Divisão de Biologia Médica Serviço de VirologiaAdenovírus) Anticorpos monoclonais (Flu-A, Flu-B,...

SimpSimpóósio Nacional de Vigilância:sio Nacional de Vigilância:Pneumococo e Influenza Pneumococo e Influenza

DiagnDiagnóósticostico Laboratorial das InfecLaboratorial das Infecçções Respiratões Respiratóórias Viraisrias Virais

Terezinha Maria de PaivaTerezinha Maria de Paiva

BM

BIOLOGIA MÉDICA

SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDECOORDENADORIA DE CONTROLE DE DOENÇAS

INSTITUTO ADOLFO LUTZ

SECRETARIA DE ESTADO DA SASECRETARIA DE ESTADO DA SAÚÚDEDECOORDENADORIA DE CONTROLE DE DOENCOORDENADORIA DE CONTROLE DE DOENÇÇASAS

INSTITUTO ADOLFO LUTZINSTITUTO ADOLFO LUTZ

Divisão de Biologia MDivisão de Biologia Méédica dica ServiServiçço de Virologiao de Virologia

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Infecções Respiratorias Agudas de Etiologia ViralInfecInfecçções ões RespiratoriasRespiratorias Agudas de Etiologia ViralAgudas de Etiologia Viral

Víírusrus NNºº subtipossubtipos Principais sPrincipais sííndromes clndromes clíínicas nicas

INFLUENZAINFLUENZA 33 Gripe, laringite, pneumonia, Gripe, laringite, pneumonia, laringotraqueobronquitelaringotraqueobronquitePARAINFLUENZAPARAINFLUENZA 44 Coriza, renite, Coriza, renite, rinofaringiterinofaringite, crupe , crupe CAXUMBACAXUMBA 11 DoenDoençça respirata respiratóória aguda indiferenciada, parotiditeria aguda indiferenciada, parotiditeSARAMPOSARAMPO 11 Broncopneumonia, Broncopneumonia, laringotraquelaringotraqueíítete, laringite , laringite RESPIRATRESPIRATÓÓRIORIOSINCICIALSINCICIAL

22 Bronquite, Bronquite, broncopneumonitebroncopneumonite intersticial intersticial

ADENOADENO 5252 DoenDoençça respirata respiratóória aguda indiferenciada, febre, ria aguda indiferenciada, febre, farfarííngongoconjuntivalconjuntival, pneumonia, faringite, conjuntivite, pneumonia, faringite, conjuntivite

RINOVRINOVÍÍRUSRUS >>100100 Resfriado comum, bronquite, faringite, broncopneumoniaResfriado comum, bronquite, faringite, broncopneumoniaCOXSACKIECOXSACKIE 22 Faringite, Faringite, herpanginaherpangina, amigdalite, amigdaliteECHOECHO 3333 DoenDoençça respirata respiratóória aguda indiferenciada, coriza, pneumoniaria aguda indiferenciada, coriza, pneumonia

infantil, faringiteinfantil, faringitePÓÓLIOLIO 33 AmigdalofaringiteAmigdalofaringiteCORONACORONA 33 Resfriado, DoenResfriado, Doençça respirata respiratóória aguda indiferenciada,ria aguda indiferenciada,HERPES SIMPLESHERPES SIMPLES 22 AmigdalofaringiteAmigdalofaringite com vescom vesíículas e culas e úúlceraslcerasCITOMCITOMÉÉGALOGALO 11 Faringite e tonsilite infantil (mononucleose)Faringite e tonsilite infantil (mononucleose)



