Dominio degli Acytota o Aphanobionta

Si definisce forma di vita non cellulare o acitota una forma di vita che esiste senza possedere una

struttura cellulare. Questo termine presume la classificazione dei virus come forme di vita.

Nelle discussioni sulla tassonomia dei domini viventi, il termine acytota viene utilizzato

occasionalmente (assieme all'equivalente Aphanobionta), come il nome del regno dei virus. Il

corrispondente dominio degli organismi cellulari sarebbe quindi detto cytota.

Il concetto di "vita" senza struttura cellulare è emerso con forza nella comunità scientifica nel 2003,

in seguito alla scoperta del Mimivirus, pur non venendo universalmente accettato. Si definisce

Mimivirus un genere virale contenente una sola specie ad oggi identificata (figura 1), cui è stato

attribuito il nome Acanthamoeba polyphaga mimivirus (APMV). Nel linguaggio colloquiale,

l'APMV è più comunemente definito con la sola denominazione di “Mimivirus”. Questa specie

possiede il più grande capside fra tutti i virus conosciuti, così come il più esteso e complesso

genoma.

Figura 1 – Schema di Acanthamoeba polyphaga mimivirus, con il più grande capside fra tutti i

virus conosciuti. Si tratta di un virus a dsDNA, con una capacirà codificante del

90%, con 1,2 milioni di paia di basi, circa 911 geni codificanti proteine, geni

aggiuntivi (aminoacil tRNA sintetasi, metabolismo degli zuccheri, dei lipidi e

degli aninoacidi

I gruppi appartenenti agli Acytota sono:

Akamara (agente genomico acellulare)

Euviria (veri virus)

Virus

Satellite

Viroide (agenti subvirali)

Virusoide

Virofago

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Transposone

Elemento virale endogeno (come il provirus)

Plasmide che include

Cosmide

Fagemide

Prione (agente proteico di infezione)

Viroidi e prioni

I virus variano notevolmente nella morfologia, nella struttura e nel modo di replicarsi. In questo

mondo virale esiste ogni versione di acido nucleico: RNA o DNA a singolo o doppio filamento,

lineare o circolare. Ebbene, pur con tanta varietà, c’è dell’altro. Vi sono in natura altri agenti, detti

viroidi e prioni, che non sono conformi alla definizione di virus, anche se sono altrettanto piccoli e

contagiosi. Esiste una stretta affinità fra virus e viroidi: i viroidi sono infatti molecole di acido

nucleico nude composte interamente di RNA circolare. I prioni, d’altro canto, sono entità infettanti

a parte: sono costituite soltanto di singole molecole proteiche. La descrizione che qui sarà fatta dei

prioni è stata inserita in questa sezione del libro perché non è stato possibile individuare un’altro

settore affine in cui poter inserire questo interessante tema scientifico.

Viroidi. I viroidi sono i più piccoli agenti patogeni conosciuti e agenti causali di malattie delle

piante. La forma extracellulare del viroide consiste semplicemente di molecole di RNA nude,

ovvero non racchiuse da un rivestimento proteico protettivo; tali agenti infettanti non codificano

infatti neppure per una singola proteina. Un viroide è quindi solo una piccola molecola di RNA

circolare arrotolata su se stessa a creare un esteso segmento a doppio filamento (figura 2).

Figura 2 – Struttura di un viroide

I viroidi causano malattie nelle coltivazioni agricole, come le maculature solari nell’avocado, il

mosaico latente nella pesca e la maculatura fogliare gialla (cadangcadang) nella noce di cocco, e

costituiscono in agricoltura un problema economico serio. Infatti, sia la coltivazione della noce di

cocco nelle Filippine che il crisantemo che cresce negli Stati Uniti sono stati minacciati seriamente

dalle malattie indotte da viroidi. Come fanno i viroidi a causare malattia? Moltiplicandosi essi

deviano le risorse delle cellule, anche se tale alterazione nei nutrienti non riesce a condizionare

molto l’ospite vegetale. Si pensa che per causare effetti patogeni di rilievo si debba verificare

un’interazione diretta fra l’RNA del viroide e uno o più obiettivi cellulari; tuttavia il meccanismo

non è ancora conosciuto nei suoi dettagli.

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Una delle caratteristiche maggiori dei viroidi è la loro piccola dimensione; per esempio, il viroide

che infetta la patata e che causa l’affusolamento del tubero di patata (Potato spindle tuber viroid,

PSTVd) contiene soltanto 359 nucleotidi (figura 3).

Figura 3 – Potato spindle tuber viroid, PSTVd. Tubero sano a destra a confronto con tre tuberi

deformati a fuso a causa del virus (A); pianta di patata nanizzata, con portamento

assurgente a causa dell’infezione di PSTVd (B); Solanum jasminoides (C), Brugmansia

spp (D), Lycianthes rantonnetii (E), sono alcune solanacee ornamentali in grado di

ospitare il PSTVd.

I viroidi non sono protetti da un capside e non sembra che ne abbiano bisogno. Essi posseggono

vaste regioni a doppio filamento che sono resistenti alla distruzione da parte delle ribonucleasi.

Circa la riproduzione dei viroidi va detto, innanzitutto, che essi, poiché non debbono affrontare il

problema di sintetizzare le proteine del capside, nel loro genoma non sono codificati i relativi geni.

Tuttavia essi devono affrontare, al pari dei virus a RNA, il problema di sintetizzare l’RNA da RNA

stampo, ed inoltre di come renderlo circolare.

Le modalità con cui i viroidi compiono tale sintesi è un evento abbastanza complesso. L’RNA dei

viroidi infettanti viene replicato da una RNA polimerasi dell’ospite che può sintetizzare l’RNA

usando un RNA stampo. Le polimerasi sono comuni nelle piante ma non lo sono negli animali e nei

batteri non infetti. Il processo di replicazione viene attuato mediante l’impiego dell’RNA circolare

come stampo e formando una copia, complementare ad esso, con lo spostamento tutto intorno al

cerchio; questo meccanismo di replicazione a cerchio rotante viene usato anche da alcuni virus a

DNA e dai plasmidi. Il risultato di tale operazione non consiste in una singola copia dello stampo,

ma in una lunga serie di copie ripetute in tandem, come un rotolo di carta non svolto. Per produrre i

viroidi, questa lunga molecola deve essere scissa in segmenti di dimensioni adeguate; questo può

essere fatto in uno dei due seguenti modi. In alcuni viroidi, lo stesso RNA presenta un’attività

enzimatica, ossia un ribozima che è capace di tagliare la lunga catena in singole copie; in altri

viroidi il taglio viene eseguito da una endonucleasi dell’ospite. In entrambi i casi le copie risultanti

devono legarsi in cerchi, che poi assumono la struttura molecolare del viroide. Il solo agente

infettante umano simile al viroide è detto erroneamente virus dell’epatite D (Hepatitis D virus,

HDV); in realtà tale particella è qualcosa di intermedio fra un virus e un viroide e quindi un’altra

possibile denominazione potrebbe essere quella di “virusoide”. Inoltre, HDV è costituito da RNA

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nudo che differisce dai viroidi delle piante in quanto codifica per proteine. Tuttavia, a differenza dei

virus veri e propri, l’agente dell’epatite D non codifica per il proprio capside, mentre le proteine che

esso codifica sembrano svolgere un ruolo importante nell’impacchettamento delle particelle.

