Prof. Dott. Francesco Fiume

Famiglia Caulimoviridae

Classificazione

Gruppo IV (+ssRNA)

Ordine Ortervirales

Famiglia Caulimoviridae

La famiglia Caulimoviridae include i seguenti generi:

1. Solendovirus, con 2 specie:

1. Tobacco vein clearing virus (TVCV)

2. Sweet potato vein clearing virus (SPVCV)

2. Tungrovirus, con 1 specie:

1. Rice tungro bacilliform virus (RTBV)

3. Cavemovirus, con 2 specie:

1. Cassava vein mosaic virus (CsVMV)

2. Sweet potato collusive virus (SPCV)

4. Petuvirus, con 1 specie:

1. Petunia vein clearing virus (PVCV)

5. Caulimovirus, con 11 specie:

1. Thistle mottle virus (ThMoV)

2. Strawberry vein banding virus (SVBV)

3. Horseradish latent virus (HRLV)

4. Mirabilis mosaic virus (MIMV)

5. Figwort mosaic virus (FMV)

6. Dahlia mosaic virus (DMV)

7. Carnation etched ring virus (CERV)

8. Cauliflower mosaic virus (CaMV)

9. Lamium leaf distortion virus (LLDV)

10. Soybean Putnam virus (SPUV)

11. Atractylodes mild mottle virus (AMMV)

6. Soymovirus, con 4 specie:

1. Peanut chlorotic streak virus (PCSV)

2. Soybean chlorotic mottle virus (SbCMV)

3. Blueberry red ringspot virus (BRRV)

4. Cestrum yellow leaf curling virus (CmYLCV)

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7. Badnavirus, con 40 specie:

1. Aglaonema bacilliform virus (ABV)

2. Banana streak GF virus

3. Banana streak IM virus

4. Banana streak MY virus

5. Banana streak OL virus (BSOLV)

6. Banana streak UA virus (BSUAV)

7. Banana streak UI virus

8. Banana streak UL virus

9. Banana streak UM virus

10. Banana streak VN virus

11. Bougainvillea chlorotic vein banding virus

12. Cacao swollen shoot CD virus (CSSCDV)

13. Cacao swollen shoot Togo A virus

14. Cacao swollen shoot virus

15. Canna yellow mottle virus

16. Citrus yellow mosaic virus

17. Commelina yellow mottle virus

18. Dioscorea bacilliform AL virus

19. Dioscorea bacilliform SN virus

20. Fig badnavirus 1

21. Gooseberry vein banding associated virus (GVBaV)

22. Grapevine Roditis leaf discoloration-associated virus

23. Grapevine vein clearing virus

24. Kalanchoë top-spotting virus

25. Mulberry badnavirus 1

26. Pagoda yellow mosaic associated virus

27. Pineapple bacilliform CO virus (PBCOV)

28. Pineapple bacilliform ER virus

29. Piper yellow mottle virus

30. Rubus yellow net virus

31. Schefflera ringspot virus

32. Spiraea yellow leafspot virus

33. Sugarcane bacilliform Guadeloupe A virus

34. Sugarcane bacilliform Guadeloupe D virus

35. Sugarcane bacilliform IM virus

36. Sugarcane bacilliform MO virus

37. Sweet potato pakakuy virus

38. Taro bacilliform CH virus (TaBCHV)

39. Taro bacilliform virus

40. Yacon necrotic mottle virus

8. Rosadnavirus, con 1 specie:

1. Rose yellow vein virus (RYVV).

Caulimoviridae è una famiglia di virus che infettano le piante. Le specie di questa famiglia, come si

può osservare, sono divise tra 8 generi. I virus appartenenti alla famiglia Caulimoviridae sono

definiti virus a doppia elica (dsDNA), con trascrizione inversa (o pararetrovirus), cioè virus che

contengono una fase di trascrizione inversa nel loro ciclo di replicazione. Questo processo,

catalizzato dall’enzima virale trascrittasi inversa, produce un provirus a DNA formato da cDNA

(DNA complementare, trascritto a partire dal genoma a RNA), che rappresenta la forma sotto cui il

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genoma virale si integra nel DNA della cellula ospite. Il provirus risiede stabilmente nel genoma

della cellula ospite, attivandosi di tanto in tanto per produrre nuovi virioni.

Quando ciò accade, il provirus viene trascritto in mRNA, che poi viene tradotto nelle proteine virali.

Le glicoproteine virali si inseriscono nella membrana plasmatica della cellula ospite, che poi

diventerà il rivestimento virale o capside.

Altre proteine virali formeranno il capside, che racchiude le molecole di RNA virale. La liberazione

dei virioni dalla cellula ospite avviene per un processo di gemmazione molto simile all’esocitosi

(figura 1). In linea di principio, quasi ogni tappa di questo complesso ciclo può essere oggetto di

attacco da parte di farmaci. Questo fatto viene sfruttato dai ricercatori nel loro sforzo di debellare il

virus.

Figura 1 - Il ciclo riproduttivo dell’HIV. Questo retrovirus penetra

nella cellula ospite in seguito alla fusione del proprio

rivestimento con la membrana cellulare. La trascrizione

inversa dell’RNA retrovirale produce successivamente un

provirus a DNA, ovvero una molecola di DNA

complementare che si inserisce nel genoma della cellula

ospite.

Questa famiglia contiene tutti i virus delle piante con un genoma dsDNA che ha una fase di

trascrizione inversa nel ciclo vitale.

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Struttura delle particelle virali e replicazione

Tutti le specie virali di questa famiglia hanno le particelle virali senza capside avvolgente,

bacilliformi o isometriche. Il tipo di nucleocapside incorporato nella struttura del virus determina la

dimensione delle particelle virali. Le particelle bacilliformi hanno un diametro di circa 35-50 nm e

una lunghezza fino a 900 nm. Le particelle isometriche hanno un diametro medio di 45-50 nm e

mostrano la simmetria icosaedrica.

I genomi dei virus di questa famiglia contengono dsDNA circolare monopartito, non covalentemente

chiuso, di 7,2-9,3 kbp, con discontinuità in entrambi i filamenti del genoma in punti specifici. Questi

genomi contengono una open reading frame (ORF), come osservato nei petuvirus, a otto ORF, come

nei soimovirus. Le proteine codificate dai genomi virali includono la trascrittasi inversa, la

ribonucleasi H, le proteasi, i nucleocapsidi e i transattivatori; inoltre, ci sono altre proteine essenziali

per la replicazione le quali devono ancora essere assegnate ad una funzione specifica.

In sintesi le specie virali di questa famiglia hanno tutte un capside non avvolto, una disposizione

genomica circolare ed una segmentazione genomica monopartita. Hanno una struttura icosaedrica

ed una simmetria T=7 ad eccezione dei Badnavirus e dei Tungrovirus che hanno, invece, una

struttura bacilliforme ed una struttura T=3.

La replicazione dei Caulimoviridae ha luogo sia nel citoplasma che nel nucleo delle cellule ospiti.

In primo luogo, il genoma virale entra nel citoplasma. Il DNA virale forma strutture mini-

cromosomiche sovraffollate, entrando nel nucleo ospite, dove viene trascritto in RNA poliadenilato

che è terminalmente ridondante (a causa della trascrizione che si verifica due volte per alcune parti

del DNA). Nella figura 2 è riportato lo schema della trascrizione del DNA in RNA.

Figura 2 - Schema della trascrizione del DNA in RNA.

L'RNA appena trascritto entra nel citoplasma dove viene tradotto in proteine virali o retrotrascritto

in nuove copie del genoma virale del dsDNA, mediante la trascrittasi inversa virale. Nuovi genomi

di dsDNA sono incapsidati nel citoplasma e rilasciati.

Il processo di replicazione coinvolge una fase di retrotrascrizione ed un intermedio di RNA, quindi i

virus della famiglia Caulimoviridae non sono considerati veri virus a dsDNA, ma vengono definiti

virus di trascrizione inversa del DNA.

Condividono questa caratteristica con i retrovirus. Tuttavia, a differenza dei retrovirus, i virus della

famiglia Caulimoviridae non richiedono l'integrazione del genoma virale nel genoma dei loro ospiti

per replicarsi e, per questo motivo, il loro genoma non codifica l'integrasi proteica enzimatica.

La presenza di elementi virali endogeni (EVE) nei genomi delle piante è molto diffusa.(Geering et

al., 2014; Diop et al., 2018) e le EVE vegetali più conosciute provengono da virus con genomi del

DNA nella famiglia Caulimoviridae.

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Si pensa che l'integrazione avvenga attraverso l'end-join non omologa (ricombinazione illegittima)

durante i meccanismi di riparazione del DNA. La maggior parte delle EVE delle piante non sono

contagiose.

Tuttavia, le EVE dei Caulimoviridae infettivi sono stati segnalati nel genoma dei virus di Petunia

(Richert‐Pöggeler et al.., 2003), cioè il virus dell’assenza delle nervature fogliari della Petunia

(Gayral et al., 2008), Petunia vein clearing virus, nel genoma di virus del banano (Banana streak

OL virus, Banana streak GF virus, Banana streak IM virus) e nel genoma di virus di Nicotiana

edwardsonii, quale Tobacco vein clearing virus (Lockhar et al., 2000).

Osservando la figura 3 possiamo affermare che l'albero filogenetico è stato generato usando

MEGA4 (Kumar et al., 2008) e l'algoritmo di neighbor joining. Questo è un algoritmo utilizzato per

costruire alberi filogenetici, liberamente ispirato all'algoritmo neighbor joining (Bryant et Moulton,

2003). Come quest'ultimo, il metodo prende una matrice di distanza come input e lavora attraverso

agglomerati di cluster. Tuttavia l'algoritmo neighbor-net può restituire delle collezioni di cluster che

si sovrappongono e che non formano una gerarchia. Queste collezioni sono rappresentate usando un

tipo di rete filogenetica chiamato "split network". Se la distanza della matrice soddisfa le condizioni

combinatorie di Kalmanson, il neighbor-net restituisce il corrispondente ordine circolare.

Il metodo è implementato dal software SplitsTree.

Le distanze (sostituzioni aa per sito) sono state calcolate utilizzando il metodo di correzione di

Poisson, derivato da un allineamento multiplo, utilizzando Clustal W.

I numeri visualizzati nei punti di diramazione indicano i valori di bootstrap.

Il set dei dati è stato sottoposto a 1000 repliche di bootstrap.

Sono state utilizzate sequenze dai seguenti virus:

• Banana streak GF virus (BSGFV; NC_007002.1);

• Banana strip Mysore virus (BSMysV; NC_006955.1);

• Banana streak OL virus (BSOLV; NC_003381.1);

• Blueberry red ringspot virus (BRRSV; NC_ 003138.2);

• Cacao swollen shoot virus (CSSV; NC_001574.1);

• Carnation etched ring virus (CERV; NC_003498.1);

• Cassava vein mosaic virus (CsVMV; NC_001648.1);

• Cauliflower mosaic virus (CaMV; NC_001 497.1);

• Cestrum yellow leaf curling virus (CmYLCV; NC_004324.3);

• Citrus yellow mosaic virus (CYMV; NC_003382.1);

• Commelina yellow mottle virus (ComYMV; NC_001343.1);

• Dahlia mosaic virus (DMV; AY309479.1);

• Dioscorea alata bacilliform virus (DaBV; NC_009010.1);

• Dracaena mottle virus (DraMV; NC_008034.1);

• Fig-wort mosaic virus (FMV; NC_003554.1);

• Horseradish latent virus (HRLV; AY534732.1);

• Kalanchoe top-spotting virus (KTSV; NC_004540.1);

• Mirabilis mosaic virus (MMV; NC_004036.1);

• Peanut chlorotic streak virus (PCSV; NC_001634.1);

• Petunia vein clearing virus (PVCV; NC_001839.2);

• Rice tungro bacilliform virus (RTBV; NC_001914.1);

• Strawberry vein banding virus (SVBV; NC_001725.1);

• Sugarcane bacilliform Mor virus (ScBMV; NC_008017.1);

• Sweet potato badnavirus A (SPBV-A; FJ560943.1);

• Sweet potato badna-virus B (SPBV-B; NC_012728.1);

• Taro bacilliform virus (TaBV; NC_004450.1);

• Tobacco vein clearing virus (TVCV; NC_003378.1).

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Figura 3 - Relazione filogenetica di SPCV con i membri rappresentativi della famiglia

Caulimoviridae sulla base della sequenza parziale amminoacidica (aa) della

replicasi.

Diventa utile approfondire, in questo momento, il concetto di ORF.

Open Reading Frame (ORF)

Open Reading Frame (sigla ORF), in italiano quadro (o cornice) di lettura aperto, è la fase di

lettura che consente di codificare un’intera proteina, senza incontrare codoni di stop prematuri e,

quindi, formare una proteina tronca. Le ORF vengono normalmente individuate spostandosi lungo i

frammenti di DNA durante la ricerca della localizzazione di un gene. Considerando che vi

sono organismi che presentano delle variazioni nella sequenza del codone d'inizio, la ricerca di una

ORF può essere differente, sfruttando ad esempio degli algoritmi costruiti su tutti i genomi esistenti

(inclusi quelli alterati) e su tutte le possibili modalità di lettura.

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Ci sono le definizioni diverse per una ORF. Può essere la sequenza limitata da un codone d'inizio e un

codone di stop, però anche di due codoni di stop, ciascuno all'inizio ed alla fine della ORF (Claverie,

1997; Sieber et al., 2018).

Nei geni eucariotici con esoni multipli, gli introni sono rimossi e gli esoni vengono uniti dopo la

trascrizione per produrre l'mRNA finale per la traduzione della proteina. Quindi, la definizione di ORF

da start a stop si applica solo agli mRNA dopo lo splicing, non al DNA genomico. Gli introni possono

contenere codoni di stop e/o causare spostamenti tra i quadri di lettura. La definizione alternativa dice

che una ORF è una sequenza che ha una lunghezza divisibile per tre ed è senza codoni di stop. Questa

definizione più generale può essere utile anche nel contesto della trascrittomica e della metagenomica,

dove il codone di inizio e/o stop può non essere presente nelle sequenze ottenute. In questo caso, una

ORF corrisponde ad una parte di un gene piuttosto che al gene completo.

È risaputo che l'esistenza di una ORF, soprattutto se lunga, è una buona indicazione della presenza di un

gene nella sequenza posta nelle immediate vicinanze. In tal caso, la ORF stessa fa parte della sequenza

che verrà tradotta dai ribosomi, comprendendo in tutta la sua lunghezza anche le parti che verranno

eliminate prima della sintesi proteica, vale a dire gli introni.

A volte una ORF è semplificata come sequenza di codifica del DNA (CDS). Una CDS è un frammento di

DNA che codifica una proteina. Però una ORF significa un frammento di DNA che può codificare una

potenziale proteina.

La ricerca delle ORF nei procarioti e negli eucarioti. Una volta stabilita la sequenza del gene è

importante determinare la ORF corretta. Per gli organismi con DNA a doppia elica, la sequenza può

essere stabilita in sei modalità di lettura, tre in un verso e tre nel verso opposto. Negli organismi

procarioti, la sequenza più lunga, che risulta priva di un codone di terminazione, costituisce di fatto una

ORF.

Più problematico è il caso degli organismi eucarioti, in quanto la maggior parte del DNA contenuto in

una ORF (quella costituita dagli introni, appunto), non viene tradotta; questa è la ragione per cui, in

questo caso, una ORF può essere trovata soltanto andando ad analizzare l'mRNA, una volta sottoposto al

processo di splicing.

Rapporto con la sequenza di Kozak. Nel DNA, la CDS si trova all'interno degli esoni ed inizia con una

sequenza abbastanza ricorrente, detta sequenza di Kozak, composta dalla sequenza ATG la quale si può

presentare in 3 varianti:

1. La prima presenta in posizione -3 rispetto alla CDS, intendendo con (-) i nucleotidi presenti nella

sequenza, una adenosina o una guanina (es. ACGATG).

