STUDIO COMPARATIVO DELLA CAPACITA DISCRIMINANTE DEI MARCATORI RAPD, AFLP E SSR E LA LORO EFFICACIA NELLO STABILIRE LA RELAZIONE GENETICA NELLOLIVOFERNANDO DI BENIGNOCORSO DI BIOTECNOLOGIE E BIODIVERSITA VEGETALIUNIVERSITA DI ANCONAFACOLTA DI AGRARIA

STUDIO COMPARATIVO DELLA CAPACITA DISCRIMINANTE DEI MARCATORI RAPD, AFLP E SSR E LA LORO EFFICACIA NELLO STABILIRE LA RELAZIONE GENETICA NELLOLIVOBelaj Z. Satovic G. Cipriani L. BaldoniR. Testolin L. Rallo I. Trujillo14 Ottobre 2002

Theor. Appl. Genet. (2003) 107:736 - 744

Lolivo (Olea europea L.) una specie subtropicale tipica del bacino del Mediterraneo, dove rappresenta la coltivazione pi importante per la produzione di olio destinato all uso alimentare. La grande diversit nell olivo e la presenza di casi di omonimia e sinonimia accentua il bisogno di trovare metodi efficienti e rapidi in grado di discriminare le varie cv.Un grande aiuto a questo scopo stato dato dallo sviluppo dei marcatori molecolari i quali hanno creato nuove opportunit nello studio della caratterizzazione e della biodiversit genetica.Una migliore comprensione dell efficienza dei marcatori molecolari considerato un passaggio prioritario nella caratterizzazione del germorplasma dell olivo e un prerequisito per migliorare i programmi di miglioramento genetico. Introduzione

Scopo della ricercaComparare la capacit discriminante e le informazioni ottenute con i marcatori AFLP, RAPD e SSR per lidentificazione del genotipo e lanalisi della diversit genetica2. Determinare la similarit genetica stimata e la relazione genetica tra 32 Cv di olivo principalmente coltivate in determinate zone dell ITALIA e della SPAGNA3. Confrontare i pattern di variabilit ottenuti con ogni marcatore

Materiali e metodiTutti i campioni di olivo analizzati sono stati prelevati dal World Olive Germoplasm Bank of the Centro de Investigacin y Formacin Agraria (CIFA) Alameda del Obispo in Cordoba -Spain-

Cultivar analizzate e loro distribuzione geograficaSPAGNA

AlfaraESTArbequinaESTBicalSUD-ESTBlanquetaESTCastellanaCENTROChanglot RealESTCornicabraCENTROEmpeltreESTFargaESTGordal SevillanaSUD-OVESTHojiblancaSUD-OVESTLchin de GranadaSUD-OVESTLechn de SevillaSUD-OVESTManzanilla CacerenaCENTROManzanilla de SevillaSUD-OVESTMorrutESTPicualSUD-OVESTPicudoSUD-OVESTSevillencaESTVerdial de BadajozCENTROVillalongaESTVerdial de HuevarSUD-OVEST

Cultivar analizzate e loro distribuzione geograficaITALIA

MARCATORIRAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism)

SSR (Single Sequence Repeat)

RAPD

RAPDCaratteristiche dei marcatori RAPDSono stati usati 21 primer diversi, provenienti da kits in commercio.Tutte le analisi sono state ripetute 3 volte usando vari lotti di AmpliTaq polimerasi, i prodotti della PCR sono stati separati su gel di poliacrilamide e visualizzati con la tecnica silver staining.

VANTAGGISVANTAGGISemplici e veloci Riproducibilit nullaNeutraliDominantePiccole quantit di DNAProblemi di comigrazionePrimers facilmente disponibili in commercio

AFLP

AFLP*In alcuni casi si usa la tecnica della fluorescenza o del silver stainingCaratteristiche dei marcatori AFLPSono stati usati 5 combinazioni di primer con tre nucleotidi selettivi, 4 MseI (M-CAC M-CAA M-CGT M-CTT) e tre EcoRI (E-AGC E-ACT E-AAC)