L’agente dell’epatite D utilizza il capside di un virus autentico, ossia il virus dell’epatite B (HBV),

per essere impacchettato. Da tutto ciò si evince che la malattia dell’epatite D si verifica solo se

l’ospite viene contemporaneamente coinfettato dal virus dell’epatite B e dall’agente dell’epatite D.

Questo particolare tipo di infezione doppia comporta l’insorgenza di una malattia ben più grave di

quella indotta dalla sola infezione da virus dell’epatite B. L’agente dell’epatite D può causare la

malattia, inattivando un componente essenziale delle cellule: il suo RNA presenta, infatti, un’ampia

omologia di sequenza con una particella citoplasmatica di RNA, la 7S, coinvolta nel riconoscimento

del segnale e nella traslocazione di proteine secretorie e di quelle associate alla membrana; è

probabile che l’RNA del virusoide sequestri o scinda la particella 7S, determinando la morte

cellulare.

Prioni. La degenerazione del sistema nervoso centrale costituisce una grave patologia, spesso con

conseguenze mortali per gli esseri umani e gli animali. Recentemente, la più nota patologia

degenerativa cerebrale è stata la cosiddetta “malattia della mucca pazza”, ma ci sono anche altre

manifestazioni cliniche simili, come la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) negli esseri umani e lo

scrapie nelle pecore. Queste malattie sono denominate nel loro insieme encefalopatie spongiformi

perché formano fori nel cervello, che fanno assumere al tessuto cerebrale un aspetto a spugna. La

natura infettiva di una di queste malattie umane, il kuru, fu ipotizzata quando venne osservata

l’associazione fra persone colpite ed il loro consumo di carne di cervello umano, a seguito di rituali

tribali. È stato poi provato che alcune di queste malattie possono essere trasmesse anche in animali da

laboratorio. In tutti questi esempi patologici, i ricercatori hanno sospettato che l’agente eziologico

potesse essere un virus e tuttavia non riuscivano ad isolare alcun agente infettivo conosciuto (virus,

batteri o altri). In seguito, fu chiarito che l’agente infettivo, poi chiamato “prione”, è altamente insolito,

in quanto non contiene acidi nucleici, ma è composto interamente da una proteina. Ciò risulta

sorprendente perché tutti gli altri agenti infettivi, ovvero tutte le entità in grado di replicarsi,

possiedono genomi a base di acido nucleico. Tale mistero è stato parzialmente risolto con la scoperta

che le proteine prioniche hanno proprietà insolite. Al pari delle altre proteine possono piegarsi in un

certo numero di strutture tridimensionali differenti: in una configurazione, sono costituenti normali

delle cellule del sistema nervoso centrale e non causano danno; in un’altra configurazione, invece, si

trasformano in prioni e assumono la capacità insolita di fungere da stampo per convertire le molecole

di proteine normali in prioni. I prioni e i loro precursori normali hanno la stessa sequenza

aminoacidica e sono codificati dagli stessi geni: differiscono solamente nella conformazione

molecolare, ovvero nel modo in cui tali componenti proteici sono ripiegati. Le proteine, precursori

normali dei prioni (proteina prionica cellulare o PrPc ), sono, infatti, ricche di siti molecolari nella

conformazione α-elica, mentre tutte le proteine patologiche prioniche (PrPSc) mostrano una

prevalenza di siti molecolari che si presentano “srotolati” (unfolded) nella conformazione a foglietti-β.

Contrariamente alle loro controparti normali, i prioni sono altamente resistenti alle proteasi, agli

agenti chimici aggressivi ed alle temperature elevate. La disinfezione di materiali contaminati da

prioni richiede misure di disinfezione specifiche: per esempio, gli oggetti contaminati devono essere

impregnati di idrossido di sodio 1N (normale), per almeno un’ora, per poter distruggere le proteine

prioniche.

Vediamo come fanno i prioni a imporre il loro tipo di ripiegamento alle molecole normali. Si pensa

che i prioni inducano le proteine normali a ripiegarsi nella forma di prione. Non è noto, tuttavia, se i

prioni agiscano su proteine che sono ancora nel processo di piegamento o su quelle che già si sono

piegate nella loro configurazione naturale. Tale processo non è stato ancora riprodotto in vitro; si

ritiene che esso sia irreversibile, ossia i prioni non ritornano ad essere proteine normali. Qualunque sia

il meccanismo, l’accumulo di quantità sufficienti di prioni e la loro diffusione alle cellule adiacenti

comporta l’alterazione delle normali funzioni cerebrali. Nelle pecore la malattia è denominata scrapie

perché gli animali ammalati si strofinano intensamente su qualsiasi superficie, scorticando la propria

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lana e la pelle (scrape, scorticare). Con la morte di ampi aggregati cellulari nervosi, il cervello assume

sempre più la forma di un formaggio svizzero con i buchi.

Le proteine prioniche si aggregano in fibrille traslucide cerose, dette amiloidi, che inducono la morte

programmata delle cellule. Il termine “encefalopatia spongiforme” si riferisce all’aspetto spugnoso

del tessuto cerebrale che consegue alla estesa necrosi cellulare.

Le malattie da prioni mostrano sempre uno sviluppo lento nel tempo; è opportuno sottolineare che la

funzione della forma normale dei prioni è ancora sconosciuta. I topi mutanti privi di questa proteina

non mostrano sintomi. È possibile ipotizzare che se i prioni interessassero una proteina essenziale, le

manifestazioni della malattia sarebbero più immediate.

In termini generali, l’attività dei prioni rientra nel campo di interesse dell’epigenetica, ovvero dei

cambiamenti ereditari che non derivano da sequenze alterate del genoma. In tal senso gli esempi che

riguardano organismi complessi sono alquanto numerosi – si pensi alla capacità delle cellule del

fegato di riprodurre sempre se stesse pur avendo lo stesso genoma, per dire, delle cellule di muscolo.

In alcuni casi, il cambiamento nel modello dell’espressione genica che caratterizza un dato tipo di

cellule è stato attribuito a modificazioni del DNA, dovute a metilazione.

Negli organismi unicellulari il fenomeno sembra essere più limitato; comunque i lieviti hanno

proteine che si comportano come prioni, ossia inducono modificazioni ereditabili se introdotte per

accoppiamento in altre cellule. Come i prioni animali, i prioni dei lieviti si aggregano in fibrille e

inattivano le loro forme naturali. Rimane da vedere quanto sia diffuso il meccanismo dei prioni negli

altri organismi. I prioni potrebbero essere coinvolti in altri fenomeni epigenetici, come la memoria a

lungo termine o persino la differenziazione delle cellule somatiche.

I virus, i viroidi ed i prioni rivelano la grande plasticità del mondo biologico, ampliando i nostri

concetti basilari sulla cellula come base della vita ai messaggeri chimici delle informazioni

genetiche. Da queste entità infettanti si apprende che determinati fenomeni da cui dipendono i nostri

concetti su che cosa è un vivente, come si replica e muta, non sono di pertinenza delle sole cellule.

