Gli anticorpi come strumento per lo studio e la terapia del...

GROUND ROUND “GRUPPO PROSTATA”

“Gli anticorpi come strumento per lo studio e la terapia del carcinoma prostatico ”

Milano15 febbraio 2005

Mariangela Figini

Molecular Therapies Unit, INT, Milan

MeccanismiMeccanismi di di distruzionedistruzione del del tumoretumoredada parteparte del del sistemasistema immuneimmune

cTCD8

TCD4

IL-2, IFN, TNF...

IL-2

B ly

Anticorpitumore-specifici

Monociti, DC

NKAttività

antitumoralediretta

Attivitàantitumorale

(rilascio di citochine,lisi, etc.)

Le grandi scoperte della medicina

1975 Anticorpimonoclonali

ANTICORPI

gruppo di proteine seriche che specificamente legano ed inattivanoagenti estranei quali :

Proteine eterologhe Virus Batteri Parassiti Funghi Cellule Tumorali

e che hanno importanti attività biologiche.


E’ stato calcolato che il repertorio anticorpale umano può raggiungere una dimensione di 109 molecole anticorpali diverse.

STRUTTURA DELLE IMMUNOGLOBULINE

Da Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders, 1999


VISIONE TRIDIMENSIONALE

Effetto citotossico

TERAPIA CON ANTICORPI

Innesco di meccanismi effettori della risposta immune


Fc ReceptorAg

ComplementC1q

TargetEffector

Targetting

MAb

Fc ReceptorAg

ComplementC1q

TargetEffector

Targetting

MAb

TERAPIA CON ANTICORPI

Signals blocked by MAb

MAbLigands blocked by MAb

Target

Signals blocked by MAb

MAbLigands blocked by MAb

Target

TargetAg

Signals activated by MAb

TargetAg

Signals activated by MAb

Attivazione del segnale: anti-recettore

Blocco della trasduzionedel segnale : anti-recettore

anti-ligando


(Bevacizumab/Avastin)

(Trastuzumab/HerceptinCetuximab/Erbitux(Rituximab/Rituxan)

STRATEGIE PER AUMENTARE LA POTENZA DEGLI ANTICORPI

CITOCHINE:Innesco di meccanismi effettori della risposta immune

Effetto citostatico/citotossicoGemtuzumab (anti CD33 AML)

RADIONUCLIDIEffetto citostatico/citotossicoZevalin (anti-CD20)Bexxar (anti-CD20)

FARMACI, ENZIMI, TOSSINE:


Da Carter P. Nat CANCER REV. 2001

siRNA:

PARAMETRI CHE INFLUENZANO L’EFFICACIA IN VIVO DEGLI ANTICORPI

MODALITÀ di SOMMINISTRAZIONE

CARATTERISTICHE del BERSAGLIO

CARATTERISTICHE dell’ANTICORPO


CARATTERISTICHE del BERSAGLIO

NATURA DELLA NEOPLASIA:Tumore solido\ematopoietico

Dimensioni LocalizzazioneVascolarizzazione


ANTIGENE BERSAGLIO:Localizzazione (membrana\microambiente)Livello di espressioneSpecificitàRilascioInternalizzazione

Cleareance In Vivo

Immunogenicità

Penetrazione e uptake nel tumore

CARATTERISTICHE dell’ANTICORPO

SPECIE di ORIGINE, DIMENSIONE ed AFFINITA’


CRONOLOGIA DEI PRINCIPALI AVANZAMENTI BIOTECNOLOGICI CHE HANNO CONSENTITO LO SVILUPPO DELLA IMMUNOTERAPIA CON

ANTICORPI

1975 George Kohler and Cesar Milstein (Nobel 1984) sviluppano la tecnologia di ibridazione somatica per la produzione di anticorpi monoclonali

1983 Kary Mullis (Nobel 1993) inventa la Reazione a Catena dellaPolimerasi (PCR)

1990 John Mc Cafferty et al. esprimono librerie anticorpali sullasuperficie fagica


PRINCIPALI LIMITAZIONI :

INEFFICIENZA DELLE FUNZIONI EFFETTRICI

BREVE VITA MEDIA IN CIRCOLO (T1/2= 20-60 H)

IMMUNOGENICITA’ (SVILUPPO DI RISPOSTAHAMA)

PRINCIPALI VANTAGGI:

OMOGENEITA’ DELLE PREPARAZIONI

SEMPLICITA’ DI PREPARAZIONE

Anticorpi Monoclonali MURINI in vivo


Conseguenze della rispostaHAMA


CLEARANCE ACCELLERATA

RIDUZIONE DELL’EFFICACIA

PRECLUSIONE DI SOMMINISTRAZIONI RIPETUTE

Biodistribuzione di anticorpimonoclonali

PRINCIPALE LIMITAZIONE OSSERVATA:Ridotto accumulo nel tumore

Limitata vascolarizzazioneAlta pressione interstizialeLimitata diffusione: dimensione, affinita’


POSSIBILI SOLUZIONI:Somministrazione Locoregionale (i.p., i.t.)Uso di frammenti anticorpaliStrategie di pretargeting