2. La seconda presenta una guanosina subito dopo la sequenza di inizio (es. ATGG).

3. La terza presenta in posizione +3 una guanosina (ATGG).

Queste varianti non sono accessorie, ma possono avere notevole importanza nella scelta di quale

sequenza venga tradotta, poiché la presenza di queste favorisce l'attacco dei complessi di traduzione in

determinati punti rispetto ad altri, cosa molto importante in sequenze che possono dare potenzialmente

più trascritti.

La sequenza CDS termina in determinate sequenze, dette di stop, che corrispondono generalmente alla

tripletta TGA.

La strategia di reiniziazione della traduzione attivata del virus dei pararetrovirus delle piante

I pararetrovirus delle piante includono i virus icosaedrici Caulimovirus, Soymovirus, Cavemovirus,

Petuvirus ed i virus bacilliformi e Badnavirus e Tungrovirus. I membri dei Caulimoviridae sono

distinti per alcuni aspetti della loro disposizione del genoma e delle strategie di espressione. Il

genoma del Pararetrovirus vegetali esiste come DNA episomico nei nuclei infetti, come RNA

terminalmente ridondante nel citoplasma e come dsDNA circolare aperto nei virioni. Per la

replicazione sono necessari i geni della proteina capsidica, della proteasi e della trascrittasi inversa/

NAse H e nei pararetrovirus manca l’integrasi (Rothnie et al., 1994). I geni che codificano per una

proteina di movimento (MOV) ed un fattore di trasmissione dell'afide (ATF) sono utilizzati per la

diffusione intra-pianta ed inter-pianta, unitamente ad una proteina associata al virione (VAP),

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necessaria per entrambi i movimenti (Stavolone et al., 2005) e la trasmissione degli insetti (Leh et

al.1999; 2001; Plisson et al., 2005).

Nella figura 4 si osserva la rappresentazione schematica del genoma di CaMV. Mappa circolare di

CaMV DNA (cerchio raddoppiato). Gli ORF sono indicati da frecce nere spesse e codice per

proteina di funzione sconosciuta (VII), proteina di movimento cellula-cellula (MP, I), fattori di

trasmissione degli afidi (ATF, II), proteina associata a virione con funzioni MP e ATF (VAP, III), il

precursore delle proteine del capside (CP, IV), il precursore della proteinasi aspartica, della

trascrittasi inversa e della RNasi H (POL, V) e una proteina di inclusione/transattivatore

traslazionale (TAV, VI). I cerchi interni rappresentano le trascrizioni, le trascrizioni 35S RNA (35S)

e 19S RNA (19S) e due distinte forme di splicing (SF).

Figura 4 - Rappresentazione schematica del genoma di CaMV.

Tutti i generi di pararetrovirus dei vegetali producono un RNA policistronico (ad eccezione di

Petunia vein clearing virus, PVCV) con un singolo ORF che codifica una singola poliproteina che

viene poi scissa nelle proteine virali richieste. Gli RNA policitonici di Caulimovirus, Soymovirus e

probabilmente di Cavemovirus hanno evoluto un nuovo meccanismo di traduzione - la

reintroduzione della traduzione attivata dal virus - che è impiegata per la traduzione dei loro RNA

policentrici pregenomici, tramite la reiniziazione. La reiniziazione della traduzione è insolita negli

eucarioti. Il meccanismo di reiniziazione attivata è sotto il controllo di un fattore di reiniziazione

virale, il fattore transactivator/viroplasmin (TAV). TAV è codificato da ORF VI ed è espresso sia

dagli RNA sottogenomici 35S pregenomici, che da quelli 19S (figura 4). TAV è molto abbondante

nelle cellule infette e forma una matrice densa nel citoplasma. Ha molte funzioni nel ciclo di vita

del virus (Rothnie et al., 1994). Più rilevante è l’importanza per il reintegro della traduzione dei

principali ORF sull'RNA policistronico 35S (Fütterer et Hohn 1991, Scholthof et al., 1992).

La transattivazione della traduzione policistronica è stata scoperta per CaMV (Bonneville et al.,

1989; Fütterer et Hohn, 1991; Scholthof et al., 1992, Zijlstra et Hohn 1992) e subito dopo per il

Figwort mosaic virus, FMV (Gowda et al., 1989) ed il Peanut chlorotic streak virus, PCSV (Maiti

et al., 1998). Infatti, l'espressione del gene reporter da diverse posizioni sui genomi CaMV, FMV e

PCSV nei protoplasti delle piante ha dimostrato una traduzione accoppiata di ORF da I a V sotto il

controllo di TAV (Gowda et al., 1989, Fütterer et al., 1990, Scholthof et al., 1992, Maiti et al.,

1998). Inoltre, la TAV prodotta dall'RNA 19S è in grado di attivare la produzione di TAV da ORF

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VI sull'RNA 35S (Driesen et al., 1993). È importante sottolineare che la traduzione policistronica

attivata da TAV è risultata essenziale per la replicazione di CaMV in una singola cellula

(Kobayashi et Hohn 2003). Di seguito viene riportato lo schema della traduzione dell’mRNA in

sequenza aminoacidica (figura 5)

Figura 5 – Schema della traduzione dell’mRNA in sequenza

aminoacidica.

Ricombinazione nel DNA di CaMV

La ricombinazione è anche comune in CaMV e probabilmente in tutti i Caulimoviridae. Poiché il

CaMV si replica mediante trascrizione inversa, in esso è stata trovata la ricombinazione del DNA e

dell'RNA.

Il fatto che il DNA di CaMV sia convertito in un cerchio ds covalentemente chiuso, per consentire

la trascrizione, mostra che deve esserci un coinvolgimento precoce degli enzimi di riparazione del

DNA della pianta ospite a seguito dell'infezione. Questa idea è rafforzata dal fatto che il DNA

clonato, escisso dal plasmide in forma lineare, è contagioso e che il DNA progenie è circolare. La

co-infezione di piante con mutazioni di delezione difettosa non sovrapposte, porta di solito alla

produzione di particelle virali vitali (Howell et al., 1981). L'analisi del DNA della progenie ha

dimostrato che il salvataggio è dovuto alla ricombinazione piuttosto che alla complementazione.

Lebeurier et al. (1982) hanno mostrato che coppie di genomi CaMV di lunghezza intera,

ricombinanti, non infettivi, integrati con un plasmide in diversi siti, recuperano l'infettività

nell’inoculazione in un ospite appropriato. Nel virus della progenie, tutto il DNA plasmidico è stato

eliminato ed il DNA virale aveva una struttura normale. Walden et Howell (1982) hanno fornito

ulteriori prove per la ricombinazione intergenomica.

Basato su esperimenti con coppie di genomi eterologhi, Geldreich et al. (1986) hanno proposto un

modello per la ricombinazione in CaMV mediata dall'RNA 35S. In questo modello, subito dopo

l'inoculazione, due diversi DNA, con identiche estremità coesive, possono essere legati insieme per

dare un DNA dimero. Questo dimero viene quindi trascritto per generare un RNA ibrido 35S che è

responsabile della formazione del genoma ricombinante mediante trascrizione inversa.

Per studiare i meccanismi di ricombinazione, Vaden et Melcher (1990) hanno inoculato piante di

rapa con coppie di DNA di CaMV mutati ed hanno analizzato la progenie mediante modelli di

frammenti di restrizione e sequenziamento. Hanno trovato prove sia per il DNA, il DNA e la

ricombinazione replicativa. Molte delle chimere avevano giunzioni tra le sequenze dei genitori

presso, o vicino, al sito di inizio della sintesi del filamento DNA (-) o vicino ai siti di iniziazione

per la trascrizione dell'RNA 35S o 19S. Questi sono stati considerati indicativi della commutazione

di trefoli durante la trascrizione inversa. Sono state trovate altre giunzioni che non hanno alcuna

relazione ovvia con la sintesi del DNA (-) del filamento negativo, suggerendo che esse derivano dal

DNA. La delezione di inserti dall'ampia regione intergenica di DNA del CaMV ha anche suggerito

10

la ricombinazione illegittima (Pennington et Melcher, 1993). Simili forme di ricombinazione sono

state trovate per l'interazione di CaMV episomico con sequenze virali integrate (Gal et al., 1992).

Per stimare la frequenza di ricombinazione di CaMV, Froissart et al. (2005) hanno distribuito

quattro marcatori neutrali lungo il genoma virale e le piante ospiti co-inoculate con virus contenenti

marcatori e wild-type. In media, oltre il 50% dei genomi virali recuperati dopo una singola infezione

ospite, 21 giorni dopo l'inoculazione erano ricombinanti e tutte le regioni del genoma sono state

ugualmente colpite da questo processo. Supponendo che durante l'esperimento si siano verificati 10

cicli di replicazione virale, il tasso di ricombinazione per base ed il ciclo di replicazione era

dell'ordine di 2-4 × 10-5, indicando che la ricombinazione è molto frequente nel ciclo di infezione di

questo virus. Non è noto se si tratta di ricombinazione del DNA e/o dell'RNA.

I virus a DNA

Le proteine ospiti sono coinvolte in varie fasi nella replicazione delle tre famiglie di virus delle

piante con genomi a DNA, Geminiviridae e Nanoviridae.

Una fase iniziale della replicazione è l'importazione delle particelle di virus in ingresso dei membri

di tutte e tre le famiglie nel nucleo in modo tale che il genoma virale del DNA possa essere

trascritto da RNA polimerasi dipendenti dal DNA dell'ospite. Questo processo implica l'interazione

tra il CP virale e l'importazione nella membrana nucleare dell’ospite.

Le trascrizioni di RNA dei caulimovirus sono replicate per formare il dsDNA del virione, usando la

trascrittasi inversa codificata da virus per quanto è noto, i fattori ospiti non sono coinvolti nella

trascrizione inversa che si pensa abbia luogo all'interno delle particelle del proto-virus nei corpi di

inclusione.

Il DNA del Geminivirus è replicato dalla DNA polimerasi DNA dipendente. La proteina Rep

codificata con geminivirus, interagisce con la proteina ospite del retinoblastoma per modificare il

ciclo cellulare dalla fase G0/G1 alla S. La proteina Rep interagisce anche con varie altre proteine

ospite.

I virus segnalati che infettano la manioca nel "nuovo mondo" sono diversi ed appartengono alle

famiglie di virus Alphaflexiviridae, Reoviridae, Secoviridae e Luteoviridae tra i virus a RNA e tra i

virus del DNA. A differenza dell'Africa, non sono state segnalate sequenze di geminivirus o di

potyvirus associate a malattie nella manioca nelle Americhe (Calvert et al.,, 2012). Recenti indagini

sul campo in Colombia hanno rilevato l'insorgenza comune di virus associato a Cassava frogskin-

associated virus (CsFSaV) nei campi affetti da CFSD, la malattia più importante dal punto di vista

economico della manioca in America Latina. CsFSaV è un reovirus di particelle isometriche di ~ 70

nm contenenti un genoma costituito da 10 segmenti dsRNA (Calvert et al., 2008). Tali segmenti

possono differire nella distribuzione delle dimensioni e si possono osservare distinti pattern di

dsRNA in campioni raccolti nella regione dell’Amazonia se confrontati con campioni raccolti in

altre regioni della Colombia. Ciò è confermato dalle analisi filogenetiche della regione della

replicasi da diversi isolati che indicano che le sequenze CsFSaV più diverse si trovano nella regione

dell’Amazonia. Sebbene CsFSaV sia associato alla caratteristica dei sintomi della decomposizione

della CFSD, nelle singole infezioni non induce sintomi fogliari nella varietà indicatrice di manioca

"Secundina" (Carvajal-Yepes et al., 2014).

Il secondo virus più comune trovato in Colombia è Cassava torrado-like virus (CsTLV), una specie

di virus appartenente al genere Torradovirus. CsTLV ha un genoma bipartito di ~ 10.000 nt e

particelle di virioni isometrici di ~ 25 nm (Carvajal-Yepes et al., 2014). Particelle simili sono state

precedentemente osservate nei preparati di CsFSaV da piante affette da CFSD (Calvert et al., 2008),

ed il virus è stato anche rilevato in campioni congelati da piante sintomatiche che sono state raccolte

negli anni '80, suggerendo che il virus è stato presente più a lungo di quanto si pensasse (Carvajal-

Yepes et al., 2014). Se analizzati a livello di sequenza, viene rilevato un alto grado di variabilità e

persino i primer generici (Verbeek et al., 2012) non sono in grado di rilevare tutti gli isolati raccolti

nella stessa regione (Carvajal-Yepes et al., 2014) .

Cassava common mosaic virus, CsCMV (Costa, 1940) è stato riportato in diversi paesi del Sud

America in associazione con i sintomi del mosaico e della clorosi nelle foglie (Calvert et al., 2012),

11

anche se recenti riesami di alcuni di questi campioni hanno registrato la presenza di nuovi virus

descritti di recente che potrebbero aver contribuito ai sintomi inizialmente attribuiti a CsCMV.

CsCMV appartiene al genere Potexvirus con particelle semiflessuose, lunghe 15×495 nm (Kitajima

et al., 1965). Ad oggi, ci sono solo due sequenze segnalate di isolati CsCMV dal Brasile. Identità

dell'80% di nucleotide, sembra probabile che esistano per altri ceppi distinti del virus.

Cassava vein mosaic virus (CsVMV), riportato per la prima volta in Brasile nel 1940 (Costa, 1940),

è la specie tipo del genere Cavemovirus (famiglia Caulimoviridae). È l'unico pararetrovirus della

manioca e finora è stato segnalato solo in Brasile. Le particelle virali sono semisferiche, del

diametro di 45-50 nm e incapsidano un singolo genoma circolare dsDNA di ~ 8159 bp (de Kochko

et al., 1998). I sintomi virali nelle piante infette comprendono la clorosi lungo le nervature, il

mosaico e la distorsione delle foglie. CsVMV si diffonde facilmente attraverso la propagazione

vegetativa, ma la trasmissione attraverso il seme o un vettore rappresentato da un insetto non è stata

rilevata. Vi sono scarse informazioni sulla biologia, l'epidemiologia o il controllo della malattia.

Uno studio suggerisce che ci sono differenze non significative nella resa tra le piante infette da

CsVMV e non infette (Santos et al., 1995). Tuttavia, la sequenza del promotore 35S derivata dal

genoma di CsVMV è ampiamente utilizzata come promotore costitutivo nell'ingegneria genetica

delle piante (Verdaguer et al., 1996).

Una vasta gamma di potexvirus, meccanicamente trasmessi, è stata rilevata nella manioca senza

sintomi, tra cui il virus della manioca X (CsVX) e il nuovo Alphaflexivirus di Cassava (CsNAV)

(Carvajal-Yepes et al., 2014; Harrison et al., 1986). Tuttavia, poiché questi virus non causano

sintomi, è difficile determinarne la distribuzione o valutarne l'importanza. Infatti, almeno quattro

altri potexvirus che infettano la manioca sono stati segnalati dagli anni '60, ma per questi non sono

disponibili sequenze o addirittura antisieri, quindi non è ora possibile identificarli a livello di specie.

Diversità virale

Il genere Badnavirus è il genere più complesso e più diversificato all'interno della famiglia

Caulimoviridae, con almeno tre cladi principali (Harper et al., 2004, 2005; King et al., 2012). Una

filogenesi finale di BSV è stata stabilita per chiarire se sequenze parziali distribuite sui tre cladi

principali del genere Badnavirus corrispondano a virus episomali con o senza una controparte

endogena (Gayral et Iskra-Caruana, 2009; Iskra-Caruana et al., 2014; Iskra-Caruana et al., 2014). I

cladi 1 e 3 sono dedicati a BSV ed il clade 2 raccoglie tutte le sequenze del virus di Badia del

genere Musa endogena, senza alcuna controparte episodica riportata finora in Chabannes et Muller,

2014.

I Badnavirus, in figura 4, corrispondono a virus episomali con o senza una controparte endogena

(Gayral et Iskra-Caruana, 2009; Iskra-Caruana, Chabannes, Duroy, et al., 2014; Iskra-Caruana,

Duroy, Chabannes, et Muller, 2014).

