Jean-Denis Docquier

Laboratorio di Fisiologia e Biotecnologia dei Microrganismi Dipartimento di Biologia Molecolare

Policlinico "Le Scotte", Viale Bracci, II piano, V lotto Tel. 0577 23 3134

jddocquier@unisi.it

Elementi di Micologia

I° anno - Laurea Magistrale Farmacia - 2012-2013

Recupero lezioni Prof. Zazzi: 3 giugno, 9-11, aula 9 4 giugno, 9-11, aula 12 Appelli di esame (aula informatica): 19 giugno, 9-14. 4 luglio, 9-14. 19 luglio, 9-14. 5 settembre, 9-14. 23 settembre, 9-14.

Completa mancanza di tessuti differenziati e elementi

conduttori

Sistema riproduttivo attraverso elementi detti spore e non

attraverso uno stadio embrionale come avviene per piante e

animali

Ubiquitari in natura: • negli strati superficiali del suolo • come commensali di animali e piante

eucarioti immobili chemiosintetici eterotrofi (mancano di clorofilla e sono dipendenti dei composti organici per la nutrizione) parete cellulare rigida

uni o pluricellulari si riproducono per mezzo di spore aerobi (facoltativi) parassiti, saprofiti e simbionti

TALLO: corpo vegetativo di un fungo

Un lievito, Saccharmyces cerevisiae, è stato utilizzato fin dai tempi più remoti per processi alimentari come la lievitazione del pane, la fermentazione del vino e della birra

Penicillium italicum: muffa verde-blu che fa marcire le arance

Penicillium camemberti e P. rocqueforti giocano un ruolo fondamentale nella manufattura dei formaggi di tipo Camembert, Brie e Roquefort

Penicillum notatum e Penicillium chrysogenum, ed un suo metabolita, la penicillina, hanno consentito a Fleming nel 1928 di anticipare l’era antibiotica

Il Tolypocladium niveum produce clicloserina, un immunosoppressore utilizzato nella terapia della sclerosi e nei trapianti e alcuni lieviti vengono utilizzati in ingegneria genetica per la produzione di insulina

Aggregati

PLURICELLULARI

Funghi filamentosi o

MUFFE

L’insieme delle IFE viene detto

MICELIO

IFE

Ife non settate Ife settate

Micelio AEREO:

Strutture specializzate alla riproduzione

Conferisce l’aspetto tipico della colonia

Micelio VEGETATIVO:

Assorbimento di materiale nutritizio dal terreno

UNICELLULARI

Miceti lievitiformi o

LIEVITI

Dimensioni > cellula batterica < cellula animale

LA CELLULA FUNGINA

Capsula polisaccaridica (in alcuni casi)

PARETE CELLULARE RIGIDA

reticolo endoplasmico complesso di Golgi

nucleo compartimentato con cromosomi lineari

mitocondri

membrana plasmatica contenente ERGOSTEROLO

Citoplasma

Membrana plasmatica

Mannoproteine

Chitina (poli-NAG)

b–(1,3)-glucano

b–(1,6)-glucano

Struttura pluristratificata in livelli con particolari composizioni chimiche

Caratterizza la forma del micete

Proprietà antigeniche

Media interazioni con la cellula ospite

ergosterolo

Contiene ergosterolo

Controlla lo scambio di metaboliti con l’ambiente esterno

Coinvolta nella sintesi della parete cellulare

I miceti si riproducono per mezzo di strutture specializzate: SPORE o CONIDI

Due modalità di riproduzione:

sessuata

asessuata

Le due forme possono essere presenti, escludersi o alternarsi nel ciclo vitale di un fungo con ritmi e frequenze diversi nelle varie specie

Riproduzione per

GEMMAZIONE (budding yeasts):

BLASTOGONIA

Sistema in cui le cellule figlie compaiono come protuberanze dalla cellula madre dalla quale poi si distaccano diventando autonome, diversa dalla scissione perché avviene una ripartizione diseguale del citoplasma

Attraverso un processo mitotico vengono prodotte strutture specializzate denominate spore o conidi in grado di generare un nuovo individuo

I conidi hanno il vantaggio di essere molto leggeri, altamente resistenti, facile disseminazione ambientale

Accrescimento longitudinale delle ife

POTENZIALITA’ DI ESPANSIONE INFINITA

Conidiospore: i conidi si distaccano da un conidioforo posto su una ifa aerea

Sporangiospore: le spore vengono prodotte all’interno di un organo detto sporangioforo