Questi processi possono essere indipendenti rispetto alle caratteristiche principali delle cellule, che

sono, fra l’altro, quelle di dividersi e formare cellule figlie. Tali entità intracellulari non operano nel

vuoto: hanno bisogno di cellule in grado di fornire l’energia ed i meccanismi di sintesi delle

proteine. Se i virus, che sono già capaci di sintetizzare il proprio acido nucleico, fossero dotati di un

meccanismo necessario per ottenere l’energia e sintetizzare proteine, forse sarebbero capaci di

replicazione autonoma. In altre parole, forse, sarebbero delle vere cellule. Tutto ciò sembra

assumere una particolare importanza per alcuni dei grossi virus dotati di envelope, come quelli che

causano il vaiolo, che sono forniti di un significativo complesso enzimatico per la sintesi dell’acido

nucleico.

Questo contesto così stimolante invita ad ulteriori congetture. Da dove si originano i virus? Sono

essi delle “cellule in forma ridotta”, ovvero il risultato della perdita delle proprietà necessarie per

poter condurre un’esistenza indipendente, oppure si sono evoluti come entità nuove? O ancora,

seguono altre vie evolutive? Che significato può assumere la grande varietà dei virus, anche in un

singolo ospite? Si pensi a tutti i virus conosciuti che causano patologie solo nell’uomo. A differenza

dei batteri, che si sono evoluti in modo indipendente, i virus si sono evoluti solo in associazione con

i loro ospiti. Inoltre, i prioni sono più diffusi di quanto oggi possiamo sapere ed assolvono funzioni

nei fenomeni biologici essenziali, come la differenziazione.

Virusoidi. Gli RNA delle piante a basso peso molecolare, circolari, con singolo filamento patogenico

creano un considerevole interesse per le piccole dimensioni dei loro 246 a 388 nucleotidi, per le loro

caratteristiche strutturali uniche e per la loro capacità di produrre spesso sintomi gravi o nessun

sintomo nelle piante infette. Molti di essi sono importanti patogeni delle piante coltivate. La loro

apparente incapacità nel codificare qualsiasi proteina indica che tutte le interazioni con i componenti

cellulari avvengono mediante le loro sequenze e le loro strutture secondarie e terziarie. La

caratteristica di alcune delle interazioni è, probabilmente, quella di contribuire alle conoscenze della

struttura delle relazioni e della funzione dell’RNA in tutte le cellule (Diener, 1979; 1983; 1987;

Riesner et Gosso, 1985; Keese et Symons, 1987; Keese et al., 1988).

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Questi RNA possono essere suddivisi in due gruppi:

i viroidi, che replicano indipendentemente perché non richiedono un virus helper ;

i virusoidi con gli RNA incapsulati, simili a virus, che richiedono un virus helper.

Tabella 1 – Classificazione dei viroidi in relazione al gruppo ed al sottogruppo. __________________________________________________________________________________________________________________

Nome Sigla Lunghezza dei nucleotidi

___________________________________________________________________________

A, gruppo ASBV

Sottogruppo ASBV

Avocado sunblotch viroid ASBV 246-251

B, gruppo PSTV

B1, sottogruppo PSTV

Chrysanthemum stunt viroid CSV 354 e 356

Citrus exocortis viroid CEV 370-376

Coconut cadang-cadang viroid CCCV 246 e 247

Coconut tinangaja viroid CTiV 254

Columnea latent viroid CLV 370

Cucumber pale fruit viroid CPFV 303

Hop latent viroid HLV 256

Hop stunt viroid HSV 297-303

Potato spindle tuber viroid PSTV 359

Tomato apical stunt viroid TASV 360

Tomato planta macho viroid TPMV 360

B2, sottogruppo ASSV

Apple scar skin viroid ASSV 330

Australian grapevine viroid AGV 369

Grapevine yellow speckle viroid GYSV 367

Grapevine viroid 1B GV1B 363 _______________________________________________________________________________________________________________

aSchema di classificazione di Koltunow et Rezaian (1989) per i viroidi sequenziati. bCucumber pale fruit viroid è realmente una sequenza variante di Hop stunt viroid.

Solo quattro virusoidi sono stati finora scoperti, tutti in Australasia (tabella 2), sebbene un diverso

isolato di Lucerne transient streak virusoid (vLTSV) è stato trovato in Canada (Abouhidar et Paliwal,

1988).

Tabella 2 – Virus attualmente scoperti.

___________________________________________________________________________

Nome Sigla dei Lunghezza dei nucleotidi

virusoidi

______________________________________________________________________________

Lucerne transient streak virus vLTSV 324

Solanum nodiflorum mottle virus vSNMV 377

Subterranean clover mottle virus vSCMoV 332 e 388

Velvet tobacco mottle virus vVTMoV 365 e 366

________________________________________________________________________________

I 16 viroidi (tabella 1), che sono stati così definiti, possono essere divisi i due gruppi principali sulla

base delle della sequenza omologa comparativa. Avocado sunblotch viroid (ASBV) è finora l’unico

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membro, mentre i viroidi rimasti possono essere divisi in due sottogruppi basati sulle relative

sequenze nella parte centrale delle molecole viroidi bastonciniformi (Keese et Symons, 1985, 1987;

Koltunov et Rezaian, 1989 ).

I virusoidi nelle piante infette esistono quasi unicamente come molecole circolari libere o incapsulate

entro i virioni dei virus helper.

Ciò è in contrasto con le dimensioni dei satelliti ad RNA di Tobacco ringspot virus (TRSV) che è

stato trovato in vivo in ambedue le molecole circolari a singolo filamento, ma solo le forma lineare è

incapsulata (Kiefer et al., 1982; Bruening, 1990).

Sebbene è generalmente considerato che un viroide ed un virusoide non codificano per nessun

polipeptide, la prova definitiva, evidente e circostanziale è pienamente carente (Sanger, 1987; Keese

et Symons, 1987).

Nonostante l’incapacità degli RNA circolari ad essere tradotti mediante i ribosomi degli eucarioti

(Kozak, 1979), la possibilità non può essere dismessa che frammenti subgenomici dei viroidi e dei

virusoidi possono agire come gli RNA messaggero in vivo e che la fase di iniziazione della sintesi del

peptide può verificarsi per un codone diverso da AUG (Dasso et Jackson, 1989; Kozak, 1989).

Il maggior problema nella sequenza relativa e struttura dei viroidi e virusoidi a funzionare è la

scarsità delle funzioni dei marcatori.

Quando usando i mutanti per questo tipo di lavoro, questi possono essere ottenuti in due modi, sia

mediante isolamento naturali, verificando mutanti di un viroide o di un virusoide (varianti di

sequenze), sia preparando loro mediante mutagenesi sito-diretta dei cloni di cDNA (Owen et

Hammond, 1988; 1990).

Tuttavia, il saggio della variazione dell’effetto patogenetico sulle piante inoculate è una delle poche

strade valide che hanno fornito dati definitivi (Visvader et Symons, 1986). Più recentemente, dati

preliminari che indicano un effetto su movimento da cellula a cellula di Potato spindle tuber viroid

(PSTV), mediante mutazioni nell’anello terminale destro della molecola del viroide, dovrebbe

aiutare ad identificare le caratteristiche strutturali che determinano il range degli ospiti del viroide

(Owens et Hammond, 1990).

Nell’area di replicazione, nell’analisi in vitro in lavorazione dei precursori oligometrici di ASBV ed i

quattro virusoidi hanno identificato una specifica struttura di autoscissione nota come il martello ed

ha mostrato che circa il 20-30% di ogni molecola è richiesto per la formazione di queste strutture.