I cladi 1 e 3 sono riferiti a BSV e il clade 2 raccoglie tutte le sequenze dei badnavirus endogeni di

Musa, senza alcuna controparte episomale riportata finora in Chabannes et al. Il clade 1 raggruppa

anche le quattro specie di BSV che hanno una controparte eBSV nel genoma B (BSOLV, BSGFV,

BSIMV e BSMYV). Il clade 3 raggruppa solo le specie BSV dell'Uganda.

Nella figura 6, i valori di bootstrap di 500 repliche vengono forniti per valori del 50%. Taro

bacilliform virus (TABV) e Bougainvillea spectabilis chlorotic vein-banding virus (BCVBV) sono

forniti come outgroup.

Le sequenze virali isolate da Musa sono in grassetto. Le specie BSV in cui è disponibile una

sequenza a lunghezza intera sono in corsivo.

La barra della scala mostra il numero di sostituzioni per base.

I numeri delle accessioni di GenBank delle sequenze sono indicati tra parentesi: Cacao swollen

shoot virus (CSSV), Commelina yellow mottle virus (ComYMV), Citrus yellow mosaic virus

(CiYMV), Dioscorea bacilliform AL virus (DBALV), Dioscorea bacilliform SN virus (DBSNV),

Kalanchoe top-spotting virus (KTSV), Sugarcane bacilliform MO virus (SCBMOV), Sugarcane

bacilliform IM virus (SCBIMV), Sugarcane bacilliform Guadeloupe A virus (SCBGAV), Sugarcane

12

bacilliform Guadeloupe C virus (SCBGCV) e Sugarcane bacilliform Guadeloupe D virus

(SCBGDV).

Figura 6 – Filogenesi di massima verosimiglianza delle sequenze dei Badnavirus basate

sull'allineamento di un frammento di 540-bp della regione virale RT/RNasi H.

13

Strategie virali di iniziazione alla traduzione: derivazione ribosomiale e reiniziazione

A causa della compattezza del loro genoma, i virus sono adatti per lo studio dei meccanismi di

espressione di base, compresi i dettagli della trascrizione, dell'elaborazione dell'RNA, del trasporto

e della traduzione.

In effetti, la maggior parte dei principi di base di questi processi sono stati descritti per la prima

volta nei sistemi virali. Inoltre, i virus sembrano non rispettare le regole di base ed i casi di strategie

di espressione "anormali" sono piuttosto comuni, sebbene di solito tali strategie vengano infine

osservate in rari casi di espressione genica cellulare.

Per quanto riguarda la traduzione, i virus violano molto spesso la regola originale di Kozak per cui

la traduzione eucariotica parte da un mRNA monocistronico incapsulato e comporta la scansione

lineare per trovare il primo codone di inizio adatto.

Pertanto, sono stati descritti molti casi virali in cui la traduzione è iniziata da RNA non incapsulato,

utilizzando un sito di ingresso del ribosoma interno. Altre strategie di traduzione virale sono usate,

ovvero lo smistamento e la reiniziazione controllata dal virus, come descritto per la prima volta nei

pararetrovirus delle piante (Caulimoviridae).

Nello smistamento, le parti principali vengono bypassate e non fuse mediante la scansione dei

ribosomi. Nei Caulimoviridae, questo processo è accoppiato alla reiniziazione dopo la traduzione di

una piccola ORF; in altri casi, è possibile iniziare con la pausa del ribosoma di scansione.

La maggior parte dei Caulimoviridae produce mRNA policistronici.

Due meccanismi di base sono impiegati per la loro traduzione. La traduzione alternativa delle ORF

a valle nei Caulimoviridae bacilliformi si verifica con un meccanismo di scansione e di reinizio

della traduzione policistronica in molti dei Caulimoviridae icosaedrici consentita dall'azione di un

transattivatore virale.

Nella figura 7 è riportato l’inizio del percorso della traduzione:

Step 1. Separazione dei ribosomi 80S nelle sub unità ribosomali 40S e 80S. Il gruppo delle

piccole subunità ribosomali è poi attivato mediante legame di eIF1A, eIF1 e il più grande eIF,

l’eIF3 (Peterson et al., 1979; Phan et al., 1998; Chaudhuri et al., 1999; Majumdar et al., 2003).

Molto importante è che eIF3 può supportare la dissociazione di 80Sin presenza di mRNA o del

complesso ternario (TC, Met-tRNAiMet/eIF2/GTP) e di eIF1 nei mammiferi (Unbehaun et al., 2004;

Kolupaeva et al., 2005).

Step 2. Associazione di TC a subunità 40S. La subunità ribosomale 40S, insieme con eIF3,

eIF1A, eiF5 e TC formano un complesso preiniziale 43S. Mediante eIF3, eIF1 e eIF1Apuò

direttamente legare 40S, stimolando in tal modo la formazione del complesso 43S, in TC è

associato con eIF3, eIF1, eIF1A, eIF5 in un pre-esistente complesso multifattore che può interagire

con il 40S (Asano et al., 2000). Eif2 interagisce con eIF3 direttamente attraverso la subunità eIF3a e

indirettamente attraverso eIF5, collegando i due fattori.

Step 3. Innesco della struttura mRNA 5’-terminatore attraverso eIF4F, eIF4A e eIF4B. eIF4F

è compreso nel fattore di legame eIF4E, l’eIF4A elicasi RNA dipendente dell’ATP ed una proteina

scaffoide eIF4G, che contiene domini di legame per eIF4E, eIF4A e la proteina poly(A) di legame

(PABP) come indicato in Sachs, 2000 e Gross et al., 2003. eIF4A, l’elicasi del box DEAD,

partecipano nello svolgimento di ATP dipendente della struttura secondaria dell’mRNA; la sua

attività di fusione dell’RNA è stimolata da eIF4G e eIF4B (Roger set al., 2002). eIF4G può

reclutare altri fattori, incluso eIF3 e PABP attraverso interazioni dirette proteina-proteina (Gallie,

2002). Eif4B promuove l’attività idrolitica dell’RNA dipendente e l’attività elicasi dell’RNA

dipendente da ATP di eIF4Ain mammiferi (Jaramillo et al., 1990) e piante (Metz et al., 1999) e

media il legame di mRNA ai ribosomi (Trachsel et al., 1997; Benne et Hershey, 1978; Morino et

al., 2000). eIF4B può fisicamente interagire con eIF3 in lievito e nelle piante (via eIF3g) come

risulta in Méthod et al., 1996).

PABP lega alla coda della poly(A) presente al terminale 3’ degli mRNA cellulari e l’interazione tra

PABP e eIF4G porta entrambi i termini di un mRNA in prossimità spaziale chiusa risultando una

circolarizzazione in mRNA (Wells et al., 1998°; Sacs, 2000; Gallie, 2000).

14

Step 4. Legame di mRNA al complesso 43S. eIF4G e, apparentemente, eIF4B potenzialmente

servono come centro di organizzazione per il carico del complesso di preiniziazione 43S sul

terminatore 5’ dell’mRNA, principalmente attraverso l’interazione fea PABP, eIF4G, eIF4B, eIF3,

eIF2 e mRNA (Gingras et al., 1999; Sachs, 2000; Jivotovkaya et al., 2006).

Step 5. Scansione dell’mRNA leader e inizio del codone di riconoscimento. Il complesso 43S

caricato al terminatore 5’ dell’mRNA scansiona la sequenza leader a valle fino all’incontro del

primo codone di partenza in un contesto di iniziazione ottimale quale (A/G)CCAUG(G) come

indicato da Kozak 1987a e 1991. Il processo di scansione del complesso di preiniziazione 43S

richiede l’idrolisi dell’ATP ed esso è dipendente di due eIF, eIF1 e eIF1A, i quali sono richiesti per

il complesso ribosomale per localizzare il codone di iniziazione (Pestova et al., 1998). La selezione

del sito di partenza richiede la cooperazione tra il ribosoma di scansione e eIF1, eIF2 e che formano

il complesso di preiniziazione al codone ottimale di inizio (Donahue, 2000; Pestova et al., 2002). Di

conseguenza Met-tRNAiMet sarà allocata nel sito ribosomale P (sito di legame al ribosoma peptidyl

-tRNA) dove l’anticodone di Met-tRNAiMet ed il codone AUG sono accoppiati alla base.

Step 6. Accoppiamento della subunità 60S. Appena il complesso 48S è formato, eIF5 (una

GTPase che attiva una proteina) stimola l’idrolisi di eIF2 legata a GTP e quest’ultima (eIF2 legata a

GTP) è rilasciata dal complesso di preiniziazione 48S (Merrick, 1992). L’accoppiamento della

subunità richiede anche un fattore addizionale chiamato eIF5B, il quale possiede un ribosoma

dipendente dall’attività della GTPase (Pestova et al., 2000). eIF5B catalizza l’accoppiamento della

subunità ribosomale e tutti gli altri fattori di iniziazione sono presumibilmente rilasciati (Unbehaun

et al., 2004). Il complesso 80S risultante è pronto ad entrare nella fase di allungamento della

traduzione. Il riciclo dell’eIF2 legata a GTP ad eIF2 legata a GTP è stimolato da eIF2B.

Il meccanismo di traduzione delle piante, nonostante ha alcuni fattori specifici delle piante,

assomiglia molto a quello dei mammiferi. Sebbene molti eIF sono generalmente simili a quelli degli

eucarioti, ci sono poche differenze tra i fattori di iniziazione della traduzione dei mammiferi

(Browning, 2004). Per esempio, molte piante posseggono una forma di isoenzima di eIF4F,

chiamato eIF(iso)4E e eIF(iso)4G che mostra preferenze per iniziazioni a regioni non strutturate e

non codificanti (Gallie et Browning, 2001). Nel caso di eIF4B, c’è essenzialmente una mancanza di

conservazione al livello della sequenza dell’aminoacido primario tra il lievito, i mammiferi e le

piante (Metz et al., 1999). La pianta eIF4B contiene tre domini di legami dell’RNA, due domini di

legame per PABP ed eIF4A e un sito di legame per eIF(iso)4G (la pianta isoforma di eIF4G, come

indicato da Ceng et Gallie, 2006.

Allungamento della traduzione

Il ciclo di allungamento dei ribosomi degli eucarioti è fondamentalmente simile a quello dei

procarioti e consiste di tre fasi principali (Merrick et Nyborg, 2000):

1) legame del codone dipendente di aminoacyl-tRNA

2) transpeptidazione

3) translocazione

I siti di legame di aminoacyl-tRNA e di peptidyl-tRNA sul ribosoma sono stati designati come siti

A e P, rispettivamente.

I fase. Legame dell’aminoacyl-tRNA al sito A. A questo punto il peptidyl-tRNA occupa il sito P.

L’aminoacyl-tRNA, complessato con eEF1 e GTP, entra nel ribosoma e si lega al codone di mRNA

posizionato nel sito A del ribosoma 80S. Questo legame è accompagnato dall’idrolisi delle

molecole di GTP e rilascio del complesso eEF1/GDP.

eEF1 consiste nella subunità eEF1A, con legami GTP ed allungatore tRNA, eIF1B, un complesso di

tre subunità che è un fattore di cambio del nucleotide della guanina per eF1A. L’olofattore eEF1

contiene tutte le quattro subunità ed è conosciuto come eEF1H.

II fase. Transpeptidazione. Questa è catalizzata dal suo ribosoma ed interviene tra l’aminoacyl-

tRNA nel sito A ed il peptide del terminale C essendo trasferito all’aminoacyl-tRNA. Di

conseguenza, il peptidyl-tRNA allungato ora occupa il sito A mentre il tRNA deacilato formato

nella reazione è riallocato al sito P.

15

III fase. Translocazione. Il ribosoma interagisce con eEF2, una proteina di subunità singola, GTP e

questo catalizza lo spostamento del peptidyl-tRNA (il suo tRNA residuo) con il codone modello

dal sito A al sito P, osì come il rilascio del tRNA deacilato dal sito P.

Durante questi eventi, GTP subisce l’idrolisi e eEF2/GDP è rilasciato dal ribosoma. Alla fine di

ogni ciclo il peptidyl-tRNA è allocato nel sito P mentre il successivo codone modello è localizzato

nel sito A; così il sito A è pronto ad accettare la successiva molecola di aminoacyl-tRNA.

La traduzione dell’mRNA e corrispondente allungamento sul ribosoma sono ottenuti attraverso la

ripetizione del ciclo.

Termine della traduzione

Il termine della traduzione è innescata dai fattori di rilascio del peptide eRF1 ed eRF3. eRF1

riconosce tutti e tre i codoni del termine della traduzione, UAA, UAG e UGA al sito A ribosomale

ed induce idrolisi del peptidyl tRNA al sito P (Konecki et al., 1977; Frolova et al., 1994).

Di conseguenza, il polipeptide è rilasciato dal ribosoma.

La funzione del secondo fattore di terminazione della traduzione, eRF3, non è ancora ben

conosciuta (Kisselevet et Buckingham, 2000), tuttavia è noto che interagisce con GTP e mostra

un’attività GTPasi, in presenza di ribosomi.

Pertanto è evidente che eRF3 insieme a GTP può formare un complesso con eRF1. Tuttavia, è il

complesso eRF1/GTP che può essere l’unità funzionale richiesta per la terminazione sul ribosoma

eucariotico in un modo di dipendenza del GTP.

Perdita del terminatore canonico dell’ RNA

Gli studi sui virus delle piante hanno rivelato una varietà di elementi ad azione cis che influenza o

regola l’espressione dello specifico mRNA in meccanismi di iniziazione alternativa.

Questi meccanismi normalmente coinvolgono saltando uno o più fasi dell’inizio del percorso della

traduzione cap (cappuccio) dipendente (figura 5) e può procedere senza alcuni degli standard eIF.

Si è pensato che i virus hanno sviluppato alcuni meccanismi alternativi per garantire che gli mRNA

virali siano preferenzialmente tradotti in una cellula ospite sotto condizioni di infezione virale.

Indagini su questi meccanismi di iniziazione anormali o devianti hanno incrementato notevolmente

la comprensione dei percorsi di traduzione “standard”.

La coda della struttura cap e poly(A) sono importanti determinanti del percorso di iniziazione della

traduzione della cap dipendente.

La circolazione di mRNA nelle piante è mediata da un limite di PABP alla coda di poly(A) e di

eIF4F o di eIF(iso)4F alla struttura di cap (Gallie, 2002).

Studi in estratti di germe di frumento indicano che queste proteine interagiscono con il terminale di

RNA sinergicamente, incrementando le affinità del loro legame del RNA (Le et al., 1997; Wei et

al., 1998).

PABP incrementa anche le attività dell’elicasi dell’ATPasi e di RNA dei fattori di iniziazione della

traduzione eIF4A, eIF4B ed eIF-iso4F (Bi et Goss, 2000).

Pertanto, si propone che la circolazione dell’mRNA aumenta l’efficienza della iniziazione

traduzionale promuovendo il riciclo dei ribosomi di terminazione sullo stesso RNA (Wells et al.,

1998a).

Nel lievito, durante il turnover dell’mTRA, PABP può proteggere il terminatore 5’ dall’attacco di

Dcp1p, l’enzima del lievito che causa la privazione della struttura del cap (Beelman et al., 1996).

Una relativa piccola proporzione dei virus a RNA a filamento positivo contiene sia una coda cap e

sia una coda poly(A).

Molti gruppi di virus delle piante contengono gli RNA che sono né provvisti di cap, né

poliadenilati.

Tuttavia, la circolazione di questi RNA virali è ancora possibile mediante elementi alternativi

dell’RNA o attraverso proteine virali e/o dell’ospite, mediante la sostituzione di contatti ponte

molecolari (figura 7).

16

Figura 7 – Inizio del percorso della traduzione. Separazione dei ribosomi 80S nelle sub unità

ribosomali 40S e 80S (step 1); associazione di TC a subunità 40S (step 2); innesco

della struttura mRNA 5’-terminatore attraverso eIF4F, eIF4A e eIF4B (step 3); legame

di mRNA al complesso 43S (step 4); scansione dell’mRNA leader e inizio del codone

di riconoscimento (step 5); accoppiamento della subunità 60S (step 6).