VÍRUS RESPIRATÓRIOS DE MAIOR IMPORTÂNCIA EM SAÚDE PUBLICAVVÍÍRUS RESPIRATRUS RESPIRATÓÓRIOS DE MAIOR RIOS DE MAIOR IMPORTÂNCIA EM SAIMPORTÂNCIA EM SAÚÚDE PUBLICADE PUBLICA

l Influenza

l Vírus respiratório sincicial (VRS)

l Parainfluenza

l Adenovírus

ll InfluenzaInfluenza

ll VVíírus respiratrus respiratóório sincicial (VRS)rio sincicial (VRS)

ll ParainfluenzaParainfluenza

ll AdenovAdenovíírusrus



Rota de Rota de infecinfecççãoão



IALIAL

EQUIPE RESPONSÁVEL PELA COLETAEQUIPE RESPONSEQUIPE RESPONSÁÁVEL PELA COLETAVEL PELA COLETA

l Receber educação e treinamento adequados, quanto a coleta de amostras biológicas

l Utilização de EPIs universais (aventais descartáveis, máscaras, luvas, óculos de proteção)

l Descarte apropriado

ll Receber educaReceber educaçção e treinamento adequados, ão e treinamento adequados, quanto a coleta de amostras biolquanto a coleta de amostras biolóógicasgicas

ll UtilizaUtilizaçção de ão de EPIsEPIs universais (aventais universais (aventais descartdescartááveis, mveis, mááscaras, luvas, scaras, luvas, óóculos de culos de proteproteçção)ão)

ll Descarte apropriadoDescarte apropriado



IALIAL

FATORES IMPORTANTES PARA O SUCESSO DA INVESTIGAÇÃO

FATORES IMPORTANTES PARA O FATORES IMPORTANTES PARA O SUCESSO DA INVESTIGASUCESSO DA INVESTIGAÇÇÃOÃO

l Escolha da amostra e seu transporte adequado ao laboratório possibilitarão medidas de controle imediatas e medidas de prevenção ao longo do tempo

l Essa meta será obtida pela investigação epidemiológica acurada e os dados do laboratório

ll Escolha da amostra e seu transporte Escolha da amostra e seu transporte adequado ao laboratadequado ao laboratóório possibilitarão rio possibilitarão medidas de controle imediatas e medidas de medidas de controle imediatas e medidas de prevenprevençção ao longo do tempoão ao longo do tempo

ll Essa meta serEssa meta seráá obtida pela investigaobtida pela investigaçção ão epidemiolepidemiolóógica acurada e os dados do gica acurada e os dados do laboratlaboratóóriorio



Procedimentos de ColetaProcedimentos de Coleta

AspiradoAspirado de nasofaringede nasofaringe

SwabSwab de nasofaringede nasofaringe SwabSwab de orofaringede orofaringe



Aspirado da nasofaringe Aspirado da nasofaringe -- ANSANS



l *Aspirado da nasofaringe (não congelar)l Swab nasall Swab da orofaringel Swab combinadol Lavado da orofaringe (gargarejo)*l Aspirado traqueall Lavado broncoalveolar

ll *Aspirado da nasofaringe (não congelar)*Aspirado da nasofaringe (não congelar)ll SwabSwab nasalnasalll SwabSwab da orofaringeda orofaringell SwabSwab combinadocombinadoll Lavado da orofaringe (gargarejo)*Lavado da orofaringe (gargarejo)*ll Aspirado traquealAspirado traquealll Lavado Lavado broncoalveolarbroncoalveolar

AMOSTRAS BIOLÓGICASAMOSTRAS BIOLAMOSTRAS BIOLÓÓGICASGICAS




l Sangue, amostras pareadas, fase aguda (primeira amostra) e convalescente (segundaamostra)

l Adulto de 5 a 10 mL de sangue total

l Crianças de 2 a 5 mL de sangue total

ØO sangue total deverá ser transportado àtemperatura ambiente

ll Sangue, amostras pareadas, fase aguda Sangue, amostras pareadas, fase aguda ((primeira amostraprimeira amostra) e convalescente () e convalescente (segundasegundaamostraamostra) )

ll Adulto de 5 a 10 mL de sangue totalAdulto de 5 a 10 mL de sangue total

ll CrianCriançças de 2 a 5 mL de sangue totalas de 2 a 5 mL de sangue total

ØØ O sangue total deverO sangue total deveráá ser transportado ser transportado ààtemperatura ambientetemperatura ambiente