VANTAGGISVANTAGGIRileva molti Loci per gelMarcatori dominantiALTA RIPRODUCIBILITAUSO DI SOSTANZE RADIOATTIVE*AMPIO SPETTRO DAPPLICAZIONEFacili da utilizzare(Sono in vendita kit ready to use)Applicabile a specie diverseInterpretazione delle bande non sempre sempliceCosti accettabiliALTO POLIMORFISMO

SSRStruttura dei microsatellitiFra i meccanismi di origine dei microsatelliti c anche lo Slippage replication

SSRProblematica principale

Amplify repeat region by polymerase chain reactionMicrosatelliti (Simple Sequence Repeats)SSR

SSRCaratteristiche dei marcatori SSRLa cv Frantoio, dalla quale sono stati isolati e sequenziati i microsatelliti, stata usata come campione di confronto in tutti i gel. Lo scoring e la misurazione degli alleli stata fatta utilizzando la sequenza del plasmide pUC18 come riferimento nella corsa elettroforetica su gel di poliacrilamide.Sono stati utilizzati 8 primers.

VANTAGGISVANTAGGIDistribuiti uniformemente nel genomaNecessita la preparazione di primersCodominantiSono specie-specificiRiproducibiliSi evidenziano su gel di poliacrilamideAlto poliformismoDifficolt nell interpretazione delle bande

Riassunto delle caratteristiche dei marcatori

MarcatorePolimorfismoCodominanteCostruzione dei primersDifficoltRiproducibilitQualit del DNACostiFacilit di interpretazioneGelRAPD++NN+-++-+AgarosioAFLP++NN+++++++PoliacrilamideSSR+++SS++++++++++Poliacrilamide

RISULTATILIVELLO DI POLIMORFISMO

RISULTATILIVELLO DI POLIMORFISMOI tre marcatori si sono verificati essere molto efficaci nel discriminare le 32 cultivar di olivo.

INDICIMARCATORIRAPD AFLPSSRN DI LOCI(N TOT DI BANDE)13531961% B.Pol.8182100N TOT DI BANDE POLIMORFICHE109261(98)61BANDING PATTERNS201146105B. PAT. / U9,5729,2013,13NUMERO EFFETTIVODI PATTERNS / U5,3927,637,58

RISULTATILIVELLO DI POLIMORFISMOIl numero effettivo di patterns indica la grandezza di un popolazione ideale nella quale, date le frequenze dei pattern ottenuti, tutti gli individui possono essere distinti. Quindi con un primer RAPD si possono distinguere 6 variet, con una sola combinazione di primer AFLP si possono distinguere 28 variet mentre con un primer SSR si distinguono circa 8 variet.

RISULTATICOMPARAZIONE DELLE INFORMAZIONI OTTENUTE CON I MARCATORI RAPD, AFLP E SSRTre primer SSR, corrispondenti al 37,5%, generavano bande multiple dovute all amplificazione simultanea di differenti loci. Di conseguenza ogni prodotto di amplificazione (Allele) era facilmente identificabile, ma l attribuzione degli alleli ai rispettivi locus non era accertabile. Per questo motivo si sono presi in considerazione solo gli altri cinque primers a singolo locus. Questo fenomeno relativamente comune nelle specie con una origine allopoliploide e potrebbe essere dovuto alla fusione del genoma e alla duplicazione dei cromosomi durante l evoluzione

RISULTATIANALISI DEI DENDROGRAMMITutte tre i marcatori hanno messo in evidenza un alto grado di similarit nei dendrogrammi, sebbene ci sono state delle differenze nella posizione di alcune cv nei gruppi principali.Tutti i dendrogrammi riflettono la relazione tra le cv in dipendenza della loro area di coltivazione.

Per lanalisi della similarit stato applicato il coefficiente di Dice, sia per ogni singolo marcatore che per tutti e tre insieme. Le cultivars sono state raggruppate attraverso lanalisi cluster usando il metodo UPGMA acronimo di Unweighted Pair Group MethodRISULTATI

UPGMA Unweighted Pair Group MethodEsempio di costruzione di un albero filogenetico con il metodo UPGMA

UPGMA Unweighted Pair Group MethodEsempio di costruzione di un albero filogenetico con il metodo UPGMA

UPGMA Unweighted Pair Group MethodEsempio di costruzione di un albero filogenetico con il metodo UPGMA

UPGMA Unweighted Pair Group MethodEsempio di costruzione di un albero filogenetico con il metodo UPGMA

UPGMA Unweighted Pair Group MethodEsempio di costruzione di un albero filogenetico con il metodo UPGMA

RISULTATISIMILARITA E RELAZIONE GENETICALa tabella seguente riassume la similarit genetica calcolata a due a due per tutte le 32 cv di olivo per ogni marcatore.La similarit genetica espressa come Coefficiente di Dice.