17

Figura 8 – 5’-3' modello a ciclo chiuso nei virus delle piante. Interazioni proposte tra termini di

mRNA implicate nella valorizzazione della traduzione nell'RNA(+) nei virus nella

pianta. (1) Interazioni proteina-proteina per le convenzionali interazioni 5’,3’ nelle

piante tra elF4E/ielF(iso)4E-elF4G/elF(iso)4G, elF4G/e1F(iso)4G-PABP e PABP-

elF4B; (2) TEV RNA ha una proteina VPg che sostituisce la struttura del cappuccio.

efF4G/eIF(iso)4G si lega contemporaneamente al nodo PKI dell'elemento TEV IRES e

al limite di poly (A), PABP. Il ruolo di elF4E/e1F(iso)4E attaccato a VPg nella

traduzione non è chiaro. TMV (3), TYMV (4) e AMV R1NA (5) rappresentano RNA

virali incapsulati senza coda poli (A). Per TYMV RNA, l'interazione di eEF1A con la

valina aminoacilata 3’-terminale RNA-simile struttura (TLS) può essere implicata nella

formazione di una struttura ad anello chiuso. Questo non è un caso per TMV RNA,

dove HSP101 e/o eEF1A legato a monte del pseudonodot (PK1) può aiutare a

circoscrivere l'RNA di TMV. Il ruolo di HSP101, l'interazione di cui con la sequenza Ω

è richiesta per l'effetto di miglioramento di Ω nella traduzione, nella formazione a

circuito chiuso non è chiaro. In AMV, il legame simultaneo di molecole di proteina di

rivestimento (CP) a CPB2 e elF4G/eIF(iso)4G legato alla struttura del cappuccio tramite

elF4E/eIF(iso)4E è richiesto per una traduzione efficiente ed è coinvolto nella

formazione a circuito chiuso. (6) Le interazioni RNA-R1NA nell'RNA di STNV sono

mediate da eIF4E/eIF(iso)4E-eIF4G/eIF (iso)4G, dove elF4E/eIF(iso)4E si lega a TED

entro 3'-UTR. Il 5’-UTR del cappio dello stelo include l'accoppiamento diretto della

base all’RNA ribosomiale 18S; (7) Sono indicate le interazioni RNA-RNA dirette per

isolare l’RNA genomico di BYDV. Gli elementi Cis dell’ RNA, come la struttura

(7mG) e la coda poli(A) (AAAAAAAAAAAA) sono indicati. I punti interrogativi

indicano dettagli sconosciuti.

18

Iniziazione interna indipendente del cap

Alcuni (+) ssRNA dei virus della pianta, compresi quelli delle grandi famiglie dei Potyviridae e

Comoviridae hanno sostituito il cap mediante una piccola proteina, VPg (proteina virale del genoma

connsso), che è covalentemente attaccato al primo nucleotide dell’mRNA. Potyvirus e comovirus

assomigliano molto ai picornavirus e calicivirus degli animali nella struttura del genoma e per avere

una VPg. Tuttavia, tutti questi virus posseggono una coda convenzionale poli(A). Mancando un

cap, sembrano affidarsi a un percorso di traduzione interna di iniziazione. Il sito di ingresso del

ribosoma interno (IRES) è una sequenza di RNA che promuove il legame diretto della subunità

ribosomale alle regioni interne dell’mRNA, di solito a monte del principale sito di partenza

dell'ORF, saltando così il requisito della proteina legante il cappuccio, eIF4E (Hellen et Sarnow,

2001).

Le IRES dei picornavirus animali sono state le prime ad essere scoperte e sono gli elementi

maggiormente studiati che guidano l’iniziazione interna. I genomi di RNA dei picornavirus

contengono una vera grande leader strutturata con una IRES che promuove entro la subunità

ribosomiale 40S vicine il codone di partenza AUG per le maggiori poliproteine (Jackson, 2005).

Nel legame diretto di eIF4G al virus dell’encefalomiocardite (EMCV) IRES è richiesta per

l’ingresso di dell’unità ribosomale 40S attraverso le interazioni IRES/eIF4G/eIF3/40S (Pestova et

al., 1996a; 1996b).

Un meccanismo simile appare nello studio in piante per almeno due potyvirus rappresentativi simili

ai picornavirus: Tobacco each virus (TEV, Carrington et Freed, 1990) e Turnip mosaic virus

(TuMV, Basso et al., 1994). I 5’-UTR di TuMV e TEV fifferiscono da quelli dei picornavirus

animali, per la loro minore lunghezza e per la minore struttura del complesso secondario. Zeenko et

Gallie (2005) hanno dimostrato che pseudonoto elemento (PK1) leader del TEV è una struttura del

nucleo dell’IRES ed è sufficiente a promuovere la traduzione del cap indipendente. Tuttavia, sotto

queste condizioni la traduzione richiederebbe eIF4G (Gallie, 2001). Il legame del ribosoma 40S ad

IRES è apparentemente mediato da eIF4F e eIFiso4F, dal legame diretto di eIF4G e eIFiso4F, così

come i loro complessi (eIF4F e eIFiso4F), al leader della TEV143-nucleotidi 5’ e PK1, come

recentemente dimostrato, per cui eIF4G (o IF4F) posseggono una forte affinità al leader TEV che fa

la stessa cosa di eIFiso4G (Ray et al., 2006). L’IRES preferibilmente recluta eIFiso4F a formare il

complesso di preiniziazione 48S.

Allo stesso tempo, è sconcertante che 5’-end dellRNA genomico di TEV può reclutare eIFiso4E via

proteina Pg e che questa interazione è abbastanza forte da completare con il legame cap in

Arabidopsis (Miyoshi et al., 2006) nonostante il fatto che il legame cap a differenti siti di eIF4E

(Léonard et al., 2000). Interazioni corrispondenti fra eIF4G, eIF4E e VPg sono state recentemente

dimostrate per Lettuce mosaic virus (LMV; Michon et al., 2006) e per Turnip mosaic virus (TuMV

(Miyoshi et al., 2006).

Sebbene il ruolo del complesso eIF4G/eIF4E/VPg nella regolazione dell’inizio della traduzione non

è ancora chiaro, la sua partecipazione nell’inizio della traduzione mediata da IRES è stata proposta

per TuMV (Khan et al., 2006).

Infatti, nei nell’RNA a filamento positivo dei calicivirus dei mammiferi l’iniziazione è strettamente

dall’interazione fra VPg e eIF44E, dove VPg sembra sostituire il cap (Goodfellow et al., 2005).

Tuttavia, se VPg può sostituire il cap nelle piante deve ancora essere chiarito. Il fatto che PABP è

stato trovato essere richiesto per le piene funzioni in vitro (Gallie, 2001) suggerisce che L’RNA

genomico di TEV può essere messo in circolo attraverso eIF44G, eIF4iso G e PABP. La polimerasi

di RNA (RdRp) di Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV; Wang et al., 2000) e VPg-Pro di TuMV

(Lèonard et al., 2004) interagisce con PABP e può indurre la circolazione tra il terminale 5’- e 3’

per facilitare la replicazione. Anche se l’arresto della macchina della traduzione dell’ospite

attraverso i virus delle piante non è stata dimostrata, concentrazioni in aumento di RdRp potrebbero

interferire con il processo di traduzione.

VPg può reclutare eIF4E (o eIFiso4E) a beneficio del virus in diverse piante: il reclutamento di

eIFiso4E mediante VPg di TEV è richiesto per l’infezione di specie di solanacee (Robaglia et

19

Caranta, 2006). I rispettivi geni di resistenza di varietà di piante resistenti ai potyvirus naturalmente

necessari sono stati mostrati per codificare eIF(iso)4E o eIF4E (Lellis et al., 2002; Ruffel et al.,

2002). Coinvolgimenti di un complesso VPg/eIFiso4E nel movimento cellula-cellula o del trasporto

virale sono stati anche suggeriti (Dunoyer et al., 2004; Gao et al., 2004).

IRES putativi, non strutturati dei tobamovirus

Gli IRES (internal ribosoma entry site; sito di ingresso del ribosoma interno) identificati nei

tobamovirus delle piante non sono comuni in quanto sono brevi e non strutturati. Il genoma RNA

dei tobamovirus, quali il ceppo UI Tobacco mosaic virus (TMV), un tipico menbro, ha un capside

di RNA contenente quattro grandi ORF. La prima è un’ORF di lettura che codifica due componenti

di replicasi virale, i quali traducono direttamente da un RNA genomico. Il virus produce due

(sg)RNA (single guide RNA): il dicistronico I2 RNA è impiegato per la traduzione del movimento

delle proteine (MP); il monocistronico codifica per la CP (coat protein; Palukaitis et Zaitlin, 1986).

Un altro membro dei tobamovirus, un virus che infetta le crucifere (ctTMV; Dorokhov et al., 1994)

ha una simile organizzazione, ma le sue ORF, MPe CP, si sovrappongono.

I suoi ospiti sono due inusuali IRES, la IRESCP, a 148 nucleotidi, e la IRESMP a 75 nucleotidi , che

guidano la traduzione di CP (Ivanov et al., 1997) e la MP (Skulachev et al., 1999), che sono,

rispettivamente, ORF. Ambedue contengono un tratto ricco di una purina del codone di partenza

AUG. IRESCP può funzionare nelle piante, nel lievito e nelle cellule di HeLa (Dorokhov et al.,

2002). Tuttavia, la significanza funzionale di queste IRES è oscura fin quando MP e CP possono

essere anche tradotte dagli sgRNA mediante un meccanismo di scansione ribosomale (Ivanov et al.,

1997; Skulachev et al., 1999). Sebbene la regione IRESCP è altamente conservata fra le crucifere ed

i tobamovirus, essa differisce da altri tobamovirus (Ivanov et al., 1997). Altro vero elemento IRES

ricco in purina è stato identificato a monte della ORF di MP di U1 di TMV (Skulachev et al., 1999),

che possono essere usati preferenzialmente per TMV U1 I2 RNA dovuto alla possibile mancanza di

un 5’ cap in questo RNA. Il breve tratto di purina è stato suggerito come un modulo di IRES che

può mediare l’iniziazione interna nelle piante, mammiferi e lievito (Dorokhov et al., 2002).

Iniziazione indipendente della poly(A)

I genomi del filamento positivo di RNA dei Bromoviridae dei Tobamoviridae hanno un cap di 5’ e

di un terminale 3’ non poliadenilato. Questi virus usano una strategia simile a quella di un cap- e di

poli(A) contenente virus a RNA, ma i loro 3’-UTR possono funzionalmente sostituire una coda

poli(A) e lavorare come esaltatori in concerto con la struttura del cap per assicurare la traduzione

preferenziale del genoma virale. Questi UTR 3’ contengono una struttura tRNA simile (TLS), o

combinata con una serie di steli continui come in Alfalfa mosaic virus (AMV), o fusi ad una serie di

pseudo nodi come in Bromo mosaic virus (BMV), Turnip yellow mosaic virus (TYMV) e Tobacco

mosaic virus (TMV). Questi elementi hanno funzioni simili a quelli della coda del poli(A)

nell’iniziazione della traduzione mediante l’impiego di differenti partner di proteina (AMV, Krab et

al., 2006; BMV, Barends et al., 2004; TMV, Gallie, 1991; TYMV, Matsuda et Dreher, 2004).

I 3’-UTR di TMV e di TYMV aumentano sinergicamente la traduzione insieme con una struttura di

5’-cap (Gallie et Walbot, 1990; Zeyenko et al., 1994; Matsuda et Dreher, 2004), che suggeriscono

un ponte molecolare 5’-3’ tra i loro termini di RNA. Tutti gli RNA di TMV genomici e sub

genomici sono co-lineari e contengono alcuni 3’-UTR, composti da un dominio di tre pseudonodi

seguiti da un TLS, che può essere specificamente aminocilato e può interagire con eEF1A/GTP

(Mans et al., 1991). Usando un sistema protoplastico, Leathers et al. (1993) hanno rivelato il ruolo

critico della regione a monte della struttura di tRNA-simile del dominio del pseudonodo

nell’aumento ella traduzione dell’RNA di TMV, dove esso agisce sinergicamente con 5’-cap. La

proteina dello shock termico, HSP101, lega specificamente a questo dominio del pseudo nodo a

monte e potrebbe mediare l’aumento della traduzione (Tanguay et Gallie, 1996). Lo stesso

pseudonodo attraversa e si lega specificamente a eEF1A in una aminoacilazione che avviene in

maniera indipendente (Zeenko et al., 2002). Tuttavia, esperimenti aggiuntivi sono necessari per

confermare la possibile involuzione di eEF1A o HSP101 nella sinergia tra TMV 5’ e gli UTR.

20

Sebbene il 3’-UTR di TYMV, che comprende un TLS ed un singolo pseudonodo a monte, agisce

sinergicamente con 5’-cap ad accrescere la traduzione della crescita in modo similare a quello

trovato in TMV, la struttura di TLS è richiesta per l’aumento tradizionale (Matsuda et Dreher,

2004). Inoltre, solo la TLS dell’aminoacilazione competente, che è capace di legare strettamente

eEF1A-GTP, è attiva nell’attivazione della traduzione (Dreher et al., 1999), mentre il pseudonodo

sembra fornire lo spazio ottimale a presentare la TLS per l’aminoacilazione (Matsuda et Dreher,

2004). In aggiunta, eEF1A legandosi al TSL reprime la replicazione di dell’RNA di TYMV

mediante la polimerasi dell’RNA dell’RNA dipendente (Matsuda et al., 2004). Tuttavia, sebbene

l’RNA mimica dell’RNA di TYMV è chiaramente richiesto per la sinergia dell’accrescimento

tradizionale, la richiesta di eEF1A nelle costruzione del ponte tra il 3’- e il 5’-UTR rimane essere

direttamente dimostrato.

Le interazioni dirette 3’ e 5’UTR sono state proposte in AMV (Alfalfa mosaic virus, famiglia

Bromoviridae), dove essi sono mediati dalla coat protein (CP; Guogas, 2004; Krab et al., 2005). Il

3’-UTR dell’RNA dell’AMVadotta due strutture alternative, di cui solo una con molte AUGC ripete

separata mediante forme a forcina un forte interazione con almeno due molecole di CP (Neeleman

et al., 2004; Krab et al., 2005). CP accresce la traduzione dell’RNA di AMV in vivo di 50-100 volte

in presenza della struttura cap (Neeleman et al., 2004) ed interagisce con l’eIF4G ed eIFiso4G

coinvolti nella formazione di eIF4F ed eIFiso4F, rispettivamente (Krab et al., 2005). Il complesso

tra il 3’-UTR di AMV e la coat protein CP sembra mimare il complesso PAPB/poli(A) in quanto

entrambi possono reclutare eIF4F, così convertendo l’RNA virale nella una struttura chiusa a ciclo

continuo.

Alcuni 5’-UTR dell’RNA virale incapsulato possono aumentare la traduzione indipendentemente

dalla struttura del cap, usando altri fattori degli ospiti per reclutare eIF4F o eIFiso4F o un

meccanismo di iniziazione interno. Il 5’leader di TMV di 68 nucleotidi, ben conosciuto ed

ampiamente studiato nella sequenza Ω, agisce come un miglioratore della traduzione sia nelle

specie vegetali che animali ed è impiegato nelle applicazioni biotecnologiche. La regione

poli(CAA) di Ω ha mostrato di mediare un’elevata traduzione via reclutamento della proteina dello

shock termico HSP101 (Wells et al., 1998b). Il complesso tra Ω e HSP101 potrebbe imitare le

interazioni eIF4E/5’-cap o PAPB/poli(A) in cui esse efficacemente recluta eIF4F in ordine

all’incremento della traduzione (Gallie, 2002). L’analisi genetica ha dimostrato che l’aumento di Ω

di base richiede eIF3, che può essere richiesto via eIF4F (Wells et al., 1998b).

