Fase analitica:

Terreni di coltura

ed identificazione

Dott.ssa Saveria Dodaro

Cosenza 06.05.2013

Diagnosi eziologica 1. identificare l’agente patogeno

2. appropriato trattamento terapeutico

Laboratorio di microbiologia clinica

Altri obiettivi : Valutare l’efficacia della terapia Valutare la presenza di portatori sani (potenziale fonte di contagio in comunità)

Laboratorio di MICROBIOLOGIA clinica

Diagnosi di laboratorio delle malattie infettive

Utilizzo di metodologie scientificamente

valide ed eseguibili in tempi accettabili

Necessità di acquisire in tempi rapidi

informazioni utili alla diagnosi ed alla terapia

Diagnosi batteriologica

Sospetta infezione

batterica

Diagnosi diretta Diagnosi indiretta

sangue

feci

urine

biopsie

tamponi

Ecc.

Siero del paziente

Metodo immunologico

ricerca di anticorpi verso

l‘agente batterico

immunoenzimatico (EIA)

immunofluorescenza (IFA)

Diagnosi rapida

Esame colturale Semina su brodo di

arricchimento,terreno solido

non selettivo e/o selettivo

Metodo immunologico

(ricerca di antigeni dell’agente batterico)

Test di agglutinazione

ELISA

Immunocromatografia su membrana

Metodo molecolare

(ricerca di sequenze genomiche dell’agente

batterico)

PCR

Multiplex PCR

Nested PCR

NASBA

Ibridazione su una sonda verso l’agente

batterico Isolamento del microrganismo in coltura pura

Identificazione Biochimica,immunologica,molecolare

antibiogramma

Diagnosi batteriologica

Diagnosi diretta: presenza dell’agente patogeno

Esame microscopico (batterioscopico) Esame colturale (isolamento)

Ricerca di antigeni

Ricerca di sequenze geniche

Diagnosi diretta: esame microscopico

Campioni “a fresco”oppure fissati ( al calore o chimicamente)

La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno presente : Microscopia in campo oscuro Microscopia in contrasto di fase Microscopia in fluorescenza Spesso si utilizzano colorazioni “dedicate” Gram Ziehl Neelsen (alcool-acido resistenza)

borrelia burgdorferi

Microscopia in campo oscuro

Lieviti

Microscopia contrasto di fase

Microscopia in fluorescenza

Diagnosi diretta : esame microscopico (previa colorazione)

Colorazioni SEMPLICI prevedono l’impiego di un solo

colorante :

cristalvioletto

fucsina basica

blu di metilene

Colorazioni DIFFERENZIALI prevedono l’impiego di più di un

colorante :

colorazione di Gram

colorazione di Ziehl -Neelsen

Diagnosi diretta: esame microscopico (previa colorazione)

UTILITÀ CLINICA

Campioni fissati ( a calore o chimicamente)

• Idoneità del campione (espettorato-neutrofili/ cell.squamose)

Numero e percentuale di polimorfonucleati neutrofili

Presenza o assenza di microrganismi(batteri-funghi-parassiti)

Colorazione del campione con tecnica di Gram:

Morfologia (cocchi-bastoncelli-coccobacilli)

Disposizione ( catenelle-clusters-diplococchi)

Quantità assoluta di batteri presenti

Percentuale relativa di Gram pos/neg

Localizzazione in sede intra o extra cellulare

Altre specifiche colorazioni

bacilli alcool-acido resistenti (Ziehl Neelsen)

endospore batteriche (Verde malachite)

Streptococcus pyogenes

Neisseria meningitidis

COLORAZIONE DI GRAM

COLORAZIONE DI GRAM

osservazione microscopica

I batteri Gram+ (Staphylococcus, Streptococcuss, etc)

Staphylococcus epidermidis

I batteri Gram – (E. coli, P. aeruginosa, Neisseriaceae, etc.)

