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I materiali biologici per l’esame colturale: tipologia ed importanza di un corretto prelievo

Diagnostica Microbiologica delle Infezioni delle Basse Vie RespiratorieFirenze, 13 Marzo 2007

A. Raglio, A GrigisA.O. Ospedali Riuniti di BergamoU.O. Microbiologia e VirologiaDirettore Dott A. Goglio

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I temi

Il problema Il nemico L’importanza di un corretto prelievo I materiali biologici Criteri di idoneità

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IL PROBLEMA

La polmonite acuta è fra le prime sei cause di morte ed è la più comune causa di mortalità correlata a infezione(Mandell 99)

Tanti quadri cliniciTanti patogeniTanti materiali biologiciPoche diagnosiSolo nel 20-50% delle polmoniti comunitarie si riesce a raggiungere una diagnosi eziologicaMancanza di:- standardizzazione- test di riferimento (gold standard)

4

0

10

20

30

40

50

60

Rello 1996 Moine 1994 Feldman 1995

S. pneumoniae

H. influenzae

Legionella

Gram negativi

nessun patogeno

CAP: Principali patogeni isolati in corso di differenti studi di sorveglianza

%

28/01

5

IL NEMICO

28 Batteri28 Virus10 Funghi 2 Rickettsie 5 Mycoplasmi e Chlamydie 5 Parassiti

Mandell, Infectious Diseases, Fourth Edition

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I microbi del cavo orale

- Flora endogenadel cavo orale:

10 15

1. 0 00 0 0. 0 0 0.0 0. 0. 00 0 0

7

Flora naso-orofaringea

Opportunisti (raramente patogeni) - Str. - emolitici- S.coag.negativi- neisseriacee- Candide- Haemophilus spp- Actinobacillus spp- Anaerobi-………...

Normalmente non presenti:

- BGN (ferm. e non)

- Enterococchi

-…….

Ma nei pz intubati sì

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Flora naso-orofaringea

Patogeni (stato di portatore sano)

- S. aureus 35-40 %- N. meningitidis 5-15 %- S. pneumoniae 0-50 %- Haemophilus influenzae 5-20 %-………...

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Infezioni comunitarie

Infanti-bambini:-> 80% virali: Influenza, RSV, adenovirus,…..- altre: Haemophilus, S. pneumoniae, S.aureus

Adulti giovani:-> batteriche: M. pneumoniae

Adulti e anziani:- < 10-20% virali- altre: S. pneumoniae, Haemophilus, S.aureus

e BGN fermentanti e non

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Polmonite ospedaliera o nosocomiale

- La seconda I.O. per frequenza(27% di tutte le I.O.in TI)

- Prevalentemente batterica- S. aureus (MSSA)

- S. pneumoniae, H. influenzae

------------------------

- Enterobatteri - Bacilli GN non fermentanti - S. aureus (MRSA)

- Elevata mortalità

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VAP: agenti eziologici in base al tempoCDC Draft 2002

Early Onset Pneumonia EOP

E.coliKlebsiella sppProteus sppS.pneumoniaeH.influenzaeMSSA

Late Onset Pneumonia LOP

P.aeruginosaBGN con ESBLMRSAAcinetobacter spp……….

NON Multi R Spesso Multi R

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Immunodepressi per patologia di base

- Fibrosi cistica:- P. aeruginosa (spesso mucoso)- Alcaligenes spp- B. cepacia- S. maltophilia - S. aureus - H. influenzae (anche non b) e

S.pneumoniae- Aspergillus

- Micobatteri spp

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Il nemico

Occorre conoscerne:la patogenicità e i meccanismi di virulenzale caratteristiche colturali (esigenze

nutritive, l’atmosfera di crescita, i tempi di crescita) e la carica per distinguerlo fra la flora contaminante

i determinanti antigenicile sequenze identificativele sensibilità ad antibiotici e disinfettanti

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oppure meglio:L’importanza di una interpretazione corretta in base al prelievo

L’importanza di un prelievo corretto

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Contributo della microbiologia