Le sequenze di alcuni leader virali delle piante che possono realizzare un aumento della traduzione

indipendentemente del 3’-UTR mostra almeno una complementarietà parziale alla regione centrale

dell’rRNA 18S. Questi leader legano al complesso preiniziale 43Sin un cap e in modo indipendente

da eIF (Akbergenov et al., 2004).

Iniziazione indipendente di poli(A) e cap

Molti gruppi di virus a filamento RNA positivo contengono degli RNA che non sono né cappati né

poliadenilati. Questi virus hanno evoluto strategie alternative per la traduzione che impiega

elementi 3’-UTR per reclutare eIF4F o eIFiso4F e/o paia di basi con i loro 5’-UTR per caricare il

complesso di preiniziazione 43S al sito di partenza 5’.

Satellite tobacco necrosi virus (STNV), un necrovirus a filamento positivo di RNA contiene con i

suoi 3’-UTR (proprio dopo il codone terminatore della coat protein della regione codificante) un

dominio miglioratore traduzionale (TED, translational enhancer domain) che promuove

un’efficiente traduzione del cap indipendente quando combinata con il 5’-UTR di STNV (per il

ceppo STNV-1 riferirsi a Timmer et al., 1993; per il ceppo STNV-2 riferirsi a Danthinne et al.,

1993; Meulewaeter et al., 1998). Sebbene TED può funzionalmente sostituire la struttura 5’-cap, la

sua funzione in vitro è dipendente dalla presenza di eIF4F e di eIFiso4F (Timmer et al., 1993).

Infatti TED specificamente lega eIF4E e eIFiso4E in vitro (van Lipzig et al., 2002; Gazo et al.,

2004), mentre il 5’-UTR dell’STNV-1 ha il potenziale alla coppia di basi con TED e il 3’-end

dell’rRNA 18S (Timmer er al., 1993). Tuttavia a promuovere l’iniziazione della traduzione della

cap indipendente, TED recluta il complesso di preiniziazione 43S attraverso i fattori canonici di

21

legame del cap al 3’-UTR, mentre l’accoppiamento base potenziale tra il 5’-UTR virale ed il 3’-

UTR sarebbe richiesto per trasferire il complesso 43S al 5’-UTR al codone di iniziazione

individuato.

L’esistenza del percorso dal 3’-UTR al 5’-UTR per reclutare il meccanismo di traduzione non è

probabilmente unico al TED di STNV, ma è probabile applicarlo da altri elementi di

amplificazione presenti con i 3’-UTR di altri virus non incapsulati e non poliadenilati. L’RNA di

Barley yellow dwarf virus (BYDV, un luteovirus) manca di una struttura 5’-cap e di una coda

poli(A), ma esso protegge un elemento tradizionale di BYDV (BTE) di una cap indipendente

funzionale in modo simile a TED, con il 3’-UTR (Wang et al., 1997; Guo et al., 2000). Un BYDV

simile a BTE è presente in tutti i Luteovirus (Miller et White, 2006) così come nei Dianthovirus -

Red clover necrotic mosaic virus (RCNMV), come indicato da Mizumoto et al., 2003 – e

Necrovirus – Tobacco necrosis virus (TNV), Meulewaeter et al., 2004; Shen et Miller, 2004 – e

contiene la sequenza conservata CGGAUCCUGGGAAACAGG, che funziona anche quando

posizionata nel 5’-UTR. Nella sua naturale locazione questa sequenza ha il potenziale coppia di basi

al 5’-UTR (Wang et al., 1997; Guo et al., 1997; 2001). BTE può reclutare la macchina della

traduzione al 3’-end e consegnarla al 5’-UTR mediante l’interazione 3’-5’ (Wang et al., 1997). La

consegna del macchinario della traduzione al 5’-end può verificarsi a causa della lunga distanza e

delle interazioni fra le forcine di RNA nel BTEe la %’-UTR (Guo et al., 2001). Tuttavia, TED e

BTE si comportano in un modo simile nello stimolare la trduzione di cap indipendente, senza

mostrare alcuna conservazione di sequenza o struttura secondaria. Se BTE o TED richiedono la

partecipazione dei fattori dell’iniziazione della traduzione canonica per le loro azioni residue ad

essere indagate.

Altro distinto elemento esaltatore identificato nei Tombusvirus, Tomato bushy stunt virus (TBSV), è

stato definito esaltatore del 3’-cap-independent translational enhancer (3’ CITE; Wu et White,

1999). Il 5’-UTR di TBSV piega in una struttura complessa di RNA, che è stata recentemente

dimostrata nell’interazione fisicz con 3’CITE in vitro (Fabian et White, 2004). La formazione di

interazioni di RNA 5’-3’ correla bene con una traduzione efficiente in vivo e potrebbe supportare il

trasferimento del macchinario traduzionale da 3’ a 5’-end dell’RNA come suggerito per BTE e

TED. Un simile elemento recentemente è stato identificato nel Maize necrotic streak virus

(MNeSV, Scheet et Redinbaugh, 2006).

Smistamento del ribosoma

La derivazione del ribosoma è uno speciale meccanismo dell’iniziazione della traduzione che

combina caratteristiche di scansione dipendente del 5’-end ed dell’iniziazione interna (Ryabova et

al., 2002; 2006). Esso è stato scoperto nei virus delle piante, prima per Cauliflower mosaic virus

(CaMV; Fütterer et al., 1990; 1993) e poi per Rice tungro bacilliform virus (RTBV; Fütterer et al.,

1996). Un simile fenomeno è stato anche descritto per molti virus animali incluso il Sendai

paramyxovirus (Latorre et al., 1998; de Breyne et al., 2003), adenovirus umano tipo C (Yueh et

Schneider, 1996; 2000; Xi et al., 2004), papilloma virus umano (Remm et al., 1999), per il

pararetrovirus dell’epatite B dell’anatra (Sen et al., 2004), per gli mRNA cellulari (Yueh et

Schneider, 2000; Rogers et al., 2004; Chappel et al., 2006).

In CaMV e RTBV, contatti ribosomali avvengono nel leader degli RNA virali, pregenomici (pg),

incapsulati e poliadelinati. I leader di CaMV e RTBV sono molto grandi, contengono molte sORF

così come una estesa struttura dello stelo a crescita continua. In CaMV, la struttura secondaria del

leader è stata determinata in vitro mediante costruzione di sonde chimiche ed enzimatiche

(Hemmings-Mieszczak et al., 1997). Ambedue le strutture secondarie e le strutture multiple delle

sORF rappresentano la maggior barriera ai ribosomi della scansione lineare (Pooggin et al., 2000;

Ryabova et al., 2000). Ciò nonostante, l’iniziazione della traduzione a valle del leader pgRNA di

CaMV è dipendente da cap (Schmidt-Puchta et al., 1997).

Il meccanismo molecolare della derivazione di CaMV è stato ampiamente studiato mediante

l’impiego di protoplasti derivanti da piante competenti ed sistemi di traduzione in vitro (Fütterer et

al., 1990; 1993; Dominguez et al., 1998; Hemmings-Mieszczak et al., 1998; Pooggin et al., 1998;

22

Hemmings-Mieszczak et al., 1999; Pooggin et al., 2000; Ryabova et Hohn, 2000; Ryabova et al.,

2000; Pooggin et al., 2001). In accordo con il modello di figura 7, l’iniziazione della traduzione

mediata su pgRNA di CaMV comprende i seguenti passaggi:

1. una subunità ribosomale 40S lega l’incapsulato 5’-end del pgRNAe scansiona lungo la sequenza

leader fino alla prima AUG, il codone di partenza del piccolo ORF A (sORF A) è incontrato; un

completo ribosoma 80S è assemblato ed inizia la traduzione di sORF A;

2. durante questo breve evento tradizionale, eIF3, eIF1 e eIf!A potrebbe rimanere associato al

ribosoma (ribosoma-associated) mentre le attività dell’elicasi del l’RNA sono rilaciate;

3. la subunità 80S è disassemblata dal codone di stop (sito di decollo della derivazione) a sei

nucleotidi a monte della base della struttura dello stelo a crescita continua

4. la subunità 40S rilasciata (il ribosoma di arresto della crescita) ha perso il fattore o i fattori di

iniziazione capaci di fondere la struttura secondaria stabile e la scansione è così bloccata;

5. la subunità 40S bypassa una regione strutturata a 480 nucleotidi;

6. il ribosoma di derivazione riprende lo scanning a valle della struttura di crescita dello stelo ad un

sito di sosta e raggiunge il codone di inizio AUG del primo grande ORF virale (ORF VII), dove

la traduzione è reiniziata. eIFs 1, 1A e 3, che sono potenzialmente ancora legati ai ribosomi,

aiutano l'iniziazione ed i ribosomi sono in grado di riattivare immediatamente la scansione a valle

anche in un sito di inizio non-AUG (Ryabova et Hohn, 2000).

Coerentemente con il modello di derivazione che coinvolge una fase di reiniziazione, la proteina di

CaMV transattivatore/viroplasmina (TAV), che serve come fattore di reiniziazione per promuovere

la traduzione di molte grandi ORF dell’RNA policistronico 35S (Bonneville et al., 1989; Park et al.,

2001), può anche aumentare l’efficienza di smistamento (Fütterer et al., 1993; Pooggin et al., 2000;

2001).

Il meccanismo di smistamento del ribosoma in RTBV assomiglia a quello di CaMV. Studi recenti

(Pooggin et al., 2006), mediante l’impiego di protoplasti di Oryza sativa (dicotiledone), di

Orychophragmus violaceus (monocotiledone) e di estratto di germi di frumento hanno mostrato che

la traduzione prossimale 5’ di sORF, che termina che termina con alcuni nucleotidi a monte della

base di una struttura ad anello dello stelo nel leader RTBV, è assolutamente richiesto per

un’efficiente derivazione, portando i ribosomi al sito collocato a valle della struttura. La

configurazione strutturale di un sORF seguita da un elemento della struttura secondaria occorre

nelle sequenze leader di pgRNA di molti pararetrovirus di piante (ma non tutti) sequenziali finora

(Pooggin et al., 1999; Geering et al., 2005 ) e si prevede che lo smistamento del meccanismo di

sORF è conservato in questa famiglia di virus. Lo scambio di elementi di derivazione,

individualmente ed in combinazione, fra CaMV e RTBV rivela che questi elementi sono

funzionalmente equivalenti nelle cellule delle piante dicotiledoni, nonostante le loro sequenze

primarie del nucleotide differiscano considerevolmente (Pooggin et al., 2006). Tuttavia, nel sistema

delle monocotiledoni (protoplasti di riso ed estratto di germi di frumento), il meccanismo di

smistamento mostra alcune preferenze per certe caratteristiche cis. Infatti, la sequenza del sito di

destinazione del leader di RTBV fallisce nella funzione nell’estratto di dei semi di grano, mentre

opera bene in due sistemi di protoplasti. Nei protoplasti del riso, gli elementi di derivazione di

CaMV, sia elementi completi o individuali in varie combinazioni con elementi di complemento di

RTBV, non supportano un’efficiente traduzione. In generale, la derivazione di RTBV dirige una

traslazione basale superiore rispetto alla derivazione di CaMV ed è meno sensibile al fattore di

reinizializzazione TAV di CaMV (Pooggin et al., 2006). Ciò correla con differenze nelle strategie

usate per effettuare le traduzioni policistroniche dal pgRNA virale, che fare affidamento sulla

scansione con perdite in RTBV e sulla reiniziazione mediata da TAV in CaMV. Vale la pena

ricordare che le differenze nell'efficienza della derivazione possono spiegare la specificità tissutale

di questi due virus; CaMV infetta molti tipi di cellule mentre RTBV è limitato all’area del floema

delle piante (Sta Cruz et al., 1993).

In CaMV, le mutazioni dei punti start e di stop dei codoni di sORF, ma non nelle sue sequenze di

codifica, aboliscono lo smistamento e riducono drasticamente la vitalità in piante di rapa,

23

principalmente all’apparire della prima e della seconda reversione del sito, ripristinando una sORF

(Poogging et al., 1998; 2001). Ciò suggerisce che lo smistamento della sORF è essenziale per la

vitalità virale.

Recentemente è stata provata l’importanza di altri cis-elementi richiesti per lo smistamento in

planta (Pooggin et Hohn, 2004). Due regioni distanti di CaMV indicano che formano

configurazione conservata, prossimale spaziale, derivata – la sORF e la parte più bassa delle

struttura dello stelo – possono essere sostituite con la regione corrispondente di RTBV senza alcun

effetto drammatico sulla traduzione policistronica mediata di derivazione di pgRNA e

dell’infettività virale. L’interazione CaMV-RTBV è stata largamente stabile per oltre sei passaggi in

piante di rapa: poche mutazioni puntiformi e piccole delezioni che si accumularono con la sORF e

sequenza adiacenti a RTBV sono state indicative della svolta finale della sequenza chimerica

durante l’adattamento ad un nuovo ospite. Presa nel complesso, l’evidenza suggerisce che il

meccanismo molecolare dello smistamento del ribosoma è evoluzionarmente conservato nei

pararetrovirus delle piante. È stato proposto che l’escesa e la discesa delle braccia della struttura

leader di CaMV, costruendo la configurazione derivata può essere evoluta mediante

un’incorporazione testa a testa del terminatore lungo di lunghe ripetizioni terminali di un

retrtrasposone antico trovato nel genoma del lievito (Shabadi et al., 2006).

Vale la pena ricordare che la pgRNA dei pararetrovirus è terminalmente ridondante per cui la parte

5’ della sua sequenza leader, che comprende la prima sORF e la metà del braccio ascendente della

struttura a cappio, è presente come una ripetizione diretta nel terminatore 3’ di UTR precedente la

coda poli(A).

Tuttavia, la 3’-UTR può rappresentare la base della coppia con la sequenza del braccio discendente

del leader, che, in aggiunta al ponte del capside di poli(A), potrebbe garantire la circolazione di

pgRNA. Se la circolazione di pgRNA è richiesta per la fase di iniziazione efficiente come descritto

prima per alcuni virus a RNA delle piante deve essere ancora accertato.

Una possibilità interessante è rappresentata dal fatto che gli elementi del 3’-UTR della base evitano

il donatore, la sORF e la sequenza del braccio ascendente potrebbe partecipare nel riciclo dei

ribosomi che hanno completato la traduzione al 5’-UTR dello stesso pgRNA o di una molecola

differente di pgRNA. Infatti, una derivazione di CaNV può essere ricostituita in trans, impiegando

due molecole separate di RNA, una contenente la regione di comunicazione del donatore e l’altra

con la regione di comunicazione dell’accettore, seguita da un elemento di ORF (Fütterer et al.,

1993).

Il ribosoma di comunicazione che dipende da una sORF prossimale a 5’ nel leader usa almeno uno

dei virus a RNA delle piante rappresentativi: Rice tungro spherical virus (RTSV) ed un retrovirus di

animali rappresentativo, il Prototype foamy virus (PFV). RTSV e RTBV coesistono in natura e

causano sinergicamente una grave malattia del riso. Si ipotizza che questi due virus potrebbero

essersi coevoluti in una strategia basata su informazioni genetiche di scambio. PFV appartiene a un

genere separato di Retrovirinae che si trova tra i retrovirus ed i pararetrovirus.

Altri casi di ribosoma per cui meccanismi di derivazione sono stati investigati con sufficiente

dettaglio sono stati valutati (Yueh et Schneider, 2000; de Breyne et al., 2003; Chappell et al., 2006),

differiscono dal caso di CaMV in cui essi non involvono la traduzione di un sORF . Tuttavia, un

tema comune è rappresentato dalla pausa dello smistamento dei ribosomi ad un sito di partenza.

Produzione di proteine multiple da un RNA singolo

I virus delle piante impiegano diverse strategie per esprimere proteine multiple dai loro genomi

compatti. Spesso, molte proteine virali sono tradotte da RNA monocistronico in un grande

precursore poliproteico che è trasformato in componenti individuali mediante un clivaggio

proteolitico. In molti virus a DNA ed RNA, gli RNA sono funzionalmente policistronici e due o più

proteine sono tradotte separatamente da una singola molecola di RNA. In seguito sono descritti i

migliori esempi di vari meccanismi di traduzione policistronica virale, compresa la perdita di

scansione, la reiniziazione e la ricodifica (figura 9).