Questa area è discussa sotto, insieme con i domini di sequenza nei viroidi, in termini di evidente

funzione e fornitura per l’evoluzione dei viroidi e possibili virusoidi, mediante ricombinazione

dell’RNA.

I domini di sequenza nei viroidi indicano evoluzione mediante riarrangiamento dell’RNA

Analisi comparative a coppie delle sequenze dei membri del sottogruppo B1 di PSTV (tabella 1)

indicano la presenza di cinque domini (figura 1), i confini dei quali sono stati definiti da bruschi

cambiamenti, da alti a bassi o viceversa, nell’omologia della sequenza (Keese et Symons, 1985;

Keese et al., 1988).

Differenti confronti di coppie sono stati sempre consistenti nel definire l’esatta posizione dei confini.

Il modello del dominio è stato sviluppato mediante l’impiego di sequenze solo del sottogruppo B1 di

PSTV (tabella 1). Tuttavia, i viroidi di Apple scar skin viroid (ASSV), sottogruppo B2, hanno gli

stessi domini, come osservato attraverso il confronto delle sequenze (Koltuniw et Rezaian, 1989).

Il gruppo PSTV della tabella 1 è diviso in due sottogruppi sulla base delle sequenze conservate nel

dominio centrale (C).

Entro il dominio C di ogni sottogruppo, ci sono le sequenze di circa 30 nucleotidi che sono altamente

conservate fra tutti i membri di ogni sottogruppo, ma che sono abbastanza differenti da quelli

dell’altro sottogruppo (Visvader et al., 1985; Koltunow et Rezaian, 1989). Queste sequenze centrali

conservate compongono circa un terzo del dominio C, in ogni caso. Tuttavia, una caratteristica

comune di ogni sottogruppo è la presenza di una breve, rovesciata, ripetuta sequenza, con i nucleotidi

conservati, che si può osservare con le frecce della figura 4.

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Figura 4 – Modello dei domini per il gruppo dei viroidi di Potato spindle tuber virus (PSTV). I

cinque domini T1, P, C, V e T2 sono stati determinati dalle omologie delle sequenze tra i

viroidi. Le frecce rappresentano una sequenza ripetuta invertita, che può formare un

ciclo continuo. Gli elementi delle sequenze sono quelli del sottogruppo B1 di PSTV

(tabella 1). R ed Y indicano una corta elica di oligopurine-oligopirimidine. Gli stessi

domini esistono in Apple scar skin viroid (ASSVd) sottogruppo B2 (Keese et Symons,

1987; Koltunow et Rezaian, 1989),.

Questo modello di dominio è guidato dalla proposta che l’evoluzione dei viroidi include il

riarrangiamento dei domini fra i viroidi che infettano la stessa cellula, seguito da un’ulteriore

evoluzione (Keese et Symons, 1985). Un supporto sperimentale di come un modello è difficoltoso da

ottenere è rappresentato da nuove sequenze del viroide che continuano ad apparire, come risulta da

una forte evidenza indiretta. Per esempio (Hammond et al., 1989), nella recente sequenza di

Columnea latent viroid (CLVd), i domini del terminale sinistro (T1) e del terminale destro (T2)

mostrano un’elevata omologia di sequenza nello stesso dominio in PSTV e Tomato apical stunt

viroid (TASVd), rispettivamente, con confini bruscamente definiti e consistenti, con confronti a

coppie. (figura 5).

Figura 5 – Diagramma schematico di Columnea latent viroid (CLVd) che mostra le omologie di

sequenza in altri viroidi. I domini sono mostrati insieme con i numeri del residuo ai

confini di ogni dominio. La regione centrale conservata (CCR) contiene la sequenza

ripetuta invertita (Hammond et al., 1989).

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La presenza di lunghi subdomini delle sequenze di Tomato planta macho viroid (TPMVd) nel

dominio patogenetico (P) e di PSTV e di Hop stunt viroid (HSV) nel dominio C (figura 5) indica

che i riarrangiamenti possono avvenire entro un dominio come ai confini.

Un viroide più complesso è l’Australian grapevine viroid (AGV) del sottogruppo B2 di ASSV

(tabella 1) nel quale quasi tutti i 370 nucleotidi appaiono essere derivati dai segmenti di Citrus

exocortis viroid CEV), PSTV, ASSV e Grapevine yellow speckle viroid, GYSVd (Rezaian, 1990),

La somiglianza della sequenza dei segmenti di AGV varia dal 52 al 100% delle corrispondenti

sequenze nei viroidi dei parentali putativi (Koltunow et Rezaian, 1989).

Solo un esempio è stato trovato finora nei virusoidi dei riarrangiamenti di tali RNA. Quattro

separati isolati di Subterranean clover mottle virus (SCMoV) contengono due virusoidi di differenti

dimensioni, i quali possono stare insieme o separatamente (Francki, 1985; 1987). Analisi della

sequenza dei virusoidi mostrano l’evidente situazione in cui la sinistra di ogni molecola è quasi

identica, mentre le parti destre sono completamente diverse, ad eccezione di alcune brevi sequenze

(Davies et al., 1990), come si può osservare in figura 6. Presumibilmente, i due virusoidi sono sorti

dalla ricombinazione fra i tre parentali che devono essere ancora scoperti ed identificati.

Figura 6 – Strutture secondarie proposte per gli RNA di Subterranean clover mottle virusoid

(SCMoVd). I nucleotidi conservati tra gli RNA, in posizioni simili della struttura

secondaria, sono racchiusi in box. Una sequenza di 18 nucleotidi, in cui 14 dei nucleotidi

sono comunemente in ambedue gli RNA è indicata con una linea spessa. Il sito di auto-

scissione in ogni RNA è mostrato da una freccia (Davies et al., 1990).

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Il meccanismo di questi riarrangiamenti dell’RNA è sconosciuto. Un possibile meccanismo è la

trascrizione discontinua dove una polimerasi di RNA, copiando un modello di viroide o di un

virusoide cambia, oltre a copiare, un secondo modello di giusta posizione allo stesso punto, molto

probabilmente determinato mediante le strutture terziarie di due modelli (Keese et Symons, 1987).

Esempi di ricombinazione fra più virus a filamento RNA si stanno accumulando (King, 1988). Nel

caso dei virus delle piante, forse il classico e definitivo esempio è quello proposto da Allison et al.

(1990) per il Cowpea chlorotic mottle virus (CCMV), in cui la completa infezione richiede

l’inoculazione simultanea dei tre RNA genomici. Gli RNA 1 e 2 sono ciascuno monocistronici,

mentre RNA 3 è dicistronico, codificante per la proteina 3a (probabilmente responsabile del

movimento del virus nella pianta) e per la coat protein.

L’inoculazione delle piante con gli RNA 1 e 2 normali e due RNA 3, uno con una delezione nel

cistrone 3a e l’altro con una delezione nel cistrone della coat protein, guida alla infezione normale e

la scoperta di RNA3 di tipo selvatico. Nessuna infezione sistemica si riscontra quando ognuno dei

mutanti RNA 3 è stato inoculato separatamente con RNA 1 e RNA 2. Quindi, l’evento di

ricombinazione dell’RNA deve avvenire con un’elevata frequenza in molte delle cellule inoculate.

Un risultato potrebbe incoraggiare i ricercatori nel campo dei viroidi e dei virusoidi se simili

esperimenti riescono a provare l’evoluzione dei viroidi e dei virusoidi mediante la riorganizzazione

dell’RNA.

