Diagnostica micologica: galattomannano e...

Diagnostica micologica: galattomannano e ß-D-glucano

Dr.ssa Lo Cascio GiulianaDipartimento di Patologia, Sezione di Microbiologia, Facoltà di

Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Verona

Servizio di Microbiologia, Ospedale G. B. Rossi, Azienda

Ospedaliera Universitaria Integrata di Verona

AZIENDA OSPEDALIERAISTITUTI OSPITALIERI DI VERONA

XXIII Corso di antibioticoterapiaVerona 21-23 Ottobre 2010

Verona 21 Ottobre 2010

Mortality rate of Invasive Fungal Infection

• Significant decrease in mortality• IA- Probability of survival of HCT at

90 days between 2002-2004 45% vs 22% preceding years (Upton, CID 2007)

• IA- case-fatality rate 58%, 86% in BMTR , 88% CNS (Lin, CID 2001)


Pfaller MA. Cl. Microb. Rev. 2007

Verona 21 Ottobre 2010(Upton, CID 2007)


Contributors…..

• 2002 Voriconazole for IA

• High Resolution CT

• Non-invasive testing for calculating fungal cell wall component• Galactomannan

• (1-3) β- D- glucans


Non-Culture Based Diagnosis of Invasive Fungal Infections/Aspergillosis

• Galactomannan/Mannan• Sandwich ELISA (Platelia)

• PCR• TaqMan, LightCycler PCR• 18s ribosomal DNA• Multi-copy or single target genes

• ß-D-glucan• Amebocyte Limulus lysate• Chromogenic (Fungitell)• Kinetic (Wako)


Possibilità di rivelare DNA di singole specie o generi

(Candida, Aspergillus, Cryptococcus, ecc)

Elevata sensibilità (fino a 10 fg di DNA fungino

purificato); necessità di 1-10 cellule fungine per ml di

sangue

Possibilità di rivelare un ampio range di patogeni fungini

(pan-fungal) con successiva identificazione a livello di

specie

Caratteristiche dei saggi PCR per la rivelazionedi DNA fungino


Peculiarità della “real-time” PCR

• Permette la determinazione della “fungal

load” attraverso la simultanea amplificazione

e quantificazione del DNA fungino circolante

• Trattandosi di un sistema chiuso, riduce

drasticamente il rischio di risultati falsi-

positivi. Ciò è di notevole importanza per un

laboratorio di routine


Real-time PCR methods for fungi

From: Espy et al., CMR, modified, 2006


• 130 haematology patients

• Itraconazole prophylaxis for AML and HSCT

• Fluconazole prophylaxis for others (ALL, lymphoma etc)

• EORTC/MSG criteria applied

• 2x weekly sampling


Design Sens (%) Spec (%) Ref

Pan-fungal 100 98 JCM 1997;35:1353-60

Pan-fungal 75 96 BJH 2001;113:180-4

Asp. sp. 100 65 JID 2000;181:1713-9

Asp. sp. 91.7 81.3 CID 2001;33:428-35

Asp. sp. 79 92 CID 2001;33:1504-12

Asp. sp. 64 64 BJH 2004;125:196-202

PCR for Invasive Moulds

PCR not (yet) accepted for mycological EORTC criteria

•Variable sensitivity / specificity•Limited per test positivity•Technical false positives/negatives•Lack of standardized targets/reagents•Not externally validated

Galattomannano


• In realtà viene evidenziata la presenza di molecole che contengono “galattofuranosil”;

• il polisaccaride della parete cellulare degli aspergilli –galattomannano- ne contiene varie copie;

• Esso viene rilasciato nel torrente circolatorio durante la crescita delle ife fungine nei tessuti.