Escherichia coi

COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN

Mycobacterium tuberculosis

Gli organismi acido-resistenti appaiono colorati in rosso

ESAME COLTURALE

TERRENI

DI COLTURA

Una condizione per poter studiare i microrganismi è poterli coltivare nelle

condizioni di laboratorio

A tale scopo si devono conoscere le sostanze nutritizie e le condizioni fisiche richieste

COLTIVAZIONE DEI BATTERI

In laboratorio l’impiego di “terreni di coltura” riproduce artificialmente un ambiente in grado

di soddisfare le esigenze metaboliche del batterio che si desidera coltivare

I terreni di coltura contengono tutte quelle sostanze organiche ed inorganiche necessarie per la crescita del microrganismo La composizione chimica dei diversi terreni

di coltura è in parte differente in relazione alle necessità nutrizionali del batterio che si desidera coltivare

Alcune sostanze sono necessarie a tutti i microrganismi in quantità notevoli

“Macronutrienti”

CARBONIO

AZOTO

OSSIGENO

IDROGENO

ZOLFO

FOSFORO

servono per la sintesi dei componenti strutturali

della cellula

“Altri Macronutrienti”

Alcuni elementi sono necessari alla cellula, ma in quantità molto esigue

“Micronutrienti”

Per poter utilizzare i nutrienti è necessario portarli all’interno della cellula: l’unico composto chimico che entra o esce senza difficoltà alcuna dalla cellula

batterica, è l’acqua

TRASPORTO DEI NUTRIENTI ALL’INTERNO DELLA CELLULA

la concentrazione interna si mantiene superiore a quella esterna, spendendo energia

L’energia spesa per il trasporto dei nutrienti può provenire dall’ idrolisi di ATP

TRASPORTO ATTIVO

Alcuni soluti possono passare il filtro della membrana per diffusione passiva (senza spesa di energia da parte del

microrganismo) questo processo è tuttavia poco efficiente e troppo lento e i procarioti fanno ricorso a enzimi di membrana

(le permeasi)

TRASPORTO FACILITATO

Possono essere liquidi (per ottenere biomassa senza limiti spaziali), o solidi

TERRENI DI COLTURA

Stato fisico

Per solidificare i terreni si impiega L’AGAR

Un polisaccaride, estratto da alghe, che presenta il fenomeno della sovrafusione (liquefa a 100 C ma resta liquefatto fino a 45 C). L’uso dell’agar permette di dare al terreno la forma voluta, versandolo ancora liquido nel contenitore più idoneo e lasciandolo solidificare

Inoltre:

non è metabolizzato dalla gran parte dei batteri; non manifesta alcuna tossicità;

i microrganismi

invisibili ad occhio nudo

(<0,2 mm) si rendono visibili, dopo replicazione su substrato solido o liquido

Preparazione dei terreni

1. Dissoluzione degli ingredienti in volume di H2O.

2. Determinazione del pH ed eventuale correzione.

3. Distribuzione in contenitori idonei. 4. Sterilizzazione

In base alle sostanze che contengono e alle loro concentrazioni relative, i terreni di coltura sono classificati come:

Sintetici (o definiti)

Complessi

Terreni sintetici o definiti

I terreni sintetici o definiti sono quelli di cui si conosce l’esatta composizione. Vengono quasi sempre preparati ad hoc a seconda delle esigenze nutrizionali del microrganismo che si desidera far crescere.

Contengono un numero definito di sostanze a concentrazione nota.

sono quei terreni di cui non si conosce in maniera dettagliata la

composizione chimica Questi mezzi di coltura risultano di estrema utilità in quanto

permettono di far crescere contemporaneamente specie con esigenze nutrizionali molto diverse fra loro

Inoltre è possibile far crescere specie le cui esigenze nutrizionali non sono ancora ben conosciute

Terreni complessi

Oltre alle sostanze “standard” i terreni complessi contengono: Peptoni, idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione proteolitica; Estratti di carne magra, ricchi in amminoacidi peptidi, acidi organici, vitamine e sali minerali; Estratti di lievito, ricchi di vitamina B e composti del carbonio e dell’azoto.

I caratteri colturali forniscono indizi utili per l’identificazione

POPOLAZIONI MICROBICHE NATURALI

La popolazione microbica presente nel nostro ambiente è grande e complessa. Molte differenti specie microbiche popolano

contemporaneamente vari distretti del nostro corpo (mucose: orale, intestinale, cutanea) ed in modo analogo il nostro

ambiente (aria, suolo, acqua).

COLTURE MISTE

Una coltura pura è costituita da una popolazione di cellule derivate tutte da

un’unica cellula madre

Essa rappresenta una condizione artificiale per l’accrescimento dei batteri ed è una condizione ottenuta da manipolazioni di

laboratorio

COLTURA PURA

Terreni elettivi Sono terreni ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di pecora o cavallo, che consentono la crescita di quasi tutte le specie batteriche di interesse medico.