Il dominio P di CEV gioca un ruolo nella patogenicità

Naturalmente bisogna disporre di isolati dei viroidi, preparati da singola pianta, spesso con più di

una variante della sequenza di un viroide e poter separare e sequenziale, mediante la preparazione

di strutture clonali di piena lunghezza, dei cloni del cDNA da miscele di viroidi (Visvader et

Symons, 1985; Rakowski et Symons, 1989).

Dei cloni di cDNA dei viroidi e loro trascritti di RNA che sono infettivi quando inoculati su piante

suscettibili (Cress et al., 1983) possono essere preparati, ciò offre un’unica opportunità per mettere

in relazione la sequenza e quindi la struttura, con la patogenicità.

Figura 7 – Sommario dell’analisi di 17 varianti di sequenze di Citrus exocortis viroid, CEV,

(Visvander et Symons, 1985). Molti cambi di nucleotidi avvengono nei domini PL e PR

entro i domini di CEV patogenici, normali (P) e variabili (V).

Analisi della sequenza di varianti di PSTV, CEV e HSV mostrano che almeno tutte le differenze

delle sequenze per ogni viroide sono localizzate entro i domini di P e della variabile V (Schnölzer et

al., 1985; Visvader et Symons, 1985; Shikata, 1990). Ciò indica che la variazione della gravità

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dell’espressione dei sintomi di queste varianti della sequenza è molto probabilmente determinata

dalla variazione della sequenza in uno o ambedue questi domini. Molti dati sono variabili per CEV

ed i risultati mostrano che in 17 varianti, essenzialmente tutta la variazione delle sequenze avvenute

entro i domini di P e di V nelle regioni chiamate PL e PR (figura 7, Visvader et Symons, 1985;

Keese et al., 1988).

Per definire se il dominio P o V o ambedue sono responsabili dell’espressione della modulazione

dei sintomi, cloni chimerici infettivi di cDNA sono stati preparati in una metà di una variante in

sequenza, in cui approssimativamente metà della variante di una sequenza era unita attraverso il

dominio C con l'altra metà di un'altra variante (figura 8).

Figura 8 – Diagramma schematico di due parentali di Citrus excortis viroid (CEV) e di due viroidi

chimerici di forma circolare. Il parentale CEV-A(2) induce sintomi gravi in piantine di

pomodoro, mentre l’altro parentale, CEV-DE30(a), induce sintomi molto leggeri.

Due varianti delle sequenze sono state usate, una che induce gravi sintomi sulle piantine di

pomodoro ed un’altra che induce sintomi leggeri. I costrutti di cDNA sono stati convenientemente

preparati usando i siti BamHI e HindIII nel dominio C. I risultati di infettività indicano che il

dominio P determina sintomi di espressione, mentre il dominio V può avere un effetto sul livello del

viroide che sviluppa nelle piante infettate (Visvader et Symons, 1986). La sequenza dei viroidi

della progenie è stata la stessa di quella del clone usato per l’inoculazione. Tuttavia, i risultati non

danno informazioni sulle basi molecolari dell’induzione della risposta patogenica.

La periodicità di sequenze nei viroidi indica l’origine mediante duplicazione

Molti viroidi mostrano una periodicità strutturale caratterizzata da unità ripetute di 11 o 12

nucleotidi per il sottogruppo PSTV, 60 nucleotidi per ASSV e80 per ASBV (Juhasz et al., 1988).

Tabella 3 – Esempi di periodicità strutturali nei viroidia, b.

Viroidic Unità ripetute Consenso

________________________________________________________________________________

PSTV 12 CNGRRGRRAYCN (69-172 nt)

CCCV 12 CNGRRGRRAYCN (244-129 nt)

ASSV 60 Ripetuto 4,5 volte in 330 nt

ASBV 80 Ripetuto 3 volte in 247 nt

________________________________________________________________________________ a Dati da Juhasz et al., 1988. b R, purina /A o G); Y, pirimidina /C o U); N, nucleotide non conservato (A, C, G o U; nt, nucleotide. cLe abbreviazioni sono riportate in tabella 1.

12

Sebbene la sequenza delle ripetizioni è stata trovata approssimativamente per un terzo della

sequenza totale dei membri del sottogruppo di PSTV, la più lunga delle ripetizioni di ASSV e

ASBV occupa la completa lunghezza di ogni molecola (tabella 3).

Le periodicità della tabella 3 sembrano essere specifiche per i viroidi, da quando non furono trovati

altri piccoli RNA, come piccoli RNA nucleari, ed i virusoidi, in sequenza randomizzata generata

quando la stessa composizione di base come quella di alcuni viroidi fu usata (Juhasz et al., 1988).

Tuttavia, una cospicua periodicità non fu trovata per HSV o varianti delle sue sequenze, Cucumber

pale fruit viroid (CPFV), ambedue membri del sottogruppo PSTV, che rimane un dilemma.

Juhasz et al. (1988), hanno suggerito che la periodicità osservata dei viroidi può giocare un ruolo

nell’interazione dell'RNA del viroide simile al DNA con le proteine, da quando una delle

caratteristiche della capacità di legare le proteine del DNA è di una periodicità strutturale (Travers,

1987).

Una possibilità aggiuntiva è quella che questa periodicità strutturale di molti viroidi riflette la loro

origine evoluzionaria per cui la duplicazione della sequenza successiva alla mutazione permette un

aumento della dimensione e lo sviluppo di molecole infettive (Diener, 1989). Un bell’esempio di

come la duplicazione parziale della molecola del viroide è osservabile durante l’infezione delle noci

di cocco da Coconut cadang-cadang viroid (CCCV). I 246 nucleotidi del viroide appaiono presto

infetti ma, come i sintomi appaiono, nuove molecole di elevato peso molecolare insorgono ed

eventualmente dominano la popolazione del viroide, come il progresso della malattia (Imperial et

al., 1981; Mohamed et al., 1982). La duplicazione dell’intero dominio avviene ed inizia a tre

separati siti entro il dominio V per dare delle sequenze aggiuntive di 41, 50, 55 o 2x50 nucleotidi

(figura 9; Haseloff et al., 1982; Keese et Symons, 1987; Keese et al., 1988).

Figura 9 – Duplicazioni parziali delle sequenze in Coconut cagang-cadand (CCCV). Le due

sequenze con un totale di 41, 50, 55, o 2x50 nucleotidi sono duclicate come indicato.

Le frecce che puntano alla destra indicano i confini delle sequenze X ed Y, mentre i

cerchi pieni le sequenze duplicate dei confini. I nucleotidi circolari sono i siti di

mutazione nelle varianti delle sequenze (Keese et al. (1988).

13

Le implicazioni funzionali dello sviluppo di queste più elevate forme di CCCV, durante la

progressione della malattia non sono conosciute. Ovviamente, esse possono dar luogo ad alcuni

vantaggi della replicazione, per esempio, dando luogo ad un incremento della competizione

mediante il legame di queste sequenze ripetute di alcuni componenti dell’ospite, importanti per la

replicazione, ma che sono in limitata disponibilità (Keese et al., 1988). È stato suggerito che questa

duplicazione del dominio T2 avviene con una trascrizione discontinua mediante una polimerasi

dell’RNA, accendendo o saltando da un modello ad un altro (Keese et Symons, 1985), un modello

analogo a quello proposto per la generazione dell’interferenza difettiva degli RNA del virus

dell’influenza (Jenning et al., 1983). Presumibilmente, la duplicazione della sequenza in altri

membri del gruppo PSTV dei viroidi potrebbe avere bisogno di una via similare per costruire

eventualmente la molecola di intera lunghezza.