24

Figura 9 – Strategie virali per l’espressione degli mRNA policistronici. Gli ORF sono mostrati

come scatole aperte, dove gli asterischi indicano codoni AUG. Le frecce orizzontali

mostrano il movimento dei ribosomi in translazione e le frecce curvate indicano la

deriva dei ribosomi. Esempi di virus che impiegano le strategie illustrate sono indicati

sulla destra.

Perdita di scansione

Il meccanismo più frequente impiegato dai virus per la traduzione policistronica è la perdita di

scansione, in cui una frazione di ribosomi di scansioni bypassa il primo codone di partenza ed inizia

la traduzione ai codoni di partenza a valle. La perdita di scansione avviene quando il primo codone

di partenza risiede in un contesto sub-ottimale, carente di purina in posizione -3 e di guanosina in

posizione +4, o quando è privo di un tipo di AUG (ad esempio una tripletta differente da AUG ad

una posizione (Kozak, 1991). La perdita di scansione può risultare nella produzione di due o più

proteine con una regione C-terminale se tradotta da una ORF, o in totalmente differenti proteine, se

i codoni di partenza sono locati in differenti fasi (figura 9).

L’M-RNA di Cowpea mosaic virus fornisce un esempio di perdita di scansione principale alla

traduzione di almeno due co-C-terminale poliproteine da una grande ORF (Welling et al., 1993). In

questo caso, due AUG a monte in un contesto subottimale (UGCAUGA in posizione 151 e

ACAAUGU in posizione 161) appare essere bypassato dalla scansione dei ribosomi, che poi inizia

al terzo codone di partenza in un contesto ottimale (GAAAUGC a 512). Gli eventi di iniziazione in

una ORF al secondo ed al terzo AUG fornisce due distinti polipeptidi iniziali per la replicazione ed

il movimento cellula a cellula, rispettivamente (Wellink et al., 1993). Bisogna notare che Cowpea

mosaic virus appartiene al gruppo dei virus a RNA picorna-simili che manca di una struttura

avvolgente ed usa spesso una meccanismo di iniziazione IRES dipendente. Accanto ad una perdita

25

di scansione, l’iniziazione di IRES mediata ha anche suggerito un contributo alla traduzione dal

terzo AUG di M-RNA di Cowpea mosaic virus (Verver et al., 1991).

Im TYMV, il moviemnto della proteina p69 e la replicazione della poliproteina p206 sono espresse

dalla sovrapposizione delle ORF su RNA genomico mediante un meccanismo di perdita di

scansione: a valle del codone dimpartenza p206 (GUAAUGG) è raggiunto dalla scansione dei

ribosomi dal 5’-terminale mediante AUG a monte p69, che è in un contesto sub ottimale,

CAAAUGA (Matsuda et al., 2006; Matsuda et Dreher, 2007).

Una struttura di tRNA simile (TLS) localizzata al terminale 3’-dell’RNA di TMYV è stata proposta

guidare un’alternativa , meccanismo “Trojan horse” per la traduzione di p206 AUG senza

iniziazione di cap dipendente a monte di AUG (Barents et al., 2003). Tuttavia, il modello “Troian

horse” è stato escluso recentemente in favore di una variazione della perdita di scansione canonica

(Matsuda et Dreher, 2006; 2007).

L’RNA2 di Peanut clump virus contiene due non sovrapposte ORF, espresse mediante la perdita di

scansione. (Herzog et al., 1995). Il codone di partenza della prima ORF è in un contesto sfavorevole

di iniziazione (CUUAUGU), permettendo, tuttavia, circa un terzo dei ribosomi della scansione, ad

iniziare un secondo ORF. Consistente con il modello della perdita di scansione, non c’è un’AUG

interna tra i codoni di partenza delle due ORF.

Un caso rimarchevole di perdita di scansione è stato descritto per il pararetrovirus RTBV (Fütterer

et al., 1997).In In RTBV, le ORF I, II e III sono espresse da pgRNA, che serve come un vero

mRNA policistronico (Fütterer et al., 1997), mentre ORF IV i tradotto da un elemento,

monocistronico derivato del pgRNA (Fütterer et al., 1994). Il primo lungo ORF virale (ORF I)

parte con un codone non AUG (AUU) ed è preceduto dalla lunga, strutturata, leader sequenza con

multipli sORF. Si dimostrato che circa il 10% dei ribosomi, consegnano al terminale 3’ del leader,

mediante un meccanismo di deviazione riconosciuto questo AUU ad iniziare la traduzione di ORF

I, mentre il 90% dei ribosomi derivati continuano la scansione verso gli ORFII e III (Fütterer et al.,

1996; 1997). Il contesto subottimale del codone AUG degli ORF II (UACAUGA) permette una

frazione significativa di ribosomi di analizzare il passato di questo AUG e di raggiungere

ulteriormente l’AUG a valle di ORF III, che ha uncodone start di moderata efficienza

(AGCAUGA). Bisogna notare che le ORF I e II sono grandi circa 1 kb e non contengono altri

codoni AUG (Fütterer et al.,1997). La mancanza di AUG interni è anche una caratteristica delle

ORF I e II nei relativi badnavirus, suggerendo che la perdita del meccanismo di scansione è

conservata nei due distinti generi dei pararetrovirus bacilliformi (Pooggin et al., 1999).

Meccanismi di reiniziazione

Negli eucarioti, i ribosomi hanno terminato la traduzione di un breve ORF 8sORF) possono dare

aumentare a 40S subunità capaci di riprendere la scansione e reiniziare AUG a valle. Dipendendo

dalla lunghezza della ORF a monte (uORF), le strategie che permettono la reiniziazione possono

essere divisi in due tipi: re iniziazione convenzionale dopo una breve ORF e meccanismi alternativi

che permettono la reiniziazione dopo la traduzione du lunche ORF.

Reiniziazione dopo corte ORF

Le ORF corte, meno di 39 codoni localizzate a monte di lunghe ORF, normalmente, hanno funzioni

regolatorie nel controllo del rapporto di traduzione ad un successivo ORF a valle (Morris et

Geballe, 2000; Meijer et Thomas, 2002). Le sORS sono spesso usate per la produzione proteine

critiche. L’efficienza della reiniziazione dopo l’evento di una breve traduzione è indotta da

caratteristiche strutturali dell’mRNA, così come l’imRNA, come la dimensione dell’uORF e

mediante disponibilità di uORF e dei fattori di iniziazione canonici (Hinnebusch, 1997; Kozak,

2001). Poiché i fattori necessari per la reiniziazione dissociata dal ribosoma che traduce grandi

ORF, il tempo richiesto per il ribosoma ad essere ricaricato con fattori critici di iniziazione inclusi,

al minimo, il complesso ternario (Met-tRNAi- eIF2-GTP) è piuttosto esteso (Kozak, 1978b;

Hinnebusch, 2005) . Questo è stato stabilito per il sistema GCN4 nel lievito, nel quale

l’allungamento della regione intercistronica favorisce l’efficienza della reiniziazione (Hinnebush,

26

1997). Alcuni fattori di iniziazione coinvolti nella promozione dell’iniziazione primaria al codone

di partenza che non sono rimosse durante l’evento di breve traduzione potrebbero favorire il nuovo

evento di re iniziazione. Sulla base dei risultati ottenuti usando un insieme di diverse IRES con

proteine note richieste per la loro funzione, Pöyry et al. (2004) hanno suggerito che nei sistemi in

vitro dei mammiferi, eIF4F e/o eIF4A possono partecipare alla re iniziazione seguendo l’evento di

breve allungamento. Probabilmente, l’interazione tra eIF4F/eIF4A, eIF3 e la subunità 40S sono

debolmente mantenute per un breve periodo durante lo step di allungamento. Se la sORF

abbastanza corta, queste interazioni non sono distrutte ed il ribosoma, ancora equipaggiato con tutti

i necessari eIF, riprenderà la scansione e riacquista un nuovo complesso ternario. Molti virus di

piante contengono uno o più sORF con le loro regioni leader e possono tuttavia usare la

reiniziazione della sORF mediata per regolare la traduzione a valle. Come per i virus CaMV e

RTBV, l’evento di traduzione breve alla sORF 5’-prossimale, che promuove la traduzione

efficiente delle ORF a valle, attraverso la manovra ribosomale, possono essere pensati come un caso

speciale di re iniziazione.

Reiniziazione dopo una lunga ORF

Negli eucarioti,la reiniziazione dopo traduzione di una lunga ORF è un evento molto raro. Nei

mammiferi ci sono solo pochi esempi documentati di tale re iniziazione (Horvath et al., 1990;

Luttermann et Meyers, 2007). Ciò potrebbe suggerire che gli eIF che potrebbero essere strumentali

nella promozione di un evento di reiniziazione non sono disponibili dopo il loro distacco durante

l’evento di lunga traduzione.

Recentemente, un simile meccanismo chiamato terminazione-reiniziazione è stato proposto per un

calicivirus (Feline calicivirus, FCV) dove in vicinanza di un codone di stop del primo ORF al

codone di inizio di un secondo ORF può essere in efficiente traduzione del secondo ORF. In questo

caso, ambedue, il codone di stop con una certa distanza dal codone autentico AUG ed un elemento

ad azione cis che precede il codone di stop (proposto per interagire con l’rRNA 18S) sono richiesti

per localizzare il ribosoma 40S terminatore alla re iniziazione del sito di partenza; tuttavia,

quest’ultimo AUG non è richiesto per essere nel contesto ottimale ed anche i codoni non-AUG

possono supportare un livello significativo della traduzione di ORF 2 (Alish et al., 2006;

Luttermann et Meyers, 2007).

Reiniziazione della TAV mediata nei pararetrovirus delle piante

In accordo con il percorso generale dell’iniziazione della traduzione (figura 7), una eIF, che è stata

acquisita ex novo medaiante la reiniziazione dell’unità ribosomale, è la eIF2 nella forma di TC

(Hinnebusch, 1997), da Met-tRNA caricata attraverso eIF2 al ribosoma di scansione 40S che sarà

stato impiegato per realizzare anche l’iniziazione primaria. Un secondo componente richiesto sarà

l’unità ribosomale 60S, se questa è stata perduta durante il primo evento di terminazione. Tuttavia,

un potenziale fattore di reiniziazione è il mantenimento del limite degli eIF per la traduzione dei

ribosomi e/o riacquistarli di nuovo durante o dopo la fine della traduzione della prima ORF.

CaMV d i relativi pararetrovirus hanno sviluppato una strategia di reiniziazione unica, nella quale

un fattore virale promuove la stessa reiniziazione dopo la traduzione di uno o più lunghe ORF

virali. Questo meccanismo di reiniziazione della traduzione fu documentata per la prima volta con

riferimento a CaMV (Bonneville et al., 1989; Fütterer et Hohn, 1991) e il Figwort mosaic virus

(FMM, Gowda et al., 1989) e sono stati confermati anche per Peanut chlorotic streak virus (PCSV,

Maiti et al., 1998). Il DNA genomico di CaMV contiene due promotori, con produzione diretta di

RNA pregenomico 35S policistronico e RNA subgenomico 19S. L’RNA 35S codifica tutte e sei le

proteine virali polifunzionali da ORF VI, con le ORF per lo più ravvicinate o con una breve

sovrapposizione. L’RNA subgenomico 19S contiene una singola ORF, ORF VI, che codifica una

proteina con caratteristiche di trans attivatore, TAV, essenziale per la traduzione dell’RNA 35S.

TAV è la più abbondante proteina vitale nel citoplasma delle cellule infette e forma corpi di

inclusione (viroplasmi) dove tutti i prodotti dei geni virali sono individuati (Givord et al., 1984;

Martinez-Izquierdo et al., 1987). Le funzioni di TAV nella transattivazione della traduzione

27

policistronica nei protoplasti delle piante (Fütterer et al., 1990; Fütterer et Hohn, 1991; 1992; Kiss-

Làszló et al., 1995) e nelle piante (Ziljstra et Hohn, 1992). La trans attivazione di TAV mediata non

è significativamente dipendente da sequenze virali, con messaggi bicistronici artificiali anche

usando buoni substrati per l’azione di TAV (Fütterer et Hohn, 1991; 1992). La reiniziazione di

TAV attivata non è molto influenzata dalla distanza tra le due ORF consecutive: la re iniziazione

può avvenire immediatamente dopo il termine della traduzione, quando le due ORF sono attaccate

mediante una quadrupletta di AUGA ed ancora altrettanto efficiente, se la seconda ORF è

localizzata lontana almenno 700 nt ulteriormente a valle (Fütterer et Hohn, 1991). Tuttavia,

diversamente, la strategia di reiniziazione usata dopo la traduzione di sORF nel sistema del lievito

GCN4 (Hinnebusch, 1997) o nei meccanismi di terminazione.reiniziazione (Alisch et al., 2007;

Luttermann et Meyers, 2007), reiniziazione della TAV attivata non è distante o blocca il codone di

stop del dipendente contesto del codone.

Per ralizzare la sua funzione di transattivazione, TAV è proposta interagire con eIF3 e la subunità

ribosomale 60S attraverso i contatti multipli mediati mediante almeno tre proteine ribosomali: L13,

L18 ed L24 (Leh et al., 2001; Park et al., 2001). Le interazioni TAV con eIF3 (attraverso la sua

subunità g) e L24 dimostrano la criticità per la sua attività (Park et al., 2001). Due domini di TAV

sono richiesti per la transattivazione della traduzione policistronica: il dominio della miniTAV

(MAV; de Tapia et al., 1993). Il peptide di MAV, espresso in elevato essesso in protoplasti di

Nicotiana plumbaginifolia, possono provvedere per il 20-25% dei tipi selvatici TAV mediati

dall’attività di trans attivazione. La presenza del dominio MBD è assolutamente richiesta per la

transattivazione nei protoplasti di Orychophragmus violaceus ed aumenta il livello di

trasattivazione del 70-75% nei protoplasti di Nicotiana plumbaginifolia (de Tapia et al., 1993). Si è

dimostrato che lo stesso sito di legame di MAV può reclutare L13 o L18 (Leh et al., 2001; Bureau

et al., 2004) o doppi filamenti di RNA (Park et al., 2001). Quale potrebbe essere il significato

funzionale delle interazioni di TAV con questi componenti del macchinario di traduzione? D’altro

canto, il legame di TAV a L24 localizzato nel centro attivo 60S mediante l’allungamento di

inibizione, liberando la pgRNA per la trascrizione inversa e/o impaccando come una parte del ciclo

di replicazione del CaMV (Park et al., 2001).

L24 è stato implicato negli eventi di reiniziazione dell’RNA di piante contenente a monte le ORF

(Nishimura et al., 2004). In Arabidopsis thaliana, un mutante deficiente in L24, stv, mostra un

fenotipo di sviluppo del gineceo simile a quello osservato nei mutanti ett e mp, dove la traduzione

di ETT e MP è negativamente regolata da ORF a monte ed apparentemente richiede i meccanismi di

reiniziazione. Il primo uORF di ETT è lungo 279 nucleotidi e Nishimura et al. (2004) hanno

postulato che L24 potrebbe giocare un ruolo nella regolazione della traduzione mediante delle

lunghe ORF. Potrebbe essere interessante determinare se il mutante stv può supportare l’infezione

di CaMV.