ANTICORPO UMANO COME REAGENTE IDEALE PER TERAPIA

metodologie utilizzate per ottenere cloni stabili producenti anticorpi umani:

Fusione somaticaImmortalizzazione con EBV


Approcci di ingegneria proteica

CRONOLOGIA DEI PRINCIPALI AVANZAMENTI BIOTECNOLOGICI CHE HANNO CONSENTITO LO

SVILUPPO DELLA IMMUNOTERAPIA CON ANTICORPI





30-40 cicli totaliRisultato amplificazione

DNA doppio filamento 1° STEP denaturazione

2° STEP appaiamento 3° STEP allungamento

Ogn

icic

lodi

am

plifi

cazi

one

prev

ede

3 ST

EP

PRINCIPIO DELL’AMPLIFICAZIONE DEL DNA MEDIANTE PCR


LE IMMUNOGLOBULINE SONO NATURALMENTESUDDIVISE IN DOMINI FUNZIONALI

Da Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders, 1999


Murino

Umanizzato

Chimerico

Umano


Dati Clinici di Immunogenicità e Farmacocinetica

di Anticorpi Monoclonali


2-3 settimane0%0-1%Umanizzato

100-200 h0-6%6-30%Chimerico

20-62 h30%60%Murino

T 1\2 βANTI IDIOTIPO

HAMA

IgG(2 binding sites)

F(Ab’)2 fragment(2 binding sites)

FAb fragment(1 binding site)

Single Chain (scFv)(1 binding site)

Diabody(2 binding sites)

Triabody(3 binding sites)

MOLECOLE OTTENIBILI PER INGEGNERIA PROTEICA


ANTICORPO UMANO COME REAGENTE IDEALE PER TERAPIA

Nuove metodologie per ottenere cloni stabili producenti anticorpi umani:

Topi transgeniciEspressione e selezione di librerie anticorpali umane sulla superficie di fagi


CRONOLOGIA DEI PRINCIPALI AVANZAMENTI BIOTECNOLOGICI CHE HANNO CONSENTITO LO SVILUPPO DELLA IMMUNOTERAPIA CON

ANTICORPI





LIBRERIE ANTICORPALI ESPRESSE SULLA SUPERFICIE DI FAGI* FILAMENTOSI


*I fagi sono virus che infettano i batteri e sonoin grado di ospitare nel loro genoma DNA

esogeno

Linfocita

Le variabili anticorpali vengono isolate più facilmente da linfocitidi sangue periferico di donatore o di paziente ma potrebbero essere isolate

anche dalla milza dal midollo osseo o da un linfonodo

mRNA

mRNA

VLCL

VH

Trascriptasi inversa

PCR

Clonaggio


Libreria anticorpale

PROCESSO DI SELEZIONE FAGICA

VHVL

VL

VH

VHVL

VL

VH

VHVL

VL

VH

VHVL

VL

VH

VHVL

VL

VH

VHVL

VL

VH

INCUBAZIONE DELLA LIBRERIA ANTICORPALE FAGICA

CON L’ANTIGENE IMMOBILIZZATO

LEGAME DEL FAGO SPECIFICO PER L’ANTIGENE IMMOBILIZZATO

VHVL

VL

VH

VHVLV

LV

HVHVL

VL

VH

VHVL

VL

VH VHVL

VL

VH

VHVL

VL

VH

Allontanamento Dei fagi aspecifici

Tramite lavaggi

VHVL

VHVL VHVL

VHVL

ISOLAMENTO DEL FAGO SPECIFICO E SUA

CARATTERIZZAZIONE

VHVL

VL

VH

Produzionesolubile

Caratterizzazione Biochimico funzionale

E genetica

Fago

VHVL

VL

VH

CLCH

VHVL

VH VL

Fab

scFv

Antigene

Linfocita B

MATURAZIONE DI AFFINITA’In vitro

Mutagenesi Sito specificaMutagenesi Random

-ceppi mutatori-error prone polimerasi

Permutazione di catena (Chain-Shuffling)


MAbs Anti-tumore approvati per terapia dei Tumori ematopoietici

2002/2003CD20Murino(90Y/ 131I)Ibritumomab tiuxetanTositumomab

2001CD52UmanizzatoAlemtuzumab

2000CD33Umanizzatoconiugato

Gemtuzumabozogamicin

1997CD20ChimericoRituximab

APPROVAZIONE FDABERSAGLIOTIPO DI

ANTICORPONOME GENERICO

2004EGFRChimericoCetuximab

2004VEGFUmanizzatoBevacizumab

1998Her2RUmanizzatoTrastuzumab

1994 (D)EpCamMurinoPanorex

APPROVAZIONE FDABERSAGLIOTIPO DI

ANTICORPONOME GENERICO

MAbs Anti-tumore approvati per terapia dei Tumori solidi

Il CaP ha molte caratteristiche che lo rendono un eccellente target per una terapia con anticorpi monoclonali

•La prostata non è un organo essenziale (quindi l’anticorpo non è essenziale che sia tumore specifico in senso stretto ma e suff. che sia organo specifico).