Diversamente da altre indagini strumentali e di laboratorio, la richiesta di indagini microbiologiche presenta aspetti peculiari:

il tipo e la qualità del campione condizionano in modo assoluto i risultati dell'indagine microbiologica,

l'invio del campione al microbiologo sottintende la domanda: "C'è qualcosa nel campione che può contribuire alla diagnosi ed alla terapia della malattia infettiva?"; ciò equivarrebbe ad inviare al Laboratorio di chimica clinica un campione di sangue "per ricerca di anormalità chimiche", senza ulteriore indicazione o precisazione

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Contributo della microbiologia

Garbage in

Garbage out

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Il Manuale di raccolta

www.ospedaliriuniti.bergamo.itAltri Manuali consultabili al sito: www.apsi.it

M&VOspedali Riuniti di Bergamo

PRELIEVO, CONSERVAZIONE ED INVIO DEI CAMPIONI

PER INDAGINI MICROBIOLOGICHE

3a ed., maggio 2001, pag. 114

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Iter dell’indagine microbiologica

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PolmonitiCampioni per la diagnosi eziologica

Materiali raccolti con metodiche protette, a bassa contaminazione

Lavaggio bronco-alveolare (BAL) Lavaggio bronco-alveolare mirato con cateterino Spazzolatura endobronchiale protetta (PSB)

Materiali ad alto rischio di contaminazione con saliva Espettorato (o espettorato indotto o indotto-protetto) Aspirato endotracheale / bronchiale / da tracheostomia

Altri materiali Materiali bioptici Liquido pleurico Sangue (emocoltura, indagini sierologiche) Succo gastrico (per micobatteri) Tampone (aspirato) naso-faringeo (virus) Urine (ricerca antigeni Legionella , Pneumococco)

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Aspirato tracheo-bronchiale

Di semplice esecuzione, non richiede manovre invasive

La coltura identifica di solito il patogeno in causa (alta sensibilità), ma insieme ad altri microrganismi non responsabili dell’infezione (bassa specificità)

L’indagine microbiologica deve: determinare la carica batterica (coltura quantitativa) accompagnarsi all’esame microscopico (batteri e

cellularità)

Grossman R, Chest, 2000

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Aspirato tracheo-bronchiale

San Pedro, Chest, 2001

Fonte N.Sensibilità

%Specificità

%Riferimento

Hill (1976) 48 82 27Biopsia, Emocoltura, liq.pleurico

Berger (1985) 19 74 Autopsia

Villers (1985) 17 88 0Biopsia, Emocoltura, liq.pleurico, sierol.

Torres (1985) 41 57 14 PBS, BALLambert (1989) 22 88 33 PBS

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Lavaggio broncoalveolare

Procedura invasiva Fattori che condizionano la “qualità” del

BAL competenza dell’esecutore recupero > 10% della soluzione instillata immediato invio alla microbiologia terapia antibiotica in corso

Idoneità del campione > 10 cellule per campo a x500 presenza di < 1% di cellule epiteliali

Grossman R, Chest, 2000

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Prelievi “protetti” e risultati microbiologici

Grossman R., Chest, 2000

Mayhall G., Emerging Infectious Diseases, 2001

Colture PSB (>103 CFU/mL)

Tecniche diagnostiche

Esaminazione microscopica di fluidi da BAL (>5% organismi intracellulari)

Colture BAL (>104 CFU/mL)

82%

Sensibilità

89%

Specificità

90%

Valore predittivo Positivo

89%

Valore predittivo Negativo

91% 89% 91% 89%

91% 78% 83% 87%

67%

Sensibilità

95%

Specificità

37-100% 89-100%

73% 82%

Colture PSB(>103 CFU/mL)

Tecniche diagnostiche

Esaminazione microscopica di fluidi da BAL

Colture BAL(>104 CFU/mL)

Grosman R, Chest, 2000

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Infezioni delle basse vie respiratorie

Solo se CAP grave:Espettorato o BroncoAspEmocoltura(IDSA 2007) Solo campioni protetti:

BroncolavaggioSpazzolaturaEmocoltura (FADOI,’07)

Possibilmente campioni protetti

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Diagnosi delle infezioni respiratorie

- Più del 50% non sono diagnosticate

- Non c’è un solo test per fare diagnosi- coltura secrezioni- emocoltura- ricerca antigeni (RSV, Legionella,

S.pneumoniae, Aspergillus,…)

- Per i batteri, spesso non è un problema tecnico, ma di interpretazione !!!!