Artrospore: le spore sono prodotte per frammentazione delle ife vegetative

Le spore asessuate possono essere:

La diversa morfologia dei conidi permette il riconoscimento delle varie specie di funghi filamentosi

Subordinata alla produzione di milioni di spore diffuse attraverso vento, acqua o insetti

La spora sessuale di un determinato sesso nelle condizioni più favorevoli germina formando un filamento di cellule detto micelio primario

Per poter completare il ciclo biologico e creare il micelio secondario l’ifa primaria generata da una spora con carica “maschile” si unisce una a carica sessuale opposta per formare il micelio secondario che genererà i corpi fruttiferi

Spore sessuali: Zigospore Ascospore Basidiospore

Caratteristica peculiare di alcuni miceti patogeni

Capacità, reversibile, di presentarsi morfologicamente distinti

nella forma parassitaria o tessutale, in genere lievitiforme, e nella

forma colturale o vegetativa, in genere filamentosa

La conformazione è riferibile a:

scarso adattamento dei miceti alle condizioni ambientali (es. temperatura)

meccanismi di regolazione genica esercitati da temperatura, concentrazione ioni, variazioni pH

Abituali saprofiti, l’infezione rappresenta un evento accidentale

Molti prodotti considerati fattori di virulenza sono funzionali a scopi metabolici e riproduttivi

Nelle muffe il meccanismo principale è l’alta capacità di penetrazione nei tessuti e la capacità di adattarsi alle condizioni avverse dei tessuti parassitati

Resistenza alla fagocitosi:

dimensioni del tallo fungino

capacità di interferire con l’attività fagacitaria per presenza di strutture cellulari antifagocitarie: mannani (C. albicans), a 1-3 glucano (Blastomyces dermatitidis, H. capsulatum, P. brasiliensis), capsula (Cryptococcus neoformans), recettori del complemento che inibiscono l’opsonizzazione

Adesività:

meccanismi non specifici: forza idrofobiche, cariche elttrostatiche

meccanismi specifici: interazione tra adesine e recettori (chitina, glucani, mannani: possibili adesine)

Pleomorfismo: pluralità di forme (dimorfismo)

Produzione di tossine: alcune interferiscono con la risposta immunitaria

Candida albicans: canditossina, tossine a basso pm

Aspergillus spp.: aflatossina, gliotossina, fumigatossina, restrictocina

Produzione di enzimi idrolitici: proteasi (C. albicans), fosfolipasi, lipasi, serinproteasi (Aspergillus spp.), cheratinasi (dermatofiti), fenolo-ossidasi (Cryptococcus neoformans)

Barriere meccaniche

Sostanze antimicrobiche non specifiche

Fagocitosi e killing intracellulare

Immunità umorale e cellulo-mediata

Le specie fungine esplicano la patogenicità attraverso:

Parassitismo diretto (micosi)

Produzione di micotossine (intossicazioni micotossicosi)

Intossicazioni alimentari da ingestione di funghi macroscopici velenosi (micetismo)

Reazioni allergiche

La maggior parte delle infezioni da funghi sono lievi ed autolimitanti

Un numero limitato di funghi (generalmente dimorfici) possono causare malattia in soggetti altrimenti sani

MICOTOSSINE DI INTERESSE UMANO

Micotossine Effetto biologico Microrganismo

Aflatossina Carcinogenesi epatica A. parasiticus, A. flavus

Tricoteceni

Tossicità dermatologica; indebolimento del sistema immunitario; inibizione della sintesi proteica; effetto teratogeno

Fusarium, Acremonium, Stachyobotris, Trichoderma, Trichothecium, Verticimonosporium

Antrachinoni Epatotossico, carcinogenesi epatica

Penicillium, Aspergillus

Citreoviridine Neurotossica Penicillium

Naftochinoni Epatotossico Trychophyton, Penicillium viridicatum

Ocratossine Inibizione della tRNA sintetasi Aspergillus, Penicillium

Zearalenone Estrogenico, teratogeno Fusarium graminearum

Cloropeptide Epatotossico, diminuisce la sintesi del glicogeno epatico

Penicillium islandicum

Le micotossine possono esercitare effetti tossici acuti o cronici

Ne esistono numerosi tipi (B1, B2, G1, G2 e i loro derivati metabolici M1 ed M2). Sono fortemente sospettate di esplicare un’azione tossica, mutagena e cancerogena a carico del fegato e tossica per il sistema immunitario Difficili da eliminare perché sono organismi estremamente termoresistenti