Ricerca galattomannano


Platelia® Aspergillus EIA


5

604

155

51 336 7 3 1 1 0 0 0 0 0 0

0

100

200

300

400

500

600

700

0-0

,1

0,1

-0,2

0,2

-0,3

0,3

-0,4

0,4

-0,5

0,5

-0,6

0,6

-0,7

0,7

-0,8

0,8

-0,9

0,9

-1,0

1,0

-1,1

1,1

-1,2

1,2

-1,3

1,3

-1,4

1,4

-1,5

>1,5

Index

Nu

mb

er

of

sera

2%

Maertens et al. Br J Haematol 2004

Distribuzione dei valori di serum index nella popolazione di controllo


Sensitivity and specificity of the Platelia Aspergillus EIA according to selected cutoff optical density (OD) indices and

EORTC classification of episodes of invasive aspergillosis

Da: Maertens et al. CID, 2007


Impact of modified ELISA cutoff values in adult non-allogeneic transplants

Cutoff

1.5 1.0 0.5

Sensitivity

Definite IA (n=26) 57.7 61.5 73.1

Probable IA (n=61) 16.4 26.2 44.3

Possible IA (n=47) 21.3 31.9 44.7

All cases (n=134) 26.1 35.1 50.0

Specificity 99.4 98.5 93.9

PPV 92.1 87.0 69.8

NPV 82.7 84.4 87.0

Clinical efficiency 83.3 83.8 84.3

Herbrecht et al. J Clin Oncol2002;20:1998


Platelia™ Aspergillus: una meta-analisi

Da: Pfeiffer et al. CID, 2006


• La sensibilità del saggio si riduce in corso di trattamento antifungino1

– Risultati discordanti in letteratura

• Possibilità di falsi positivi

– Antibiotici β-lattamici contenenti GM (o di antigeni cross-reattivi)2

– Traslocazione attraverso la mucosa intestinale di GM (o di antigeni cross-reattivi)

• Altre infezioni

– Istoplasmosi3

Problematiche nella rivelazione del GM

1 Marr et al., CID 20052 Machetti and Viscoli, AAC 20053 Wheat et al., ICAAC 2006


Utility of Galactomannan Detection in BAL Samples

# pt

160

Sens

(%)

Spec

(%)

PPV

(%)

NPV

(%)

Serum 47 93 73 82

BAL 85 100 100 88

GM detection in CT-based BAL fluid has a high PPVfor diagnosing invasive pulmonary aspergillosis early in

untreated patients

Becker et al. Br J Haematol 2003; 121: 448


• 13/17 (76%) in pazienti con leucemia acuta e anormalità alla CT

• 17/17 (100%) in pazienti neutropenici prima della terapia antifungina, 0% dopo il 3° giorno di terapia

• 20/20 (100%) in pazienti oncoematologici con IPA

• 37/49 (76%) in HSCT e pazienti oncoematologici con IPA

• 6 di 11 (55%) in pazienti immunocompromessi (8 di 11 erano positivi in PCR)

• 5/20 (25%) in pazienti con sospetta IFI

Antigene di Aspergillus nel BAL

Becker, Br J Haem 2003; Sanguinetti, JCM 2003; Musher, JCM 2004


• 359 Pazienti, 63% non neutropenici

• COF ≥ 0,5: sensibilità 64%• Il 77% dei pz con IPA in

terapia almeno da 5 gg pre BAL

• PIP/TZ e AMP possibile causa di falsi positivi anche nel BAL

J Infect 2010, doi:10.1016/j.jinf.2010.08.014


Factors Affecting Galactomannan Performance

• Biological factors

• Site of infection• Aspergillus species• Microenvironment

(nutrients, pH, etc)• Molecule structure of

released antigen• Underlying condition /

immune suppression• Exposure to antifungals• Renal clearance, hepatic

metabolism

Mennink-Kersten MA, et al, Lancet Infect Dis 2004;4:349-57

• Presence of antibodies

• Storage / preparation

Epidemiological factors

• Patient population

• Prevalence of infection/disease

• Sampling strategy

• Definitions (positive result [cut-off], positive patient)

Positive galactomannan inSerum/BAL/CSF

Accepted Mycological CriteriaIn EORTC


Pfeiffer (CID 2005) meta-analisi di 27 studi:

Sensibilità di 71%, Specificità 89%

Ma viene identificata una eterogeneitàdegli studi che avrebbe sottostimato la performance; in sottogruppi eterogenei il test sembra comportarsi meglio.