IALIAL

ACONDICIONAMENTO DAS AMOSTRASACONDICIONAMENTO DAS AMOSTRASACONDICIONAMENTO DAS AMOSTRAS

l Frascos apropriados de polipropileno com tampa de rosca

l Meio de transporte adequadol Temperatura adequada*l Gelo secol Nitrogênio líquido

ll Frascos apropriados de polipropileno com Frascos apropriados de polipropileno com tampa de roscatampa de rosca

ll Meio de transporte adequadoMeio de transporte adequadoll Temperatura adequada*Temperatura adequada*ll Gelo secoGelo secoll Nitrogênio lNitrogênio lííquidoquido

Intercâmbio de informaIntercâmbio de informaçções ões constante com o laboratconstante com o laboratóóriorio



IALIAL


l Caldo comum volume de 3 mLl Soro fisiológico estéril volume de 3 mLØPara acondicionamento dos swabs (combinado)ØLavado da orofaringeØ *Aspirado da nasofaringeØTransporte para o lab. em banho de gelo, gelo seco ou

nitrogênio líquidoØ ** Tempo

l Cuidado na identificação da amostral Observar as normas nacionais e internacionais da IATAl Rastrear o envio da amostra desde o ponto de origem

até a chegada ao laboratório

ll Caldo comum volume de 3 mLCaldo comum volume de 3 mLll Soro fisiolSoro fisiolóógico estgico estééril volume de 3 ril volume de 3 mLmLØØPara acondicionamento dos swabs (combinado)Para acondicionamento dos swabs (combinado)ØØ Lavado da orofaringeLavado da orofaringeØØ *Aspirado da nasofaringe*Aspirado da nasofaringeØØ Transporte para o Transporte para o lablab. em banho de gelo, gelo seco ou . em banho de gelo, gelo seco ou

nitrogênio lnitrogênio lííquidoquidoØØ ** Tempo** Tempo

ll Cuidado na identificaCuidado na identificaçção da amostraão da amostrall Observar as normas nacionais e internacionais da IATAObservar as normas nacionais e internacionais da IATAll Rastrear o envio da amostra desde o ponto de origem Rastrear o envio da amostra desde o ponto de origem

atatéé a chegada ao laborata chegada ao laboratóóriorio



TRANSPORTE DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS

TRANSPORTE DAS AMOSTRAS TRANSPORTE DAS AMOSTRAS BIOLBIOLÓÓGICASGICAS

l Cuidado na identificação da amostra

l Observar as normas nacionais e internacionais da IATA

l Rastrear o envio da amostra desde o ponto de origem até a chegada ao laboratório

ll Cuidado na identificaCuidado na identificaçção da amostraão da amostra

ll Observar as normas nacionais e Observar as normas nacionais e internacionais da IATAinternacionais da IATA

ll Rastrear o envio da amostra desde o ponto Rastrear o envio da amostra desde o ponto de origem atde origem atéé a chegada ao laborata chegada ao laboratóóriorio



Transporte das Amostras Biológicas

O transporte das

amostras ao

laboratório, deve

ser realizado no

mesmo dia da

coleta em isopor

com gelox



IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETATESTE RÁPIDO

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETAIMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETATESTE RTESTE RÁÁPIDOPIDO

Secreção respiratóriaSecreção respiratória

Conjugado marcado com fluoresceínaConjugado marcado com fluoresceína

Anticorpos monoclonais (Flu-A, Flu-B, PF1, PF2, PF3, VRS e Adenovírus

Anticorpos monoclonais (Flu-A, Flu-B, PF1, PF2, PF3, VRS e Adenovírus

COLETA DO ASPIRADO NASOFARINGEO

COLETA DO ASPIRADO COLETA DO ASPIRADO NASOFARINGEONASOFARINGEO

Amostra não congeladaAmostra não congeladaAmostra não congelada



IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS POR IMUNOFLOURESCÊNCIA INDIRETA

IDENTIFICAIDENTIFICAÇÇÃO DE VÃO DE VÍÍRUS POR RUS POR IMUNOFLOURESCÊNCIA INDIRETAIMUNOFLOURESCÊNCIA INDIRETA

Cultura de cCultura de céélula normallula normal Cultura de cCultura de céélula infectadalula infectada



Transporte Aéreo de Amostras BiológicasAssociação Internacional de Transporte Aéreo “IATA”



