi per il monomero di ADC e una migliore risoluzione per il relativo aggregato. Oltre alla migliore separazione di marcatori proteici, anticorpi monoclonali/ADC e dei relativi aggregati, AdvanceBio SEC opera a circa 176 bar, da confrontare con i 380 della colonna G di

Figura 9. Confronto tra la separazione di ADC utilizzando diverse colonne SEC da 4,6 × 300 mm.

Agilent AdvanceBio SEC, 2,7 µm, 300 Å, 4,6 × 300 mm

Altro fornitore F, 2,5 µm, 450 Å, 4,6 × 300 mm

Altro fornitore G, 1,7 µm, 200 Å, 4,6 × 300 mm

Rs = 1,47

Rs = 0,66

Rs = 1,07

min5 10 15

mAU

050

100150200250300

min5 10 15

mAU

050

100150200250300

min5 10 15

mAU

050

100150200250300

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

-202468

10

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

-202468

10

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

-202468

10

380 bar

176 bar

174 bar

10

11

www.agilent.com/chem

Le informazioni fornite possono variare senza preavviso.

© Agilent Technologies, Inc., 2015 Pubblicato negli Stati Uniti, 1 dicembre 2015 5991-6474ITE