Gli alimenti più esposti alla contaminazione sono i cereali (mais, frumento, riso, orzo, segale, ecc.) e derivati (farina e prodotti da forno, polenta ecc.), semi oleaginosi (arachidi,girasole, ecc.), frutta secca ed essiccata, legumi, spezie, caffé e cacao

Le condizioni ideali per lo sviluppo dell’aflatossina sono: 1. temperatura compresa tra 15 e 40 °C (optimum 20-25 °C) 2. umidità relativamente elevata superire al 70% 3. pH i cui valori siano compresi tra 4 e 8 4. presenza di ossigeno

Candida spp.

Cryptococcus neoformans

Malassezia spp.

Dermatofiti

Aspergillus spp.

Pneumocystis jirovecii (Pneumocystis carinii sp. f. hominis )

Miceti con dimorfismo temperatura-dipendente

Specie

Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida glabrata Candida krusei

Specie clinicamente più rilevante

Altre specie clinicamente rilevanti

Habitat:

C. albicans: commensale umano distretti colonizzati: - cavo orale - intestino - vagina Altre specie: più frequentemente ambientali

(acque, suolo, vegetali)

Nei terreni di coltura in genere cresce come LIEVITO

Nei tessuti infetti sono possibili PSEUDOIFE e FORME FILAMENTOSE

Candida albicans può essere considerata un micete dimorfo

Micete lievitiforme (cresce bene a 25 - 37°C)

Habitat: saprofita molto diffuso nell’ambiente abbonda negli escrementi di piccione

Provvisto di abbondante CAPSULA POLISACCARIDICA - fattore di virulenza - colonie di aspetto mucoide - evidenziabile con inchiostro di china

Miceti filamentosi ad ampia diffusione ambientale

Caratteristica morfologia delle strutture conidiali

Il genere Aspergillus comprende varie specie: Aspergillus fumigatus (la specie clinicamente più importante) Aspergillus niger Aspergillus flavus

Distinguibili per caratteri macro- e microscopici

Aspergillus niger

SPECIE SUPERFICIE VERSO

A. clavatus Blu-verde Bianco, marrone con il tempo

A. flavus Giallo-verde Dorato, marrone-rosso

A. fumigatus Blu-verde al grigio Bianco fino al marrone

A. glaucus Verde con aree gialle Giallo fino al marrone

A. nidulans Verde, camoscio o giallo Rosso porpora fino a verde oliva

A. niger Nero Bianco al giallo

A. terreus Cannella fino al marrone Bianco al marrone

A. versicolor Inizialmente bianco, vira poi al giallo, marrone-rosso, verde pallido o rosa

Bianco al giallo o rosso porpora

A. flavus

Aspergillus fumigatus

VANTAGGI: - rapidità - semplicità

esame microscopico a fresco

esame microscopico dopo colorazione di Gram

esame microscopico dopo colorazione con lattofenolo

esame microscopico dopo colorazione con inchiostro di china

esame microscopico dopo colorazione con calcofluor

TERRENI DI COLTURA

Non selettivi Sabouraud dextrose agar: pH 5.6 favorisce la crescita dei miceti invece che dei batteri

SAB Heart infusion (SABHI): arricchito di nutrienti, adatto per Blastomyces e Histoplasma

Potato dextrose

Selettivi

Mycosel (SAB con antibiotici): cloramfenicolo; cyclohexamide inibiscono la crescita dei saprofiti

Chromagar: terreno cromogenico per lieviti

Czapek agar: usato nella coltivazione dei microrganismi capaci di utilizzare nitrogeno inorganico; raccomandato per l’isolamento di Aspergillus e Penicillium

Corn meal agar

Sabauraud dextrose agar

Terreno cromogeno per

lieviti

Czapek

MUFFE Identificazione microscopica in base ai conidi e conidiofori

LIEVITI mediante terreni cromogenici

mediante test biochimici

E-test: MIC in agar diffusione

Sensititre: MIC in microdiluizione

Caratteristiche di un antifungino ideale:

Bersaglio selettivo

Attività fungicida

Elevata potenza

Ampio spettro

Bassa tossicità

Scarse o assenti interazioni farmacologiche

Disponibili in numero molto minore degli antibatterici - più difficile trovarne data la natura eucariotica della cellula

fungina

- l’impatto delle infezioni fungine è minore di quello delle infezioni batteriche