TENTATIVA DE ISOLAMENTO EM CULTURAS DE CÉLULAS

TENTATIVA DE ISOLAMENTO EM TENTATIVA DE ISOLAMENTO EM CULTURAS DE CCULTURAS DE CÉÉLULASLULAS

Isolamento viralIsolamento viralIsolamento viral

Culturas celularesCulturas celularesCulturas celulares

HEp-2, Vero, MDCK, HEpHEp--2, 2, VeroVero, MDCK, , MDCK,

Leituras diáriasEfeito citopático (ECP)

Leituras diLeituras diááriasriasEfeito Efeito citopcitopááticotico (ECP)(ECP)

Presença de ECP

PresenPresençça a de ECPde ECP

Segunda passagem em tubos

Segunda passagem Segunda passagem em tubosem tubos

Anticorpos monoclonais (Flu-A, Flu-B, PF1, PF2, PF3, VRS e

Adenovírus)

Anticorpos Anticorpos monoclonaismonoclonais ((FluFlu--AA, , FluFlu--B, PF1, PF2, PF3, VRS e B, PF1, PF2, PF3, VRS e

AdenovAdenovíírusrus))

Identificação do agente etiológicoIdentificaIdentificaçção do ão do

agente etiolagente etiolóógicogico

Ausência do ECP

Ausência Ausência do ECPdo ECP

Segunda passagemSegunda Segunda

passagempassagem

Leituras diárias

Leituras Leituras didiááriasrias

Ausência do ECP

Ausência Ausência do ECPdo ECP

Terceira passagemTerceira Terceira

passagempassagem

ImunofluorescênciaIndireta (pool respiratório)

ImunofluorescênciaImunofluorescênciaIndireta Indireta (pool respirat(pool respiratóório)rio)

HEp-2HEpHEp--22 VeroVeroVero MDCKMDCKMDCK

IFIIFIIFI



Alterações morfológicas decorrentes de replicação viral –sincícios - .Vírus Respiratório Sincicial; Vírus da Parainfluenza



OVOS EMBRIONADOS DE GALINHAOVOS EMBRIONADOS DE GALINHAOVOS EMBRIONADOS DE GALINHA

InoculaInoculaçção Membrana ão Membrana corioalantcorioalantóóideide

AlbuminaAlbumina

22Cavidade Cavidade AlantAlantóóicaica

33MembranaMembranaCCóórioalantrioalantóóideideCascaCasca

Câmara de ArCâmara de Ar

11Cavidade AmniCavidade Amnióóticatica

InoculaInoculaçção Cavidade ão Cavidade AlantAlantóóicaica

Saco Saco VitelVitelííniconico



IDENTIFICAÇÃO DO ISOLADO - INFLUENZAIDENTIFICAIDENTIFICAÇÇÃO DO ISOLADO ÃO DO ISOLADO -- INFLUENZAINFLUENZACultura de células (MDCK)Cultura de cCultura de céélulas (MDCK)lulas (MDCK)

Teste de hemadsorçãoTeste de Teste de hemadsorhemadsorççãoão

Tipagem (A e B)TipagemTipagem (A e B)(A e B)Imunofluorescência indiretaImunofluorescência indiretaImunofluorescência indireta

Subtipagem (H1 e H3)SubtipagemSubtipagem (H1 e H3)(H1 e H3)Inibição da hemaglutinaçãoSoros imune específicos (OMS)InibiInibiçção da hemaglutinaão da hemaglutinaççãoãoSoros imune especSoros imune especííficos (OMS)ficos (OMS)

CDC AtlantaCDC AtlantaCDC Atlanta

Organização Mundial de SaúdeOrganizaOrganizaçção Mundial de Saão Mundial de Saúúdede

Ovos embrionadosOvos embrionadosOvos embrionados

Teste de hemaglutinaçãoTeste de hemaglutinaTeste de hemaglutinaççãoão

Subtipagem (H1 e H3)SubtipagemSubtipagem (H1 e H3)(H1 e H3)Inibição da hemaglutinaçãoSoros imune específicos (OMS)InibiInibiçção da hemaglutinaão da hemaglutinaççãoãoSoros imune especSoros imune especííficos (OMS)ficos (OMS)