Terreni selettivi Sono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo di altre specie.

Terreni differenziali Sono terreni che, grazie alla presenza di particolari componenti, permettono di distinguere fra diversi gruppi di batteri, consentendo una identificazione presuntiva della specie isolata.

Terreni di arricchimento Sono terreni che consentono di aumentare la carica della specie batterica che ci interessa isolare, grazie alla presenza di fattori che inibiscono la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in esame.

Classificazione qualitativa dei terreni

a - b - g - emolisi su piastra di agar sangue

ESEMPIO DI TERRENO ELETTIVO E DIFFERENZIALE

ESEMPIO DI TERRENO SELETTIVO E DIFFERENZIALE

Fermentazione del Lattosio su agar

Mac Conkey

Lattosio fermentante

Lattosio non fermentante

Agar Mac Conkey

Agar CLED (Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient)

Contiene: Lattosio Blu bromotimolo come indicatore del pH Cistina amminoacido nutriente

ESEMPIO DI TERRENO ELETTIVO E DIFFERENZIALE

Lattosio fermentante

Lattosio non fermentante

• fluidificazione • concentrazione • sonicazione • diluizione

Esame colturale

Pretrattamento del campione

quantitativa

Esame colturale

Semina del campione

per isolamento

Esame colturale

Incubazione dei terreni di coltura

• temperatura • ossigeno

TEMPERATURA

• Psicrofili -10 C a +20 C (L.monocytogenes 5-8 C)

• Mesofili +10 a +50 C

• Termofili +40 a +70 C

OSSIGENO

Aerobi obbligati: Crescono solo in presenza di O2 atmosferico

Anaerobi obbligati: crescono solo in assenza di ossigeno atmosferico

Anaerobi facoltativi: crescono sia in condizioni aerobie che anaerobie

Microaerofili: crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di ossigeno;

crescono bene in atmosfera addizionata di CO2

OSSIGENO

CRESCITA IN

ANAEROBIOSI

• Per la coltura dei batteri anaerobi bisogna utilizzare terreni riducenti

ed in incubatori speciali.

• I terreni riducenti sono terreni che contengono dei composti chimici

(tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con l’ossigeno

atmosferico fino ad esaurirlo.

• Gli incubatori speciali a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche

(bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono

umidificate, producono CO2 e H2 e successivamente H2O con scomparsa

dell’ossigeno

INCUBATORI SPECIALI

INCUBATORI SPECIALI

CO2

Diagnosi diretta : identificazione

CRESCITA DI COLONIE BATTERICHE SU

TERRENI DI COLTURA

IDENTIFICAZIONE

Caratteri macroscopici delle colonie

stafilococchi

streptococchi

Gram negativi Enterobatteri Non fermentanti

miceti

Agar sangue

Agar sangue

Agar

Mac Conkey

Agar

Sabouraud e

Terreni cromogenici

PANORAMA SULLA DIVERSITA’ MORFOLOGICA: LE COLONIE

Caratteri macroscopici

Diagnosi diretta : identificazione

ID PRESUNTIVA - Caratteri microscopici (colorazione, forma, organizzazione) - Caratteri macroscopici (aspetto colonia) ID FINALE (DEFINITIVA) -biochimica -immunologica -molecolare

Diagnosi diretta : identificazione biochimica

metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica)

o per via fermentativa (via aerobica)

produzione di specifici enzimi e/o di prodotti metabolici

VALUTAZIONE DELLE CAPACITÀ METABOLICHE DEI MICRORGANISMI

metodi “manuali”o “automatizzati” identificazioni in tempi rapidi (4-6 h)

identificazione manuale

Gram positivi

Stafilococco e streptococco

di forma sferica

riuniti in ammassi irregolari, dall’aspetto di

grappoli, del diametro di 0.8-1 μm

immobili

privi di capsula evidente

asporigeni

Cocchi Gram positivi catalasi-positivi

Gram positivi

Test CATALASI

2 H2O2 2 H2O + O2

Test: alcune goccie di H2O2 3% direttamente su colonie su

terreno solido (non AS); oppure mischiare una aliquota di

coltura (colonia o coltura liquida) con alcune goccie di H2O2

3% su vetrino portaoggetti e quindi coprire con vetrino

coprioggetti.