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Diagnosi: due quesiti

- Se isolo patogeni (spesso presenti anche nel cavo orale), sono quelli colonizzanti o sono quelli che hanno raggiunto il polmone?

In pratica:

Ho raccolto quelli del cavo orale o quelli dell’infezione ?

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Diagnosi: due quesiti

- Se isolo non patogeni (normalmente non presenti nel cavo orale), sono quelli che hanno colonizzato il tratto respiratorio alto o hanno raggiunto anche il polmone?

In pratica:

Ho raccolto quelli delle alte vie o quelli dell’infezione ?

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Infezioni delle basse vie respiratorie

La contaminazione con la flora del

cavo orale inficia il risultato

dell’esame colturale

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Campioni NON protetti

Passano attraverso il cavo orale:- Espettorato (anche indotto, protetto)

Raccolti con broncoscopio attraverso il cavo orale:- Lavaggio tracheo-bronchiale

Raccolti con aspirazione: - durante la broncoaspirazione di intubati: - Aspirato tracheo-bronchiale - attraverso fistola tracheostomica:

- Aspirato da tracheo-stomia

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Diagnosi

Come evitare la raccolta dei colonizzanti?

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Campioni protetti

- PSB= Brushing endo-bronchiale protetto - Mini-BAL= Lavaggio bronco-alveolare

protetto

- BAL= Lavaggio bronco-alveolare (più negli immuno-compromessi o polmoniti interstiziali)

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34

35

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VAP: Diagnosi CDC Draft 2002 -GISIG 1998

- i criteri tradizionali:

- clinici (tosse, febbre, leucocitosi, secrezioni purulente)

- strumentali (evidenze radiologiche di un infiltrato nuovo o progressivo)

- microbiologici (coltura dell’aspirato endotracheale, l.pleurico, sangue)

NON SONO SUFFICIENTI PER UNA VAP

PERCHE’ ASPECIFICI E INAFFIDABILI

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VAP: Standardizzazione dei metodi diagnostici

CDC Draft 2002 -GISIG 1998

- PSB (Protected Specimen Brush)

- BAL (Broncho-Alveolar Lavage)

- Mini-BAL (Protected Broncho-Alveolar Lavage)

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Criteri di idoneitàEsame microscopico

Cellule bronchiali epiteliali squamose

NeutrofiliBatteri intracellulariFlora Cavo Orale

SeminaNon Protetti con 1 mclProtetti con 10 mcl

Rilevazione caricheNon Protetti > 106 ucf/mlBroncolavaggio > 104 ucf/mlMini-BAL > 102 ucf/ml

Identificazione microrganismi

PatogeniNon Patogeni

40

Esame microscopico

Idoneo Non idoneo

41

42

43

44

Tabella 1 Cellule epiteliali squamose (CS)

0 1-9 10-24 >25Referto 0 + ++ +++

0 0 0 -1 -2 -31-9 + +1 0 -1 -2

10-24 ++ +2 +1 0 -1>25 +++ +3 +2 +1 0

Punteggio " Q "

Lettura del Gram

Globuli bianchi

(GB)

Esame microscopico: Q-score

Lettura: media di 10 campi

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Semina NON protetti

Significative cariche >106 (10-100 UCF)

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Semina protetti

Significative cariche >103 (1-10 UCF)

(104 per BAL: 10-100 colonie)

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…e valutare il germe in causa

- assenza crescita- 1 CFU = 104

- 10 CFU = 105

- 100 CFU = 106

> 100 CFU = 107

Patogeni

Cioccolato 1l (diluito 1:10)

ATB +ID

Non Patogeni

descrittivo

FBM

FBM

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Microrganismi respiratori

Patogeni

Non patogeni

-BGN (fermentanti e non)-S. pneumoniae e beta-emolitici-S.aureus-Haemophilus influenzae-B.catarrhalis

- S.coagulasi negativi- Strept. alfa-emolitici- Neisseriaceae- Altri Haemophilus

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Emocoltura

20-30% polmoniti batteriche hanno batteriemia

L’emocoltura dovrebbe essere sempre eseguita in caso di polmonite

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Collaborare per vedere i problemi per quel che sono

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Tenersi informati