CDC AtlantaCDC AtlantaCDC Atlanta

Organização Mundial de SaúdeOrganizaOrganizaçção Mundial de Saão Mundial de Saúúdede



Vírus da InfluenzaMicroscopia eletrônica

VVíírus da Influenzarus da InfluenzaMicroscopia eletrônicaMicroscopia eletrônica



Identificação de um novo subtipo viralIdentificaIdentificaçção de um novo subtipo viralão de um novo subtipo viral

l RT – PCR

l PCR em Tempo Real

Ø Primers Universal A e BØ Subtipos H1, H3, H5, H7, H9

ll RT RT –– PCRPCR

ll PCR em Tempo RealPCR em Tempo Real

ØØ PrimersPrimers Universal A e BUniversal A e BØØ Subtipos H1, H3, H5, H7, H9Subtipos H1, H3, H5, H7, H9



Primers A H3 H1 A H3 A H3 B B B B B A

AmostrasAmostras A B C D E A B C D E F G H H2OF G H H2OPaiva, TM; Santos, CLS Paiva, TM; Santos, CLS etet al (em publicaal (em publicaçção) Servião) Serviçço de Virologia, IALo de Virologia, IAL



199619962%2%5%5%

25%25%

3%3%16%16%

28%28%

21%21%

19971997 18%18%

45%45%

37%37%

199819982%2% 0%0%

81%81%

17%17%

19991999 7%7%

79%79%

14%14%

2000200044%44%

9%9%25%25%

1%1%

14%14%6%6% 1%1%

A/Texas/36/91 (H1N1)A/Texas/36/91 (H1N1)A/A/BayernBayern/07/95 (H1N1)/07/95 (H1N1)A/Taiwan/01/86 (H1N1)A/Taiwan/01/86 (H1N1)A/New A/New CaledoniaCaledonia/20/99 (H1N1)/20/99 (H1N1)A/A/JohannesburgJohannesburg/82/99 (H1N1)/82/99 (H1N1)A/Alaska/10/95 (H3N2)A/Alaska/10/95 (H3N2)A/A/JohannesburgJohannesburg/33/94 (H3N2)/33/94 (H3N2)

A/A/WuhanWuhan/35/95 (H3N2)/35/95 (H3N2)A/Sydney/05/97 (H3N2)A/Sydney/05/97 (H3N2)A/Moscou/10/99 (H3N2)A/Moscou/10/99 (H3N2)A/A/PanamaPanama/2007/99 (H3N2)/2007/99 (H3N2)B/B/BeijingBeijing/184/93/184/93B/B/SichuanSichuan/379/99/379/99

VVíírus da rus da influenza influenza

isolados e isolados e caracterizados caracterizados no perno perííodo de odo de

19961996--2000.2000.

IAL IAL -- SPSP



0

10

20

30

40

50

60

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meses do ano

NEG

Pf

VRS

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VIB

VIA

DiagnDiagnóóstico rstico ráápido pelo teste de IFI, durante 2000 pido pelo teste de IFI, durante 2000 -- 20012001



Investigação do Agente EtiológicoInvestigaInvestigaçção do Agente Etiolão do Agente Etiolóógicogico

Metodologias DiagnósticasMetodologias DiagnMetodologias Diagnóósticassticas

Amostra biológicaAmostra biolAmostra biolóógicagica

Microscopia eletrônica (ME)

(coloração negativa)

Microscopia Microscopia eletrônica (ME) eletrônica (ME)

(colora(coloraçção negativa)ão negativa)

PCRPCRPCR Imunofluorescênciaindireta (IFI)

ImunofluorescênciaImunofluorescênciaindireta (IFI)indireta (IFI)

Tentativa de isolamento viral

(IV)Culturas celulares

e ovos embrionados

Tentativa de Tentativa de isolamento viral isolamento viral

(IV)(IV)Culturas celularesCulturas celulares

e ovos e ovos embrionadosembrionados

SorologiaSorologiaSorologia



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