PARAMETROTIPO DI MARCATORERAPDsAFLPsSSRsMEDIA0.560.680.36MINIMO0.280.480.00MASSIMO1.001.000.93

DENDROGRAMMA AFLP

DENDROGRAMMA AFLP1 GRUPPO In questo gruppo sono presenti 13 cv Spagnole e 5 Italiane. Delle 18 cv Spagnole 8 provengono dal Sud-Ovest e dal Centro, mentre altre 4 cv (Alfafara, Blanqueta, Changlot Real, Castellana) provengono dallEst. Le 5 cv Italiane sono raggruppate in differenti sottogruppi in accordo alla loro distribuzione geografica.Nel dendrogramma generato dagli AFLP si possono osservare 2 gruppi principali, ai quali si affiancano le cv Bical e Castellana raggruppate separatamente ad una distanza inferiore dello 0.65

DENDROGRAMMA AFLP2 GRUPPO Nel dendrogramma generato dagli AFLP si possono osservare 2 gruppi principali, ai quali si affiancano le cv Bical e Castellana raggruppate separatamente ad una distanza inferiore dello 0.65 Questo gruppo include 5 cvs Spagnole provenienti dall Est insieme a Lechin de Sevilla e Picual entrambi diffuse nel Sud. Insieme alle cvs Spagnole sono presenti in questo gruppo le cvs Coratina, Frantoio, Cellina, Leccino e Leccio del Corno di origine Italiana.

DENDROGRAMMA RAPD

DENDROGRAMMA RAPDIl dendrogramma ottenuto con i RAPD risulta essere molto simile a quello ottenuto con gli AFLP ma con alcune eccezioni, come ad esempio la cv Blanqueta situata nel gruppo 2 invece che nel gruppo 1 come nel dendrogramma AFLP.Ai livelli dei sottogruppi sono state mantenute alcune associazioni in entrambi i marcatori come, ad esempio, il caso delle cvs Changlot Real, Lechn de Granada, Verdial de Bedajoz, Moraiolo, Rosciolo e Farga. Inoltre il dendrogramma mette in evidenza un alta similarit tra le cvs provenienti dalla stessa area o nelle vicinanze pi di quanto lo faccia gli altri due marcatori.

DENDROGRAMMA SSR

DENDROGRAMMA SSRIl dendrogramma ottenuto con gli SSR ha evidenziato delle differenze a livello dei sottogruppi. La differenza che pi risulta la discriminazione delle cvs Cellina e Frantoio da parte degli SSR.Cosa che non erano stati in grado di fare gli altri due marcatori. Inoltre le cvs Lechn de Granada, Moraiolo, e Rosciola hanno formato un gruppo separato insieme alla cv Arbequina seppur mantenendo la stessa relazione genetica fra loro come nei casi degli altri due marcatori.

DENDROGRAMMA AFLP+RAPD+SSR

DENDROGRAMMA AFLP+RAPD+SSRIl dendrogramma generale stato costruito mettendo insieme i dati provenienti dai tre marcatori. Esso risultato molto simile a quelli ottenuti con ogni singolo marcatore. Comunque ci sono alcune differenze che portano ad una migliore rappresentazione della relazione fra le cvs in accordo con la loro area geografica di coltivazione.

CONCLUSIONITra le cvs analizzate non stata riscontrata una differenziazione tra i due paesi (Italia e Spagna), forse dovuta allo scambio reciproco di materiale genetico.La struttura della diversit genetica comparata con le origini geografiche riflette un processo di selezione multilocale nellolivo, una limitata diffusione delle cvs allinfuori della loro area di coltivazione e un possibile scambio di materiale vegetale nel corso degli anni.