Via di replicazione per i viroidi e virusoidi riscontrato nel meccanismo del rolling circle

È generalmente concordato che questi RNA circolari e covalentemente chiusi sono replicati

mediante un meccanismo circolare, come si può osservare in figura 10 (Branch et Robertson, 1984;

Symons, 1989), sebbene molti aspetti della loro replicazione non sono caratterizzati a livello

molecolare.

Figura 10- Modelli di rolling circle per la replicazione dei viroidi e virusoidi e del satellite RNA di

Tobacco ringspot virus. A: percorso dove i plus ed i minus RNA aderiscono. B: percorso

dove solo l’RNA plus aderisce. I siti di adesione sono indicati mediante frecce (Forster

et Symons,1987°).

In una delle due variazioni del meccanismo di rolling circle (figura 10A), l’infezione circolare dello

stesso meccanismo (figura 10A), è copiato continuamente mediante una non identificata RNA

dipendente da RNA, per formare un minus filamento concatamerico (step 1). Uno specifico

sfaldamento di questo filamento produce dei monomeri (step 2) che sono circolarizzati da una ligasi

dell’RNA dell’ospite e poi copiato mediante la stessa o una differente polimerasi (step 4). La

specifica scissione del lungo e lineare filamento positivo produce monomeri positivi (step 5) che

sono circolarizzati (step 6) per dare la progenie RNA. ASBV e vLTSV, molto probabilmente

seguono questo percorso (Hutchins et al., 1986; Forster et Symons, 1987a; 1987b).

Nelle altre variazioni (figura 10B), il filamento minus lineare (step 1) non è scisso ma copiato

direttamente per dare un filamento lineare positivo (step 3) che è scisso per fornire più monomeri e,

alla fine, progenie circolare. Molti viroidi e tre dei quattro virusoidi, più probabilmente, seguono

questo percorso (Branch et al., 1988; Hutchins et al., 1985; Davies et al., 1990).

Molti di questi sono senza risposta circa questi due relativi percorsi. Ci si chiede la polimerasi RNA

è coinvolta nella replicazione e quanto gli stessi enzimi copiano i due plus e minus filamenti. Nel

caso dei viroidi, l’enzima deve essere codificato dall’ospite, ma non ci sono evidenze dirette che

indicano se è l’RNA polimerasi I, II o III o alcune varianti del loro complesso multicomponente.

Nel caso dei virusoidi del satellite, è generalmente assunto che la polimerasi dell’helper che

14

codifica l’RNA, con o senza i componenti dell’ospite, è responsabile, ma non direttamente provano

la validità. La possibilità che un enzima derivato dall’ospite simile a quello richiesto per la

replicazione dei viroidi è necessario e non può essere respinto. Non ci sono informazioni per la

sequenza di specifici promotori sugli RNA circolari che definiscono il sito di iniziazione della

trascrizione.

I siti della sintesi dei viroidi e virusoidi nelle cellule sono anche sconosciuti. Nel caso di PSTV e

CEV, Riesner ed i suoi colleghi hanno chiaramente mostrato che il nucleolo è il maggior sito

dell’accumulo dei viroidi (Riesner, 1987; Harders et al., 1989), ma nessuno è noto circa l’attuale

sito di sintesi. Una comprensiva analisi mediante l’ibridazione in situ è necessaria per procurare più

dati definitivi su questi aspetti che interessano i viroidi ed i virusoidi.

Il meccanismo dello studio dei precursori dei viroidi del gruppo PSTV è ancora da risolvere Il maggior aspetto del meccanismo di rolling circle è l’elevata specifica reazione di scissione

richiesta per la produzione di monomeri da RNA concatamerico. Un’unica reazione di autoscissione

che è mediata dall’RNA, in assenza di proteine, e dimostrato in vitro, molto probabilmente funziona

in vivo per ASBV e per quattro virusoidi. Tuttavia, per tutti i viroidi del gruppo di PSTV, non

esistono dati definitivi e la risoluzione del meccanismo di studio rimane la maggiore sfida nel

campo dei viroidi.

Finora, tentativi di rilevare un evento non enzimatico per gli oligomerici di PSTV è stato mostrato

solo a livelli di attività molto bassi (Robertson et al., 1985) o negligibili (Tsagris et al., 1987a).

Tuttavia, Tsagris et al. (1987b) sembra avere ottenuto una ragionevole specifica scissione dei

precursori di PSTV e la produzione di monomeri circolari in bassa resa, quando precursori di unità

superiori alla lunghezza sono stati incubati con estratti di nuclei di piante. I risultati ottenuti

indicano che l’ottenimento in vivo dei precursori di PSTV richiede l’azione di specifici RNase per

dar luogo a monomeri che sono poi legati alla forma circolare. La possibilità che proteine negli

estratti nucleari possono avere un rapporto strutturale e che un ruolo catalitico nel processo di

lavorazione dell’RNA precursore non può essere eliminato.

I risultati non sono abbastanza semplici come sembra apparire in un primo momento, perché molti

RNase aderiscono alle regioni del singolo filamento per dare terminali di 5’-idroxil e 2’,3’-fosfato,

che sono quelli richiesti per l’accoppiamento di RNA di ligasi di RNA di piante (Branch et al.,

1982). Inoltre, dato che il precursore oligomerico RNA consistentemente piega in una o più

configurazioni, un RNase non specifico potrebbe intaccare le regioni esposte del singolo filamento

alle lunghezze approssimativamente monometriche, con la conseguente ligasi dell’RNA che si

accoppia della giusta posizione dei terminatori 5’ e 3’. Ovviamente molti più specifici dati sono

necessari per fornire ulteriore supporto per o contro una specifica scissione della nucleasi degli

RNA dei precursori.

Sembra fattibile che il meccanismo in vivo per i viroidi del gruppo di PSTV potrebbe rivelarsi

essere qualche tipo di auto-scissione. Già tre tipi di autoscissione sono stati identificati in soli 12

RNA di auto-scissione che sono stati finora caratterizzati; nove attraverso la reazione di martello,

una struttura differente e ancora da essere pienamente caratterizzata per i minus TRSV (Bruening et

al., 1988; Bruening, 1990). É principalmente fattibile che più tipi di autoscissione saranno trovati,

uno dei quali potrebbe spiegare l’attività dei precursori di tutti i membri del gruppo di PSTV.

La mutagenesi sito-diretta definisce un potenziale sito per l’attività di CEV I cloni del cDNA monomerico di PSTV e CEV sono infetti su piantine di pomodoro quando clonati

al sito di BamHI (figura 11 per CEV) in alcuni vettori di plasmidi o di fagi BamHI, come sono i

trascritti di RNA e dei monomeri escissi (Tabler et Sänger, 1984; Visvander et Symons, 1985).

Tuttavia, i cloni monomerici di cDNA preparati ad altri siti nella molecola del viroide, per esempio

gli altri siti della figura 11A, non sono infettivi a meno che non possano essere asportati come

monomeri con estremità appiccicose. Presumibilmente, i monomeri escissi sono legati ai circoli

monomerici in vivo per iniziare la trascrizione dell’arrotolamento dal DNA circolare.