Ruolo dell’interazione eIF3-TAV nella reiniziazione

Esperimenti in vitro suggeriscono che il complesso TAV/eIF3 lega ambedue le subunità 40S e

60Smediante eIF3 e TAV come un ponte, rispettivamente (Park et al., 2001), ed il complesso dei

co-sedimenti con la frazione ribosomale 80S in gradiente di saccarosio (Park et al., 2004). eIF3

co-sedimenta con la frazione ribosomale 40S nelle piante sane, ma l’infezione di CaMV delle piante

di rapa conduce all’accumulo di TAV ed eIF3nelle frazioni poliribosomali dei gradienti di

saccarosio (Park et al., 2001). Sulla base di questi dati un’apparente funzione di TAV potrebbe

essere quella di prevenire la dissociazione di eIF3 dal ribosoma in traduzione 80Sdurante l’evento

precedente di allungamento per permettere la ripresa della scansione e/o la reiniziazione a valle di

AUG (Ryabova et al., 2004; 2006). eIF3 è il più grande e più complesso fattore di iniziazione

(Browning et al., 2001; Hinnebusch, 2006) che gioca un ruolo cruciale durante l’uniziazione della

traduzione della cap-dipendente dove stimola il legame di TC alla subunità ribosomale 40S in modo

migliore mediante eIF1 e eIF1A ed interagisce con mRNA per assistere al caricamento della

subunità ribosomale 40S sull’mRNA (Majumdar et al., 2003; figura 7 step 1 e step 2). eIF3 è

richiesto per un rapido nuovo carico di TC con la scansione del ribosoma 40S per reiniziare, in vivo,

28

un GCN4 ORF (Garcia-Barrio et al., 1995). Tuttavia, il complesso TAV/eIF3/40S può reclutare TC

via eIF3, per riprendere la scansione ed ricominciare all’ORF successivo più a valle. eIF3 può

giocare un ruolo nel meccanismo di terminazione-reiniziazione operando in FCV sopra descritto

attraverso il legame all’elemento cis, precedente il codone di stop, a monte dell’ORF (Jackson,

2005).

Ruolo di altri fattori nella reiniziazione della TAV mediata

L’interazione della TAV con eIF3 può essere preclusa dall’eIF4B che compete su TAV per legare il

centrale ricco dominio G di Arabidopsis che interagisce con il dominio di legame di TAV di eIF3g

(Park et al., 2004). Dati recenti suggeriscono che eIF3g delle piante è una proteina scaffold.

Si ricorda che le scaffolding proteins sono polipeptidi, la cui funzione principale è quella di unire

diverse proteine per permettere loro di interagire, partecipando al processo di trasduzione del

segnale. Normalmente queste proteine specializzate posseggono diversi domini specifici per il

legame con altre proteine e funzionano appunto come una sorta di “impalcatura”. In linea di

principio, un modulo di trasduzione del segnale è definito dalla interazione funzionale dei suoi

componenti e non richiede una loro associazione fisica; tuttavia, spesso i componenti di un modulo

sono organizzati in un complesso multiproteico tenuto insieme proprio dalle scaffolding proteins.

Queste proteine impalcatura, oltre a definire la specificità di un modulo di trasduzione, ne regolano

le proprietà cinetiche in quanto concentrano in uno stesso complesso gli enzimi e i loro substrati. La

formazione di questi complessi orchestrati da proteine impalcatura è un evento dinamico e spesso la

macchina di trasduzione del segnale viene assemblata, in risposta all’attivazione dei recettori, a

partire da componenti inizialmente presenti in compartimenti intracellulari distinti. L’attivazione

del protoncogene c-RAF, per es., richiede la sua traslocazione dal citoplasma alla membrana

citoplasmatica. La modularità della trasduzione del segnale e il fatto che gli stessi moduli possono

essere utilizzati nel trasdurre segnali diversi e permettono la regolazione reciproca tra segnali

differenti per cui, per es., fattori di crescita e molecole di adesione interagiscono a livello

funzionale.

Ritornando al discorso delle scaffold proteins la eIF3g può formare nelle piante un complesso con

eIF4A, PABP, eIF3 e mRNA (Cheng et Gallie, 2006), così che TAV apparentemente non può

entrare nel macchinario tradizionale dell’ospite via interazione con eIF3, fin quando la subunità 60S

inducono lo spostamento di eIF4B ed altri eIF. La sovraespressione di eIF4B nei protoplasti delle

piante negativamente influenza la trans attivazione della TAV mediata (Park et al., 2004),

probabilmente sequestrando eIF3 dal macchinario di traduzione. Il fatto che TAV non interferisce

con il primo evento di iniziazione è a favore del concetto che la formazione di un complesso stabile

tra eIF3/40S avviene dopo la formazione del complesso di preiniziazione e la rimozione di eIF4B

(Park et al., 2004).

Due fattori di iniziazione, eIF4G e eIF4A, sono stati proposti essere trattenuti alla subunità

ribosomale 40S per realizzare la re iniziazione al secondo ORF dopo un evento di breve

allungamento (Pöyry et al., 2004). Turravia, nel caso di FCV, la re iniziazione non è stata inibita dal

mutante del dominante negativo eIF4A, suggerendo che eIF4G e eIF4A non sono richiesti per

l’evento di re iniziazione-terminazione (Jackson, 2005). Le proteine ribosomali L13 e L18 sono

apparentemente localizzate da qualche parte vicino alla superficie della subunità ribosomale

(Marion et Marion, 1987; Ban et al., 2000), così che è stato proposto che L13 e L18 potrebbero

legare i dimeri TAV (Bureau et al., 2004). Tuttavia, il loro ruolo funzionale deve essere ancora

chiarito.

Reiniziazione di un modello di TAV mediata

Il modello della reiniziazione di TAV mediata è riportato in figura 10 (originale proposto da Park et

al., 2004). Dopo l’interruzione dell’interazione eIF3-eIF4B, TAV è sequestrata dal complesso

eIF3/40S, rafforzando così questo altrimenti instabile complesso, che resta attaccato al macchinario

di traduzione durante il processo di allungamento. L’affinità di TAV per l’unità ribosomale 60S

29

dovuta alla sua interazione con L18 o L13 potrebbe condurre alla riallocazione di eIF3 alla

superficie del solvente di 60S, dove non interferirebbe con il processo di allungamento.

Figura 10 – Modello del ruolo di TAV nel contenimento di eIF3 sul ribosoma di traduzione durante

la fase di allungamento di traduzione di un lungo ORF. Negli step 1-3, il modello è

visto frontalmente, con movimento del complesso di iniziazione da sinistra a destra e

negli step 3’ e 4’ dal di dietro (movimento da destra a sinistra). Step 1. Assemblaggio

convenzionale del complesso di pre-iniziazione 48Sal primo successivo codone di

partenza. Step 2. Durante l’accoppiamento della subunità 60S, eIF4B è sostituito da

TAV sulla subunità g di eIF3. eIF3 è ancora associata con il lato del solvente della sub

unità 40S. Step 3. Durante l’allungamento il legame ORF1 TAV può stabilizzare il

complesso eIF3/40S sulla superficie del solvente della subunità ribosomale 40S. Step

3’. In uno scenario alternativo il complesso TAV/eIF3/80S è stabilizzato mediante

trasferimento TAV/eIF3 alla subunità 60S attraverso l’interazione di TAV con L18. In

questo modello un quarto step (Step 4’) potrebbe essere richiesto, in cui il complesso

TAV/eIF3 è trasferito di nuovo alla subunità 40S durante la terminazione dell’ ORF 1.

Il complesso TAV/eIF3/40S scansiona per ORF 2 e riacquista il complesso ternario

lungo il percorso. eIF3 e le sue subunità g (3g), i (3i), b (3b), a, c (3°+3c); eIF1 (1),

eIF2 (2), eIF5 (5), tRNA e TAV sono indicati. Il lato del solvente delle subunità

ribosomali 40S e 60S è colorato in grigio, con il lato interno dell’interfaccia in bianco.

Gli asterischi rappresentano i domini riconosciuti dell’RNA (RRM) con eIF4B e

eIF3g.

L’interazione 60S-TAV-eIF3 potrebbe anche indurre incapacità a lavorare con i ribosomi

dell’allungamento. Durante la fase della terminazione della traduzione, il complesso TAV-eIF3

potrebbe essere trasferito indietro alla unità 40S. Il complesso TAV/eIF3/40S potrebbe tuttavia

30

riacquistare il complesso ternario ed essere pronto a guidare la scansione del ribosoma o

l’immediata reiniziazione alla successiva tripletta AUG.

Ricodificazione

Normalmente, la traduzione termina a qualunque dei tre codoni nonsenso (codoni di stop) UAG,

UAA o UGA. Tuttavia, la lettura genetica può essere estesa per l’alterazione del ruolo standard in

un modo che è specifico per gli mRNA individuali. Alcune estensioni del codice genetico definite

eventi di registrazione (Baranov et al., 2002). Quest’ultima registrazione è spesso in competizione

con la registrazione standard. (figura 9). In generale, i virus possono impiegare gli eventi di

registrazione per regolare l’espressione genica durante il ciclo virale ed espandere l’informazione

genetica ottenuta nel loro relativamente piccolo genoma. Due classi distinte di registrazione sono

impiegate dai virus delle piante: spostamento del telaio e soppressione del codone di stop. Nel caso

dello spostamento del telaio, la cornice di lettura è spostata nella direzione 5’ o 3’. Nella

soppressione del codone di stop (o “lettura attraverso”), questo è letto come un codone senso

mediante i tRNA cellulari normali conosciuti come soppressione naturale dei tRNA.

In questi casi, il ribosoma non è rilasciato attraverso il complesso dei fattori di rilascio eucaristico

ed un polipeptide allungato è sintetizzato.

Lettura attraverso il codone di stop

In alcuni RNA, il codone di stop del gene 5’può essere “perdente”, che permette una proporzione di

ribosomi per continuare la fase di traduzione fino al successivo codone di stop. Come il “read-

through” che codifica i due componenti della replicasi virale o lo “stop-codon suppression”, che è

letto come un codone non senso, risulta in un C-terminale esteso versione della proteina. Il

complesso del fattore di rilascio degli eucarioti, eRF2/eRF£/GTP, decodifica normalmente i segnali

di stop efficientemente. Però, in dipendenza del contesto del codone di stop e la presenza del tRNA

soppressore, la competizione tra il complesso dei fattori di rilascio eucaristico e un soppressore

tRNA per lo stop del cambio di segnale in favore del tRNA, risulta in rapporto di “read-through” di

circa 1-10%.

Questo fenomeno fu riportato per la prima volta per TMV (Pelham, 1978) e successivamente per

almeno 17 generi di virus delle piante, incluso i Luteovidae ed i Tombusviridae. Un grande numero

di virus delle piante ssRNA di senso positivo impiegano la strategia della “read-through” per

produrre componenti di dipendente di RNA polimerasi di RNA (RdRp, come tobamovirus e

tombusvirus) o proteine di rivestimento allungate (coat protein dei luteovirus). Si è pensato che

questi ultimi prodotti sono coinvolti nella trasmissione dei vettori di interazione (Gray et Banerjee,

1999). Ad oggi, la soppressione dei codoni di senso non è stata riportata per i virus a DNA delle

piante.

Significato biologico dei prodotti read-through

Il migliore esempio della caratterizzazione della soppressione di un codone di terminazione si può

osservare nell’RNA di TMV. Questo RNA può essere tradotto in vitro per produrre una proteina

"normale" da 126 kDa ed una proteina read-through di 183 kDa (Pelham, 1978). Ambedue le

proteine sono state detenute nelle cellule infette da TMV (Paterson et Knight, 1975). Il meccanismo

di read-through risulta nell’espressione di una grande quantità di P126, che include i domini

dell’elicasi e della metil transferasi e molte piccole quantità di RdRp (P183), che posseggono al loro

terminale end il motivo altamente conservato GDD responsabile dell’attività di replicazione (Maia

et al., 1996). Ambedue i polipeptidi sono essenziali per la moltiplicazione di TMV (Ishikawa et al.,

1986).

I tobravirus esprimono anche il dominio catalitico di RdRp attraverso il read-through nelle piante.

Questi virus hanno un genoma bipartito che è impaccato separatamente in particelle

bastonciniformi. RNA-1 codifica due ORF (open reading frame) separate da un codone di stop

UGA (Hamilton et al., 1987), che fornisce due proteine di circa 130 e 190 kDa. Per TRV, una

proteina read-through di 194 kDa è stata rilevata in vitro (Fritsch et al., 1977; Hughes et al., 1986)

31

ed in vivo (Mayo, 1982). Ambedue le proteine sono forse coinvolte nella replicazione dell’RNA

(Hamilton et al., 1987).

Nei luteovirus, Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) ed i virus trasmettitori di funghi del

genere Pomovirus e Furovirus, espressione della proteina del capside è anche regolato mediante

read-through. Nei luteovirus, il capside è composto da due proteine strutturali: la maggiore una CP

(coat protein) di 21 kDa ed un componente minore, la proteina read-through di 75 kDa contenente

il dominio read-through (RTD). La CP da sola è sufficiente per formare virioni infettivi ma la RTD

è richiesta per la trasmissione di afidi (Brault et al., 1995). Il terminale N (conservato), la metà di

RTD, può essere il sito del vettore primario specificamente determinante per tutti i luteovirus

(Brault et al., 2005). L’RTD è anche importante per l’accumulazione efficiente del virus in tutte le

piante (Brault et al., 1995; Chay et al., 1996; Bruyère et al., 1997; Mutterer et al., 1999).

RNA-3 di Potato mop-top virus (PMTV), membro tipo del genere Pomovirus, possiede una singola

ORF codificante la CP di 20kDa e la proteina di 67 kDa prodotta dal codone terminatore read-

through della CP ambra (Kashiwazaki et al., 1995). La proteina read-through di PMTV è coinvolta

nella trasmissione mediante il vettore Spongospora sub terranea (Reavy et al., 1998) ed è stata

localizzata vicino ad una estremità della particella del virus (Cowan et al., 1997). Per BNYVV, la

proteina read-through interviene nell’assemblaggio virale (Schmidtt et al., 1992) e gioca un ruolo

nelle interazioni virus-vettore Tamada et Kusume, 1991). La proteina read-through è tradotta da

RNA 2 come proteina di fusione (75 kDa), che la proteina del capside virale (21 kDa)ha al suo N

terminale. Schmitt et al. (1992) hanno dimostrato che una breve delezione nel dominio di read-

through di P75 interferisce con l’accumulo dei virioni di BNYVV durante l’infezione senza inibire

la capacità di replicazione del virus e formare lesioni locali sulle foglie. La mutazione di un motivo

di peptide (KTER) con metà del C-terminale del dominio di read-through non inibisce

l’assemblaggio ma blocca la trasmissione protista del virus (Tamada et al., 1996).

Interruzione del contesto degli effetti del codone

I codoni di stop sono tutti soggetti al read-through ed tutti hanno differenti efficienze della fase di

terminazione (UAA>UAG>UGA), ma UAA è di gran lunga il più usato. Un grande determinante

deve saper influenzare l’efficienza della terminazione della traduzione ed è il contesto circostante

della sequenza locale del codone di terminazione (Skuzeski et al., 1991). Tuttavia, Brown et al.

(1996) hanno osservato in BYDB che un segnale di registrazione per read-through può anche essere

localizzato a qualche distanza dal codone di stop. Il contesto del codone, che la maggiore influenza

sul read-through, estende all’esanucleotide al 3’ lato del codone di mis-lettura. La regione di read-

through al 3’ lato può essere classificata nei tre gruppi in accordo alla sequenza omologa (Beier et

Grimm, 2001). La regione read-through di tipo 1 è trovata negli RNA virale delle piante come i

tobamovirus. Questi virus condividono i 6 nucleotidi CAA UYA (Y=piramidine) al lato 3’ del

codone di UAG o di UAA. Ogni cambio in questi nucleotidi può abolire o ridurre di molto la

soppressione in vitro di UAG (Zerfass e Baier, 1992). Il tipo della II regione presente nei

tobamovirus o nei furovirus è caratterizzato dalla sequenza CGG o CUA al lato 3’ del codone UGA

(raramente UAA) soppresso. La regione del III tipo presente nei luteovirus è più complessa: una

sequenza di purina distanziata conservata consistente di 8 nucleotidi immediatamente a valle del

soppressore UAG somiglia alla sequenza octanucleotide nei retrovirus degli animali (Beier et

Grimm, 2001). Tuttavia, per i luteovirus, questa sequenza non è sufficiente per il read-through in

vivo: una ripetizione ricca in citidina (CCNNNN)8-16 inizia 20 nucleotidi a valle del codone di stop

ed una sequenza essenziale localizzata oltre 700 nucleotidi a valle è richiesta per la read-through

(Brown et al., 1996).

