Frodi e specie ittiche: la genetica al nostro servizio · 2.PCR di un specifico frammento di DNA...

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Istituto Zooprofilattico

Sperimentale del Piemonte,

Liguria e Valle d’Aosta

Frodi e specie ittiche: la genetica al nostro servizio

Maria Vittoria Riina

S.S. Genetica e ImmunobiochimicaTorino, 31 marzo 2017

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Perché identificazione genetica di specie?

• Prodotti lavorati

• Specie aliene

• Specie ibride

FINSForensically Informative Nucleotide Sequencing

tecnica che combina il sequenziamento del DNA e l’analisi filogenetica

basata su sequenze nucleotiche informative

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Perché analisi del DNA?• Il DNA è presente in ogni

cellula• è in gran parte stabile

DNA mitocondriale• Presenza di più copie nelle

cellule (1-10/mitocondrio)• Sequenza nota per molti

organismi• Marcatori con sequenza

diversa tra specie diverse, uguale nella stessa specie

FINS

1. Estrazione di DNA

2. PCR di un specifico frammento di DNA

3. Determinazione della sequenza nucleotidica

4. Analisi filogenetica↓

Identificazione della specie

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FINSEstrazione di DNA:

• filtrazione su colonnine

• precipitazione

• biglie magnetiche

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FINS

1. Estrazione di DNA

2.PCR di un specifico frammento di DNA




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FINS

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Gene che codifica per il citocromo b (cytb) e/o

gene che codifica per la citocromo ossidasi subunità 1 (COI)

mediante un’ unica reazione di PCR per le diverse specie (primer universali)

FINS1. Estrazione di DNA


3.Determinazione della sequenza nucleotidica



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FINS1. Estrazione di DNA



4.Analisi filogenetica↓


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Confronto della sequenza nucleotidica ottenuta con quelle di tutte le specie depositate nei database

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Allineamento sequenze nei database pubblici

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Costruzione dell’albero filogenetico a cui applicare il test di confidenza bootstrap

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COI

cytb

X 589 specie

206 campioni

Ricerca Sanitaria Finalizzata Regionale

“Valutazione di marker genetici per identificazione di specie, per la loro applicabilità nel controllo delle frodi

alimentari”

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A che scopo?

• Lotta alle frodi alimentari

• Tutela specie autoctone

• Studi di popolazione

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Nell’Unione Europea il pesce è uno dei 10 prodotti maggiormente oggetto di frodi

e il 72% degli illeciti sono connessi all’etichettatura e alla tracciabilità.

Oceana (www.oceana.org) ha raccolto oltre 100 studi svolti sulle frodi di

sostituzione: fino al 30% di illeciti.

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Perché interessa la frode di sostituzione di specie?

• Rischio sanitario

• Danno commerciale

• Il consumatore ha il diritto

di scegliere

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Rischi sanitari

• Specie tossiche (pesce palla, ruvetto)

• Specie provenienti da aree da cui è vietata l’importazione per motivi igienico-sanitari

• Specie a basso valore nutritivo

• Specie che possono provocare allergie

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RISULTATI DELL ’IZSPLVAnalizzati • 135 campioni• 41 merluzzi• 22 pesci piatti• 16 branzini• 16 orate• 14 storioni• 12 persici del Nilo• 11 cernie• 2 pagelli• 1 pangasio

0 2 (9%)00004 (36.4%)00

Non conformi6 campioni (4.4%)

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Attività di identificazione genetica nelle specie ittiche destinate al consumo umano

1 327 17 10

27 2641

9 15

40 65

118

68

165

44

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016

campioni conformicampioni non conformi

16.7%

40.3%20.7%

18.5%

28.4%

13.6%

25.8%

10%

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FILETTI DI CERNIA NON CONFORMI

3 dal S

eneg

al

Brotula spp.

Chlorurus spp.

1 dal Vietnam

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Alcuni esempi

Filetto di tonno rosso dichiarato tonno pinne gialle

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Alcuni esempi

Trancio di squalo smeriglio venduto per pesce spada

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Alcuni esempi

Discriminazione di specie tra Aphia minuta (rossetto) e Sardina pilchardus(bianchetto) per Capitaneria di Porto di La Spezia

Frittelle di pesce ghiaccio vendute per frittelle di bianchetto

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Alcuni esempi

“Caviale russo” on line contenente uova di luccio oppure DNA di Xanthomonas campestris!!!

???

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ID SPECIE ESOTICHE E NON CONVENZIONALI

ID SPECIE E QUANTIFICAZIONE

ALIMENTI COMPOSTI: QUALI E QUANTE SPECIE?

RICERCA FINALIZZATA: “No more emergencies in DNA species identification: development and harmonization of molecular and next generation methods todetermine and quantify origin species in food and to discriminate frauds fromunintentional contamination.”

NEXT GENERATION SEQUENCING

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Non solo controlli di laboratorio!

Iniziative dell’IZSPLV a tutela del consumatore

INFORMAZIONE E INNOVAZIONE

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perché la genetica negli studi di popolazione?

• studi di dinamica di popolazione

• salvaguardare specie autoctone minacciate

• valutare lo stato di ibridazione e introgressione genica

• assetto nella nomenclatura del taxon

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salvaguardia delle popolazioni autoctone e studi di popolazione

Vairone

(Telestes muticellus)

• Grande interesse conservazionistico

(allegato II Direttiva Habitat)

• Indagare status distributivo

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Luccio

(Exos cisalpinus)

• Indagare la sua distribuzione

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Salmo marmoratus

Salmo trutta


• studio delle popolazioni per conoscere stato sanitario e genetico delle popolazioni selvatiche e negli impianti ittiogenici

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• metodo ad hoc per determinare la specie e discriminare il ceppo “atlantico” da quello “mediterraneo”

Indagine su avannotti di trota per conto della federazione italiana pesca sportiva ed attività subacquee � ceppo mediterraneo �ceppo adriatico

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CONCLUSIONI

Sinergia tra i metodi morfologici e biomolecolari per:

• smascherare frodi alimentari di sostituzione di specie

• analisi di popolazione per contrastare fenomeni di estinzione o l’esaurimento della componente genetica delle specie autoctone

• azioni di conservazione e proibizione di introduzione specie esotiche

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