• Antibiotici POLIENICI

• Chemioterapici AZOLICI

• Allilamine

• Griseofulvina

• 5'-Fluorocitosina

• Echinocandine

Amfotericina B (uso sistemico)

Nistatina (uso topico)

Il numero di doppi legami coniugati è direttamente proporzionale all’attività antifungina e inversamente proporzionale alla tossicità in cellule

di mammifero. I comporti con 7 doppi legami, come l’amfotericina B, non solo sono circa 10 volte più tossici per la cellula fungina, ma sono gli unici

che possono essere impiegati per terapie sistemiche nell’uomo

Relativa nefrotossicità (Amfotericina B) (migliorata dalle formulazioni liposomiali)

Meccanismo di azione: legame a membrane contenenti ergosterolo formazione di canali transmembranari (effetto permeabilizzante)

Amfotericina B è pochissimo solubile in acqua. Complessata con acido desossicolico per somministrarla ev. Più recentemente formulazioni complessate con lipidi e incapsulate in liposomi ne hanno diminuito la tossicità e permettono di avere livelli plasmatici più elevati del farmaco

SQUALENE Squalene epoxide LANOSTEROL 14-alpha-demethyl lanosterol Zymosterol Fecosterol ERGOSTEROL

Squalene epossidasi

Lanosterolo 14-alpha demetilasi

ALLILAMINE: Naftifina Terbinafina

AZOLI: Ketoconazolo Fluconazolo Itraconazolo Voriconazolo

Caratterizzate dalla presenza di un gruppo allilaminico (naftifina e terbinafina) Butenafina e tolnaftato vengono annoverati in questa classe anche se hanno struttura diversa perché accomunati dallo stesso meccanismo d’azione

Indicazioni: micosi cutanee e degli annessi (Dermatofizie) (il farmaco si concentra nella cute e negli annessi)

Meccanismo di azione: inibizione sintesi ergosterolo bersaglio: SQUALENE EPOSSIDASI

Gli azoli sono classificati come: 1. imidazoli se possiedono due atomi di azoto nell’anello azolico (ketoconazolo) 2. triazoli se contengono tre atomi di azoto (fluconazolo, itraconazolo e voriconazolo,

posaconazolo e ravuconazolo)

Meccanismo di azione: inibizione sintesi ergosterolo bersaglio: LANOSTEROLO DEMETILASI

I triazoli hanno tossicità minore degli imidazoli a causa della loro maggiore specificità per i citocromi P450 fungini rispetto a quelli delle cellule di mammiferi

Ridotta permeabilità che impedisce l’ingresso del farmaco nella cellula

Aumentata produzione enzima bersaglio Erg11p per incrementata espressione del gene codificante ERG11

Alterazioni enzima bersaglio per mutazioni che ne diminuiscono l’affinità con gli azoli

Pompe da efflusso che estrudono il farmaco e non ne permettono l’accumulo, sono pompe do tipo “ABC trasporter”

> Bassa tossicità

> Frequente l’insorgenza di resistenza a causa di mutazioni a carico dei tre enzimi chiave

Meccanismo di azione: Inibizione della sintesi degli acidi nucleici Inibizione della sintesi proteica

5-FLUOROCITOSINA 5-FLUOROURACILE Citosina deaminasi

5-FLUOROURIDINA TRIFOSFATO

incorporato nel RNA della cellula fungina e determina inibizione della sintesi proteica

5-FLUORODESOSSIURIDINA MONOFOSFATO

Inibitore della timidilato sintetasi, enzima chiave nella

sintesi del DNA

Trasportato all’interno della cellula ad opera dell’enzima citosina permeasi

Uridina monofosfato fosforilasi

Si pensa che si leghi con la proteina tubulina, interferendo con il corretto funzionamento del fuso mitotico e quindi interferisca con la divisione cellulare

Meccanismo di azione:

Indicazioni: micosi superficiali delle unghie

Ergosterolo

Meccanismo di azione: inibisce specificatamente la sintesi del b-1-3-D-glucano, componente essenziale per l’integrità della parete; provoca un’aumentata permeabilità della parete e la conseguente lisi della cellula

Cryptococcus neoformans non risulta sensibile Zygomycetes sono naturalmente resistenti