Test positivo: sviluppo rapido di effervescenza (O2)

positivo: Staphylococcus

negativo: Streptococcus

Stafilo e strepto

la coagulasi è un enzima liberato da alcuni batteri in grado di

coagulare il plasma citrato di coniglio.

E' possibile produrre due forme differenti di coagulasi, libera o

legata. Il test in provetta è in grado di rilevare la presenza di

coagulasi libera e legata.

test coagulasi

positivo: Staphylococcus aureus

negativo: Staphylococcus epidermidis

Gram positivi

Esame microscopico cocchi gram positivi Aspetto delle colonie su agar sangue di S.aureus

Classificazione degli streptococchi clinicamente significativi

sferici, con diametro di 1-1.5 μm, disposti in

coppie o catenelle

capsulati

immobili

asporigeni

ossidasi-negativi

catalasi-negativi

aerobi-anaerobi facoltativi

Cocchi Gram positivi: Streptococchi

Cocchi Gram positivi: Streptococcus pyogenes

Agar Sangue (5% sangue di montone)

Incubazione a 37 C in presenza di 5% CO2

cresce anche in atmosfera aerobia

emolisi totale (di tipoβ)

Test della identificazione dell’antigene

polisaccaridico C metodica di Lancefield

(agglutinazione)

Test della sensibilità alla bacitracina

Cocchi Gram positivi: Streptococchi e enterococchi

Streptococcus agalactiae

Non presentano emolisi, solo raramente

presentano emolisi β.

Sono caratterizzati dal possesso

dell’antigene polisaccaridico di gruppo B

Enterococchi

Appartengono al genere Streptococcus.

Non presentano emolisi, solo raramente

presentano emolisi β. Sono caratterizzati

dal possesso dell’antigene polisaccaridico

di gruppo D

Cocchi Gram positivi: Streptococcus pneumoniae

AgarSangue (5% sangue di montone)

Incubazione a 37 C in presenza di 5% CO2

cresce anche in atmosfera aerobia.

emolisi parziale del sangue (di tipo α)

Test della sensibilità all’optochina

Gram negativi

Proteus su Agar sangue e mac conkey

Escherichia coli

su Agar mac conkey

pseudomonas su Agar mac conkey

Gram negativi

Non fermentanti fermentanti

Bacilli Gram negativi: Enterobacteriaceae

terreno indicatore McConkey Agar

Vengono incubate a 37 C in atmosfera aerobia

Bacilli Gram-negativi

asporigeni

mobili per ciglia peritriche o immobili

provvisti di pili

aerobi o anaerobi facoltativi

ossidasi-negativi

bastoncelli diritti o incurvati

mobili (uno o più flagelli polari)

isolati o a coppie o in brevi catene

asporigeni

catalasi-positivi

ossidasi-positivi

aerobi

Bacilli Gram negativi: non Enterobacteriaceae o batteri

non fermentanti

non fermentano gli zuccheri

Esame microscopico col.Gram P.aeruginosa

Il test dell’ossidasi differenzia gli enterobatteri dai batteri gram negativi non

fermententi.I batteri lattosio non fermentanti ( pseudomoniaceae ) posseggono

l'enzima citocromo ossidasi, la cui presenza può essere messa in evidenza dalla

ossidazione di un accettore artificiale di elettroni la tetra-metil-para-fenilendiammina

Crescono su qualsiasi terreno

Gram negativi : salmonella

bacilli Gram-negativi asporigeni,

aerobi facoltativi. Fermentano il

glucosio, producendo gas (acido

solfidrico), riducono i nitrati e non

producono citocromo-ossidasi. La

maggior parte non fermenta il lattosio

Salmonella Colorazione rosa su terreno cromogeno

Salmonella colonie nere produttrici (acido solfridico)

Bacilli Gram negativi: Haemophilus

Cresce su Agar Cioccolato (10% sangue di montone emolizzato

incubazione a 37 C in presenza di 5%CO2

Fattore X, termostabile

Fattore V, termolabile (NAD)

Alternativamente può essere seminato su terreno

TSA (Tryptic Soy Agar) addizionato dei fattori X +V

ID BIOCHIMICA : metodo manuale (BioMèrieux) identification System

ID BIOCHIMICA : metodo automatizzato SIEMENS

Grazie