Uno schema alternativo di classificazione per i contesti del codone di stop read-through è stato

proposto dal gruppo Atkin (Harrel et al., 2002). Da un database dei contesti dei virus read-through,

essi usano le sei più frequenti triplette trovate in posizione +1 del codone simil-rosso per formare 6

diversi gruppi. Il gruppo 1 è simile al tipo 1 e corrisponde ai virus delle piante simili a TMV che

contengono la sequenza di consenso CAA-UUA. Il gruppo 5 include il segnale del luteovirus

(CCN-NNN ripetuta) del III tipo. Il gruppo 2 (CGG) ed il gruppo 6 (CUA) appartengono anche al

32

III tipo. Atkins e colleghi hanno provato l’importanza di diversi nucleotidi con questi contesti

usando una fusione di una doppia luciferasi. A, C o G, in posizione +1 mostrano essere critici per

read-through in molti sistemi. La sostituzione della posizione +”, +3 e +4 non mostra effetti

significativi. Solo in UGA di TRV la sostituzione di +5U con G aumenta significativamente il

read-through. Tuttavia, l’alterazione della posizione di +6 ha causato il cambio più grave (Harrel et

al., 2002).

Soppressore dei tRNA

La sintesi di una proteina read-through dipende primariamente dalla presenza di adatti tRNA

soppressor. La traduzione in vitro dell’RNA di TMVè stata impiegata come un sistema conveniente

per saggiare la soppressione “naturale” di UAG da parte dei tRNA. Per identificare un soppressore

di UAG, Tobacco rattle virus (TRV) è stato usato. Per promuovere la read-through oltre il codone

perdenteUAG dell’RNA di TMV, il naturale soppressore tRNATirosina è stato isolatoda foglie di

tabacco (Beier et al., 1984a). Questo RNA è stato il primo soppressore naturale di UAG

caratterizzato nelle piante.

Solo il tRNATirosina con un anticodone GΨA permette un efficace read-through. Questo tRNATirosina

(GΨA) è abbastanza efficiente dall'aggiunta di puro tRNATirosina al lisato di reticulocita aumenta la

resa di AUG del TMV read-through entro il 35% (Beier et al., 1984a). Questo RNA è raro nelle

giovani foglie di frumento ma è abbondante nei più vecchi tessuti, suggerendo che read-through è

sviluppatamente regolato (Fütterer et Hohn, 1996). Il tRNATirosina con un anticodone QΨA, che è

abbondante nei germi di frumento, è capace di stimolare il read-through di UAG (Beier et al.,

1984b).

Grimm et al. (1998) hanno identificato due tRNAGln isoaccettori delle foglie di tabacco, come un

secondo caso di soppressori naturali di AUG. Questo tRNAGln può promuovere il read-through al

di sopradel codone di terminazione UAG nel contesto di TMV nell’estratto dei germi di frumento

impoverito di tRNA endogeno. Due tRNALeu sono stati isolati dal fegato di vitello ed ambedue sono

funzionali in vitro come soppressori dei codoni UAG dell’RNA di TMV eRNA-2 di Beet necrotic

yellow vein virus, BNYVV (Valle et al., 1987). La perdita del codone di stop UAG del TRV è

soppresso da vari tRNA soppressori. Un tRNATrp con un anticodone CmCA origina dal cloroplasto

ed è stato trovato essere più efficiente di quello da citoplasma (Zerfass et Beie, 1992).TRV appare

essere associato con I mitocondri in cellule infette e i tRNA trovati in cloroplasti possono anche

essere trovati nei mitocondri. Tuttavia, il virus può usare tRNA mitocondriale come un soppressore

in vivo. Baum et Beier (1998) hanno trovato che tRNAArginina U*CG è un efficiente soppressore in

vitro nel contesto TRV. Inoltre, tRNAArginina U*CG è capace di leggere l’UGA alla fine della

cistrone del proteina del capside CP in RNA-1 di Pea natio mosaic virus.

La fase di lettura

Per i virus a RNA a filamento positivo la fase di lettura ribosomale è il meccanismo di ricodifica

prevalente che ha il vantaggio di fornire un mezzo economico della memorizzazione

dell’espressione dell’informazione genetica virale.

L’efficienza degli eventi della fase di lettura è fondamentale perché determina la stechiometria

strutturale virale ed enzimatica proteica che è disponibile per l’assemblaggio e la replicazione delle

particelle virali e perciò dei controlli della propagazione virale (Dinman et al., 1998; Harger et al.,

2002).

In molti virus delle piante noti per subire la fase di lettura, il dominio catalitico della RdRp, che è

espresso via fase di lettura e che permette la sintesi a bassi livelli della polimerasi, è quello che deve

essere controllato. La strategia della fase di lettura è trovata in alcuni generi di Tombusviridae,

Closteroviridae, Luteoviridae e Sobemovirus e Umbravirus. Tutti gli usi della fase di lettura -1

eccetto la famiglia Closteroviridae, che usa la direzione +1.

Fase di lettura -1

Il fenomeno della fase di lettura -1 è stato scoperto per la prima volta nei retrovirus degli animali,

dove due elementi ad azione cis nell’mRNA virale sono richiesti per la fase di lettura: una sequenza

33

eptanucleotide di forma X-XXY-YYZ (X=A/G/C/U; Y=A/U; Z=A/C/U); e una struttura secondaria

RNA, normalmente un pseudonodo, che inizia circa 5 o 6 nucleotidi a valle (dieci, secondo Dam et

al., 1990). La lunghezza e la sequenza dello spazio fra i due segnali ad azione cis contribuiscono

all’efficienza della fase di lettura. I cambi alla sequenza dell’eptamero scivoloso, ma non a monte o

a valle dello stesso, che interrompono la sua struttura ripetitiva, possono drasticamente ridurre la

frequenza della fase di lettura (Jacks et al., 1988). Jacks et al. (1988) suggeriscono un modello di

slittamento simultaneo per la fase di lettura -1 nell’RSV (Rous sarcoma virus) ed evidenziano un

meccanismo simile nei virus delle piante. Ognuno dei due ribosomi-limite tRNA scivolano

simultaneamente nella direzione 5’, dalla loro posizione iniziale alla posizione zero (XXY-YYZ)

alla posizione -1 (XXX-YYY) e la traduzione riprende in una nuova (-!) posizione di lettura. In

questo modello i tRNA formano almeno due paia di basi, nella posizione spostata, con l’RNA virale

e consente solo una marcata corrispondenza alle oscillanti posizioni. Lo slittamento del peptidil-

tRNA e dell’aminoacil-tRNA lega nei siti ribosomali P ed A, rispettivamente, quanto avvenuto

prima del trasferimento del peptide. Weiss et al. (1989)hanno proposto che lo slittamento avviene

dopo il trasferimento del peptide (Farabaugh, 1996). La fase di lettura è stimolata dalle strutture

secondarie così come i pseudo nodi dell’mRNA (Brierley et al., 1989) o, più raramente, dagli

anelli dello stelo (Kim et Lommel, 1998). I pseudo nodi di mRNA consistono in due steli annidati,

il cui cappio di uno forma il paio di basi del secondo. La struttura del pseudonodo nell’RNA di di

BWYV è stato determinato mediante la cristallografia a raggi X (Su et al., 1999) e NMR(Cornish et

al., 2005). Si pensa che il pseudonodo causa allungamento dei ribosomi per indurre la pausa sopra il

sito scivoloso (Somogyi et al., 1993; Lopinski et al., 2000), consentendo più tempo per l’anticodone

e quindi per il necessario riallineamento dell’mRNA Tuttavia, il preciso meccanismo mediante il

quale i pseudonodi dell’RNA, a valle, stimolano la fase di lettura, rimane sconosciuto (Giedroc et

al., 2000). I pseudonodi possono interagire con l’allungamento del ribosoma con lo stesso dominio

richiesto per il sito ribosomale dell’elicasi. Ciò bloccherebbe transitoriamente l'attività dell’elicasi,

impedendo la fusione della struttura secondaria e causando una pausa nel movimento del ribosoma

(Takyar et al., 2005).

Altri elementi possono influenzare l’efficienza della fase di lettura. Un codone di terminazione a

valle, nella posizione -1, migliora la fase di lettura (Lucchesi et al., 2000), probabilmente perché

rappresenta un altro elemento di pausa per la traduzione del ribosoma. Le sequenze a valle e

spaziatrici possono influenzare la fase di lettura (Kim et al., 2001; Mäkeläinen et Mäkinen, 2005).

La coespressione dei prodotti della fase di lettura, P27 e replicasi, insieme con un doppio vettore

contenente un minimo segnale di lettura rivela che solo P27 riduce le produzione del segnale di

lettura a valle (Mäkeläinen et Mäkinen, 2005).

Nei virus delle piante, gli studi più dettagliati sulla -1 fase di lettura sono stati effettuati per i

luteovirus, in particolare BYDV. I luteovirus hanno un singolo filamento del genoma di RNA di

senso positivo contenente sei ORF. La fase di lettura -1 è usata dai luteovirus per il controllo del

rapporto molare della proteasi virale P1 codificante e della P2 codificante RdRp. L’efficienza di

questo evento della fase di lettura varia frail 2% ed il 15% tra i diversi virus. Per BYDV-PAV

8sierotipo PAV), le prime due ORF, di 39kDa e 60kDa, sovrappongono 13 nucleotidi. L’ORF da

60kDa è espressa dallo spostamento della posizione (Brault et Miller, 1992). Prima di incontrare il

codone di terminazione, una piccola proporzione di ribosomi scivola nella posizione -1 e continia a

tradurre l’ORF da 60 kDa per dare una bassa quantità di 99 kDa di proteina di fusione. Il cambio di

posizione si svolge sul sito, G GGU UUU, ed una grande quantità della struttura viene prevista (Di

et al., 1993). Barry et Miller (2002) hanno mostrato che la presenza di una sequenza addizionale

localizzata 4 kb a valle del segnale è essenziale in estratto di germi di frumento. Questa sequenza

comprende un elemento centrale di base da 50 essenziale ed una regione di rinforzo ed un paio di

basi grandi adiacenti al sito di lettura. Perché i ribosomi di traduzione e le molecole di replicasi

virale sono mosse nella direzione opposta sullo stesso modello di mRNA, Miller e colleghi, 2006)

hanno proposto un modello nel quale la grande distanza dell’evento base-accoppiamento permette

la replicazione e la traduzione necessaria senza competizione tra la replicasi virale ed il ribosoma.

34

Il carlavirus PVM (Potato virus M) è unico tra i virus delle piante in cui la traduzione della proteina

produce un capside proteico. La traduzione della proteina di 46 kDa CP/12K richiede un lettura ad

un sito di scivolamento particolare (Gramstat et al., 1994). Un saggio in vitro ha mostrato che solo

un codone di stop di quattro nucleotidi di adenosina e una UGA fiancheggiante sono richiesti per un

efficiente cambio posizionale. Il codone di stop può indurre il ribosoma alla pausa, permettendo lo

slittamento necessario con un tRNAnel solo sito P (Gramstat et al., 1994),

Fase di lettura +1

Nella famiglia Closteriviridae è stato postulato esprimere il loro RdRp via frameshift ribosomale

nrlla regione dell’ORF la/lb (Agranovsky et al., 1995; Karasev et al., 1995; Klaassen et al., 1995;

Karasev et al., 1996). Questo è il solo esempio documentato di un gruppo di virus degli eucarioti

che usa la fase di lettura +1. In BYV, Agranovsky et al. (1994) hanno proposto un modello di

frameshift +1 che è abbastanza simile ai modelli di frameshift -1 (figura 11). Esso coinvolge una

Figura 11 - Strategia di spostamento di BWYV. Lo slittamento (slippage) simultaneo

dell'aminoacil-tRNA e del peptidil-tRNA nella direzione -1 (dallo step 1 allo step

2). Il cappio 2 e il gambo di tre coppie G-C (nel box) sono conservati nei

luteovirus. Lo spostamento della proteina P1-P2 condivide 146 aa con P1.

35

sequenza scivolosa (slippery) GGGUUU, immediatamente a monte del terminatore UAG, e due

forcine, una precedente e l’altra seguente il terminatore. Tuttavia, le differenze nella sequenza con

la regione 1a/1b dell’ORF fra BYV e CTV (la sequenza di slippery e la struttura secondaria

dell’RNA non sono conservate nel CTV), suggerendo che il meccanismo, mediando la frameshift

+1 potrebbe differire, anche se l'evento di frameshift si verifica nello stesso punto (Karasev et al.,

1995). Un altro modello che coinvolge il ribosoma di pausa al terminatore o ad un raro codone

simile al modello proposto per i retrotrasposoni del lievito con il +1 frameshifting è stato seggerito

(Farabaugh et al., 1993). Le analisi della sequenza di BYSV vedono favorire il modello CTV di un

frameshift +1 (Karasev et al., 1996). Nessuna conservazione fra la sequenza aminoacidica del

prodotto di LIYV e quello di CTV, BYSV e di BYV è stato rilevato (Klaassen et al., 1995). Un

altro meccanismo suggerito per l’espressione fra l’ORF1a di LIYV e l’ORF1b è rappresentato dallo

slippaggio mediante tRNALys della sequenza AAAG.

Osservazioni conclusive

I virus dipendono dal meccanismo di traduzione dei loro ospiti, ma è necessario conoscere quanto la

manipolazione dei meccanismi regolatori esistenti nella cellula ed anche quanto attivare i

meccanismi che sono normalmente proibiti. Anche senza i termini dell’RNA canonico, i virus a

RNA delle piante possono mimare mimare le strutture dell’RNA a ciclo chiuso, spesso usando

fattori di iniziazione della traduzione canonica come un mezzo per circola rizzare il loro RNA.

L’interazione degli eIF e le regioni regolatorie dei termini dell’RNA non canonico virale 5’ e 3’

sono importanti per il controllo dell’efficienza e dell’efficacia della traduzione virale. La

competitività degli mRNA virali può spiegare perché i virus delle piante probabilmente possono

spegnere l’espressione del gene ospite. Invece di scindere eIF4G o eIFisoG e rompere la traduzione

cellulare, come fanno alcuni virus degli animali, i virus delle piante sembrano piuttosto manipolare

questi fattori a loro beneficio. Gli elementi IRES, di cui sono provvisti i virus animali con la

capacità di iniziare la traduzione nonostante l’arrestoglobale della traduzione cap-dipendente, sono

stati identificati in alcuni virus delle piante. Tuttavia, questi elementi sono strutturalmente distinti

da quelli trovati nei virus degli animali e rimane da dimostrare se l’iniziazione della traduzione

della guida degli IRES è essenziale per l’ifettività virale delle piante. La ricodifica tradizionale

attraverso la lettura ed i meccanismi di frameshift dotano i virus di una capacità di incremento della

codificazione. Ambedue i meccanismi si verificano ad una bassa frequenza, suggerendo

l’importanza dei rapporti particolari di espressione. I pararetrovirus delle piante possono impiegare

numerosi meccanismi non canonici di iniziazione della traduzione, incluso lo smistamento del

ribosoma, la perdita della scansione e la re iniziazione. Lo smistamento del ribosoma serve anche a

preservare un segnale principale di impacchettamento sul pgRNA virale dalla possibilità di essere

fuso mediante la scansione dei ribosomi, che potrebbe interferire con il legame del proteina del

capside (CP). Gli elementi cis compresa la configurazione del prodotto derivato sono conservati. La

scansione delle perdite e la re iniziazione mediata del virus sono strategie che permettono

l’espressione di più di una proteina da un RNA virale policistronico. Il tabù cellulare riguardante la

reiniziazione del ribosoma dopo la traduzione di una lunga ORF è rotta da una singola proteina

pararetrovirale, TAV, mediante la sua interazione multipla con i fattori ospiti, incluso le proteine

ribosomali e gli eIFs.

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