15

Figura 11 – Sintesi dei dati che rappresentano il sito di scissione di Citrus excortis viroide (CEV) e

di altri viroidi del sottogruppo di Potato spindle tuber viroid (PSTV), durante la

replicazione del circolo di arrotolamento. A: siti della molecola di CEV usata per la

costruzione dei cloni di cDNA di completa lunghezza. B: siti di costruzione in vivo dei

trascritti di RNA derivati dai cloni dei due mutanti puntiformi di CEV; i nucleotidi

cerchiati rappresentano la mutazione dei punti introdotti a G97 per dare A97 o U97. Il

clone di tipo selvaggio di cDNA, così come l’inserto escisso erano infetti quando

inoculati su piantine di pomodoro. In contrasto, solo i cloni mutanti intatti erano infetti.

La sequenza ripetuta di 11 nucleotidi si correla con l’infettività ed i siti proposti alle

posizioni 1, 2 o 3 sono indicati. C: le sequenze palindromiche e le strutture che possono

formarsi ai siti 5’ e 3’ dei trascritti di RNA del mutante U97 del clone di cDNA. La

sequenza ripetuta dell’11 nucleotide è rappresentata in un riquadro. D: nucleotidi

conservati e strutture potenziali nel dominio centrale conservato di tutti i viroidi di

PSTV del sottogruppo B1. N è un nucleotide non conservato. La sequenza del

nucleotide 11 è rappresentata in un box ed il sito di lavorazione proposto sono indicati

mediante frecce. In Hop stunt viroid (HSV), un U è inserito nella posizione del cerchio

pieno. Questo U si potrebbe abbinare con un A che è rappresentato da N, lasciando una

C inappaiata contrassegnata con C. Le coppie di basi A:G potenziali sono legate

mediante linee spezzate. (Visvader et al., 1985).

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Per una rimarchevole coincidenza, l’infettività dei cloni intatti monometrici di cDNA è correlata

con la presenza di una sequenza 3’ di 11 nucleotidi al sito BamHI nella sequenza del viroide che è

ripetuta dopo il clonaggio del sito di BamHI nel vettore, come si può osservare nei tratti neri nella

figura 11B, la sequenza di tipo selvaggio contiene un G al sito del circolo A ed U (Tabler et Sänger,

1984; Visvander et Symons, 1986).

Dai cloni monomerici senza una sequenza ripetuta o con solo una ripetizione di sei nucleotidi non

infettivi, si può evincere che i trascritti di RNA si verificano con la sequenza di ripetizione del

nucleotide 11.

Il sito di mutagenesi diretto di G97 della sequenza di CEV a U o A (figura 11B) è risultato in un

clone di infezione, ma in un inserto non infettivo (Visvander et al., 1986).

La progenie del CEV infettivo dal clone infettivo mutato di cDNA è contenuto nella sequenza di

tipo selvaggio. Il risultato è stato spiegato mediante il processo in vivo dei trascritti di RNA,

generato in vitro o in vivo, ad uno dei tre collegamenti del fosfodiestere sul lato della mutazione

puntiforme (identificata come 1, 2 o 3 nella figura 11B). Esso è approssimativamente lo stesso sito

identificato da Tsgris et al. (1987b), come uno dei due possibili siti in PSTV, dai loro esperimenti

effettuati, usando estratti nucleari.

Dato che il processo si verifica ad uno dei tre siti proposti in CEV e che alcuni altri meccanismi non

sono operativi, poi una possibile struttura bidimensionale è possibile ed è data in figura 11C

(Riesner et al., 1979; Visvader et al., 1985; Diener, 1986).

I nucleotidi posti nei box sono il l1-nucleotide della figura 11B, mentre i sette nucleotidi

(CGAGCUC) sono vicini al terminatore 3’ e sono sequenze del vettore che provvede a fornire un

accoppiamento di base limitato.

L'elaborazione richiederebbe l’escissione dell’RNA monomerico mediante scissione a due posizioni

corrispondenti ai siti 1, 2 o 3 (indicati mediante frecce) ed il suo successivo legame enzimatico alla

forma circolare. Alternativamente, il meccanismo di escissione può direttamente produrre un

monomero circolare.

Durante la continua trascrizione a circolo rotolante di un modello meno circolare, l’analoga struttura

a quella di figura 11C è data nella figura 11D.

Tutti i nucleotidi sono derivati dal filamento superiore del dominio C (figura 4) e quelli mostrati

sono conservati in tutti i viroidi del sottogruppo PSTV.

È possibile che la doppia scissione considerata in figura 11C è sostituita da una più complessa

sequenza di eventi dei precursori oligomerici considerati nella figura 8D. Per esempio, se la

struttura palindromica (strutture alternative con appaiamento intracatena tra le basi) è l’attuale

struttura richiesta per la scissione, poi la scissione può solo verificarsi sul filamento superiore per

rilasciare un monomero lineare seguito dal riarrangiamento della struttura per piazzare il successivo

sito di scissione in una struttura attiva. In questo modo, là potrebbe essere il rilascio sequenziale dei

monomeri lineari.

Non c’è una reale evidenza per ognuno di questi modelli. Diener (1986) ha considerato modelli

analoghi a quelli della figura 11D, mentre Riesner (1990) ha descritto modelli strutturali con

ibridizzazione similare nella regione conservata centrale per un oligomero di circa quattro unità.

Nonostante i dati limitati, speculazione considerevole e due modelli dimensionali costruiti, non si

può davvero essere fiduciosi su nessun aspetto riguardante il lavoro sui precursori oligomerici dei

viroidi del gruppo di PSTV.

Reazione di autoscissione in ASBV e nei quattro virusoidi Quest’area è stata estensivamente revisionata di recente (Symons, 1989; 1990; Sheldon et al., 1990;

Forster et al., 1990; Davies et al., 1990) ed aspetto chiave è stato considerato.

Trascritti di RNA, più e meno, preparati da cloni di cDNA di ASBV e vLTSV si sono autoscissi, in

un alto specifico modo, durante la trascrizione e dopo l’isolamento, in completa assenza di proteina.

La reazione coinvolge un fosforil Mg2+ catalizzato in una reazione che scinde l’RNA per dare

terminali con 2’,3’ fosfato ciclico e un 5’ idroxil (figura 12).

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Figura 12 – Reazione di autoscissione che coinvolge una reazione di

fosforil trasferimento dal 5’-idrossil del residuo 3’

nucleotide al 2’-idrossil del residuo 5’. (Symons (1989).

Sulla base di specifici siti di scissione, una struttura conservata bidimensionale a martello è stata

sviluppata (figura 13) che potrebbe essere applicata all’autoscissione degli RNAdi plus e minus

ASBV, plus e minus vLTSV, plus Velvet tobacco mottle visusoid e plus vSCMoV, come pure un

plus sTRSV.

Figura 13 – Struttura di consenso a martello intorno al sito

di autoscissione (indicato da frecce) di

Avocado sunblotch viroid, i quattro virusoidi

ed il satellite positivo di RNA di Tobacco

ringspot virus (vLTSV, Lucerne transient

streak virusoid). I 13 nucleotidi conservati

sono racchiusi in box ed i nucleotidi non

conservati sono indicati con N.