CONCLUSIONII tre marcatori hanno discriminato i genotipi molto efficacemente ma solo gli SSR sono riusciti a fare una distinzione fra le cvs Frantoio e Cellina.Gli SSR hanno evidenziato un alto livello di polimorfismo il quale era atteso in quanto il meccanismo che origina i polimorfismi in questi marcatori (Slippage Replication) molto frequente. La natura codominante di questo marcatore permette la scoperta di un alto numero di alleli per locus e di conseguenza ad un alto livello di eterozigosit attesa.

CONCLUSIONIIl relativamente alto valore di P (Numero effettivo di pattern/U) per tutti i marcatori usati da un idea di quella che pu essere la loro capacit discriminante quando nelle analisi si usano un numero abbastanza alto di campioni. Il risultato di P pi alto stato ottenuto con gli AFLP, probabilmente dovuto all alto numero di loci (Bande) amplificati in ogni esperimento.Lalto criterio di conservazione usato per la selezione dei polimorfismi pu aver ridotto il valore reale di P ottenuto per i RAPD.

CONCLUSIONICOMPARAZIONE DELLE INFORMAZIONI OTTENUTE CON I TRE MARCATORI

CONCLUSIONILutilit di un marcatore sta nellequilibrio tra il livello di polimorfismo che pu mettere in evidenza e la sua capacit di identificare polimorfismi multipli. (Powell et al. 1996) In quest analisi stato adoperato un indice che riassume la citazione sopra riportata, questindice il Marker Index (MI). Infatti esso composto da due parti:MI = E x HepDove: E= Nu x = N di loci polimorfici per unit di saggio Hep=Eterozigosit attesa dei loci polimorfici

CONCLUSIONIGli AFLP hanno un MI molto elevato, ma come si vede in tabella dovuto allalto valore di E. In altre parole lelevato valore di MI dipende pi dallalto numero di alleli (Bande polimorfiche) ottenuti in ogni profilo che per leterozigosit allelica trovata tra le cvs analizzate.

INDICERAPDAFLP*SSR**Hep0,350,310,42E5,1952,201,00MI1,7916,260,42

CONCLUSIONI**Tre primer SSR, corrispondenti al 37,5%, generavano bande multiple dovute all amplificazione simultanea di differenti loci. Di conseguenza ogni prodotto di amplificazione (Allele) era facilmente identificabile, ma l attribuzione degli alleli ai rispettivi locus non era accertabile. Per questo motivo si sono presi in considerazione solo gli altri cinque primers a singolo locus. Questo fenomeno relativamente comune nelle specie con una origine allopoliploide e potrebbe essere dovuto alla fusione del genoma e alla duplicazione dei cromosomi durante l evoluzione*Per il calcolo degli indici riguardanti i marcatori AFLP sono state prese in considerazione solo 98 bande polimorfiche ben definite.

CONCLUSIONI

SSR Basso Marker Index Alta eterozigosit attesa Media capacit discriminante Medio numero di patterns effettivi

AFLP Alto Marker Index Alta capacit discriminate Alto numero di patterns effettivi Bassa eterozigosit attesaCONCLUSIONI

RAPD Medio Marker Index Bassa eterozigosit attesa Bassa capacit discriminante Basso numero effettivo di patternsCONCLUSIONI

CONCLUSIONIQuesti risultati insieme a altre considerazioni di natura pratica ed economica, devono essere prese in considerazione quando si sceglie un marcatore per un applicazione specifica.Nel nostro caso tutte e tre i marcatori si sono dimostrati molto efficienti nel mettere in evidenza la diversit nellolivo, ma considerando la scarsa riproducibilit degli RAPD e lalta efficienza degli SSR e degli AFLP limita luso dei RAPD in analisi di questo tipo. Comunque rimangono una valida alternativa quando le possibilit economiche sono limitate..

CONCLUSIONISIA I MARCATORI RAPD CHE AFLP SONO MOLTO EFFICIENTI NELLO STABILIRE LA SIMILARITA GENETICA NELL OLIVO, MENTRE LA NATURA CODIMINANTE DEGLI SSR SARA PIU INDICATO PER STUDI DI SEGREGAZIONE E MAPPATURA DELL OLIVO.