•Le metastasi da CaP coinvolgono principalmente le ossa ed i linfonodi (localizzazioni che ricevono alti livelli di anticorpi circolanti e che da studi su altre patologie sono responsive a questo tipo di trattamento vedi linfomi e carcinoma della mammella).

•CaP è relativamente sensibile alla radioterapia (è quindi auspicabile che il trattamento con radionuclidi possa essere efficace).

•Le metastasi di CaP sono relativamente piccole (quindi l’antigene è facilmente accessibile in quanto la massa facilmente penetrabile).

•La possibilità di monitorare la ripresa di malattia con un marcatore biochimico (PSA) ci permette di utilizzare la terapia anticorpale ai primi segni di ripresa quando il tumore ha dimensioni piccole (quindi più facilmente aggedibile).

•Il PSA ci permette inoltre di monitorare passo a passo l’efficacia della terapia

ANTICORPI IN SVILUPPO NEL CaP

PSMA Prostate SSpecific MMembrane AAntigen

Proteina transmembrana di tipo II (750 aa., 100 kD)

Viene costitutivamente internalizzata

Possiede attività peptidasica ( folato idrolasica , glutammato carbossipeptidasica )

Espresso nella prostata normale, overespresso nei carcinomiprostatici (metastatici, androgeno indipendenti)

Espresso nella neovascolatura di tumori di vario istotipo

Anticorpi anti-PSMA:

7E11 (ProstaScint) Capromab pendetide, J591 e D2B

Nat Clin Pract Urol. 2005 Dec;2(12)Therapy Insight: osteoporosis during hormone therapy for prostate cancer.Smith MR.AMG162 (toremifene) per il controllo dell’osteoporosi dovuta alla somministrazione di ormoni

N. Engl. J. Med. 2005; 353 (12): 1224-35Auto antibody Signatures in Prostate CancerWang X. Et al

RANKL is an essential factor for osteoclastogenesis. Amgen research group has developed AMG 162, a fully human monoclonal antibody to RANKL.

PRODUZIONE MONOCLONALI MURINI

Anti-PSCA Immunizzazione con lisati batterici ricombinanti esprimenti PSCA Gli anticorpi sono in fase di caratterizzazione

Anti-PSMA Immunizzazione con membrane cellulari di LNCaPOttenuto un anticorpo con buona affinità e specificità (D2B). Le variabili dell’anticorpo sono state clonate, sequenziate ed inserite in un vettore fagemidico (pMIMO) da noi costruito per l’espressione di scFv sulla superficie fagica o come solubile

Legame dell’Anticorpo Murino intero e del scFv espresso su fagi

LNCaPAbD2B

LNCaPscFvD2B

Produzione anticorpo monoclonale murino e coniugazione con catena A della ricina

Le Immunotossine (IT) sono reagenti biotecnologici ottenuti mediante il legame di una molecola citotossica (tossina) ad una molecola vettrice ( mAb, citochina, fattore di crescita ), che conferisce al coniugato la specificità di targeting

+ +linker

toxinImmunotoxin

mAb

Clonaggio delle regioni variabili e costruzione di un

scFv

scFv immunotoxin

SCOPO DEL LAVORO:

1. Creazione di una libreria anticorpale da pazienti con CaP, utilizzando la tecnologia del “phage display”

2. Selezione del repertorio anticorpale contro antigeni tumore associati (TAA) già conosciuti ma non ancora validati come markers tumorali

3. Identificazione di nuove molecole tumore associate utilizzando un approccio proteomico

• per contribuire alla determinazione del profilo antigenico del CaP

• per identificare nuovi markers tumorali

Tappe nello sviluppo di unaimmunoterapia

Identificazione del bersaglio

Sviluppo del miglior anticorpo contro il bersaglio

Sviluppo del miglior approccio terapeutico

Studi preclinici in vitro ed in vivo

Produzione per uso clinico (GMP)

Analisi di tollerabilita’ (studi di fase I)

Analisi di efficacia (studi di fase II)

Analisi di efficacia rispetto ai farmaci convenzionali (studi di fase III)

NUOVA IMMUNOTERAPIA

Gli anticorpi monoclonali rappresentano uno trai reagenti con la più alta versatilità ed applicabilitànelle più svariate aree della biomedicina.

Stato dell’arte

Cancer Immune/inflammatory disorders

da Nature Review Drug Discovery

1/4 3/4

Cancer Immune/inflammatory disorders

da Nature Review Drug Discovery

1/4 3/4

CONCLUSIONE

Tramite tecnologie del DNA ricombinante e di ingegneria proteica, è possibile produrre reagenti "su misura", e cioèopportunamente modificabili secondo le specifiche esigenze di utilizzo.

Buone idee e buoni anticorpi necessitano buone infrastrutturee competenze interdisciplinari per convertire un buon risultato di laboratorio in un farmaco utile

La fattibilità del progetto è supportata dalla collaborazone con il Laboratorio del Prof. Colombatti M. (Università di Verona)

UO11

Mimosa MortarinoRenata FerriElena Luison

Silvana Canevari

clinici INT

“gruppo prostata”Riccardo ValdagniTiziana Magnani

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