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La struttura a martello di figura 13 consiste di tre steli accoppiati alla base (I, II e III intorno ad una

regione a singolo filamento aperto) con 13 nucleotidi (in box) che sono conservati in nove RNA

auto scissi identificati finora si scindono lungo questa struttura.

Sebbene l’evidenza definitiva è stata ottenuta, sembra probabile che la reazione di auto scissione,

caratterizzata in vitro, è anche responsabile per l’allestimento di precursori oligomerici in vivo. La

struttura del martello bidimensionale della figura 12 non spiega perché c’è una scissione non

enzimatica dell’RNA allo specifico sito. Si considera che, in presenza di MK2+, il martello assume

un’attiva struttura terziaria la quale abbassa l’energia di attivazione sufficientemente e

specificamente al legame dell’internucleotide del sito di auto scissione, per permettere il

trasferimento del fosforile della reazione di autoscissione. Quando spaccata, la struttura è

considerata rilassata e quindi prevenire la reazione inversa dal verificarsi, dal momento che nel

complesso la reazione è teoricamente reversibile.

Nel caso di ASBV e dei quattro virusoidi, le sequenze coinvolte nella reazione a martello

forniscono informazioni per un passaggio chiave nel ciclo di replicazione. Esse sono anche le sole

sequenze in questi patogeni a RNA, per cui si ha l’informazione che indica il loro ruolo funzionale.

Tuttavia, nel caso di ASBV, i siti di plus e minus auto-scissione sono 14 nucleotidi e le sequenze

delle due strutture a martello coinvolgono approssimativamente un terzo centrale della molecola

totale (Hutchins et al., 1986; Forster et al., 1987). Se questa parte della molecola di ASBV possiede

qualche altro ruolo funzionale, ciò è sconosciuto.

I siti di plus e minus auto-scissione di vLTSV sono solo sei nucleotidi e le sequenze che

compongono le strutture di plus e minus auto-scissione si sovrappongono e costituiscono la parte

destra per un terzo della molecola di vLTSV (Forster et Symons, 1987a; 1987b). Con riferimento ad

ASBV, non è noto se questa regione possiede qualche altra funzione ed altri dati di informazione

sul resto della molecola.

Solo i plus RNA degli altri tre virusoidi si autoscindono. Circa 60 nucleotidi sono richiesti per le

strutture a martello e queste sono derivate dal filamento superiore sul lato destro delle molecole

bastonciniformi (Keese et Symons, 1987; Davies et al., 1990). Prese insieme al filamento frontale,

parzialmente accoppiato alla base di ogni virusoide, il totale è circa un terzo di ogni molecola.

Nessuna altra informazione funzionale è nota per questi RNA, ad eccezione della specificità nella

relazione ai loro virus helper (Francki, 1985; 1987).

Elementi di struttura terziaria sono presenti nei viroidi e virusoidi

Sembra fattibile che nelle strutture a bastoncino dei viroidi e virusoidi, elementi aggiuntivi della

struttura terziaria si riscontrano nello stato nativo come durante i vari stadi della loro replicazione.

Come elementi strutturali potrebbero giocare un ruolo funzionale nel ciclo vitale di questi patogeni,

così come l’iniziazione degli effetti patogenici.

Un esempio di struttura terziaria locale in PSTV è il cross-linking covalente indotto da UV fra G98

e U260 nella regione altamente conservata del dominio C (figura 14; Branch et al., 1985).

Figura 14 – Diagramma schematico di siti cross-linked indotti da UV in HeLa

5SrRNA e Potato spindle tuber viroid (PSTV). Le frecce a due

punte indicano le posizioni dell’attacco covalente. (Branch et al.,

1985).

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Presumibilmente, questa regione del viroide è in uno stato di attivazione che permette uno specifico

ed efficiente cross-linking per verificare quando si verifica l’irradiazione con luce UV. Un simile

cross-linking è stato trovato nell’elica di cellula HeLa 5S RNA (figura 14) così come in un dominio

del RNA del simil-viroide di Hepatitis delta virus (Branch et al., 1989) e 7SL RNA, che è un

componente del segnale di riconoscimento della particella (Zwieb et Schüler, 1989).

Questo sito di cross-linking in HeLa 5S RNA è in una regione di molecola analoga a quella della

proteina TFIIIA del sito di legame su Xenopus 5S RNA e vicino al sito per la proteina ribosomale

L5, mentre 7SL RNA lega un numero specifico di proteine. Tuttavia, l’elemento sensibile di UV in

PSTV potrebbe formare un sito di legame per una o più proteine coinvolte nella replicazione e

trasporto (Branch et al., 1990).

Le numerose forme strutturali possibili in PSTV e relativi viroidi sono stati ben documentati da

Riesner e colleghi (Riesner, 1990), potrebbero provvedere per multiple opportunità in vivo nella

costituzione di precursori oligomerici di ASBV, dei quattro virusoidi e dei plus TRSV. Allo stesso

modo, l'elaborazione nel gruppo di PSTV di viroidi può essere caratterizzata come un’altra struttura

terziaria attivata.

Elementi putativi conservati di introni in viroidi e virusoidi più probabilmente non hanno

origini comuni ed RNA elaborazione Negli ultimi 10 anni, è diventato popolare speculare sulla possibilità che i viroidi e virusoidi

contengono elementi conservati di introni del I gruppo, il che indica una comune origine ed una

implicazione nel processo di formazione dei precursori multimerici durante la replicazione del ciclo

di arrotolamento (Diener, 1981; Dinter-Gottlieb, 1986; 1987). Caratteristiche che sono normalmente

assenti come i confronti di sequenza sono una critica analisi statistica della probabilità di osservare

omologie di sequenza parziale necessarie casualmente e la presenza di come le omologie di altri

RNA potrebbero essere considerati completamente estranei. Fa riflettere considerare che il

confronto della sequenza di PSTV con 25 sequenze generate a random dal computer delle stesse

dimensioni e composizione di base danno omologie di sequenza del 29,5∓4,2%.

Nel caso dei virusoidi, l’elaborazione dei precursori oligomerici molto probabilmente si verifica in

vivo tramite la reazione di autoscissione che coinvolge la struttura a martello, una reazione

caratterizzata in vivo (figura 13; Forster et Symons, 1987a; 1987b; Forster et al, 1987; Sheldon et

Symons, 1989; Davies et al., 1990). Come si può notare in Diener (1989), l’assenza di questi

elementi della sequenza del gruppo I-type nella struttura a martello annulla ogni considerazione che

essi giocano un ruolo nell’elaborazione dell’RNA in questi RNA patogenici. Come già considerato

sopra, se un simile gruppo di reazione di autoscissione è coinvolto nella costituzione dei precursori

dei viroidi del gruppo PSTV, poi questo provvede ad ulteriori evidenze contro ogni ruolo per questo

gruppo I delle relative sequenze simili ad un introne.

Dato che questa sequenza del gruppo I nei viroidi e nei virusoidi possiede alcuni ruoli funzionali è

fattibile che essi possono coinvolgere alcuni aspetti della struttura terziaria, come, ad esempio, un

percorso simile alla prolina che normalmente è coinvolta nelle pieghe delle molecole proteiche. La

comprensione del ruolo dei motivi delle varie sequenze nella struttura terziaria dell’RNA è in

aumento; un recente esempio potrebbe essere quello dei ruolo strutturali e funzionali giocati dai

pseudonodi (Plej, 1990)..

Bibliografia

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for systemic infection. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1820-1824.

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