MA NON RISOLVE IL PROBLEMA!!!


Attimo di pausa……

…post-prandiale prima di


(1-3) β- D- glucans: which identities?

β- glucans are heterogeneous molecules

major carbohydrate fraction of cell walls of most fungi (except Cryptococcus and Zygomicetes), algae and plants…but also…

Mannanoproteine

ß(1,6)-glucano

ß(1,3)-glucano

Chitina

Doppio strato fosfolipidico

della membrana

ß(1,3) glucano sintetasi


Fungal cell

Mannoproteins

b-(1,6)-glucan

b-(1,3)-glucan

Chitin

Phospholipid bilayer

of cell membrane

Cell membrane and cell wall

Ergosterolb-(1,3)-glucan synthase

Squalene

Ergosterol

Synthesis

Pathway

DNA/RNA Synthesis


…in some bacterial species

• Osmoregulated periplasmic glucans occur in a wide variety of Gram-negative bacterial speciesExample:Pseudomonas aeruginosa contains• 1-2 β-D- glucans• 1-6 β-D- glucans• 1-3 β-D- glucans (?) (CID 2008,

Mennink-Kersten)

Alcaligenes faecalis and Streptococcus pneumoniae contain

1-3 β-D- glucans


Functions of β-glucans:

• β-glucans are known as "biological response modifiers" because of their ability to activate the immune system. Immunologists discovered that a receptor on the surface of innate immune cells called Complement Receptor 3 (CR3 or CD11b/CD18) is responsible for binding to beta-glucans, allowing the immune cells to recognize them as "non-self."

http://en.wikipedia.org/wiki/Macrophage-1_antigen



http://en.wikipedia.org/wiki/CD18


• 1-3, 1-6 β-glucans are consistently exposed on the surface of germ-tube and hyphal, but not yeast, Candida cells.

• β-glucans of Candida albicans cell wall causes the subversion of human monocyte differentiation into dendritic cells, contributing to general immunosuppression (Nisini R., J Leuk Biol, 2007)


• Enhanced extracellular matrix and beta-glucan synthesis during biofilm growth might prevent antifungals, such as azoles and polyenes, from reaching biofilm cells, limiting their toxicity on biofilms cells (Vedijappan G., d’Enfert C., AAC,2010)


History of (1-3)-β- glucan testing

• 1968 Levin and Bang developed an assay for bacterial endotoxin using Limulus polyphemus (American horseshoe crab)

• 1981 studing Tachypleus tridentatus (Japanese horseshoe crab) amebocyte lysate fractions, demonstared that BG triggered the Limulus test coagulation cascade via a separate proenzyme, Factor G.


*1985 Obayashi developed a chromogenic test based on the use of different fraction of amebocyte lysate fractions containing Factor G. It could be used for non-invasive testing for the diagnosis of invasive fungal diseases.

*1995 First validation of Japanese test (Obayashi, Lancet 1995)

*2004 FDA approvation of the American test using amebocyte lysate fractions of the American Horseshoe crab, Limulus polyphemus.

History of (1-3)-β- glucan testing


Schema of the test for the detection of b-(1-3)-D-glucans

• amebocyte lysate fractions containing Factor G is activated by b-(1-3)-D-glucans.

• It starts a clotting cascade, detected with chromogenic or turbidimetric methods.


Fungal spectrum of BG detection

• All species of Candida and Aspergillus

• Fusarium sp., Acremonium sp., Trichosporon sp., Saccharomyces cerevisiae, Scedosporium apiospermum and prolificans.

• Pneumocystis jiroveci

• No Cryptococcus neoformans

• No Zygomycetes


Βeta 1,3-D-Glucan testing – 4 kits

CE markedObayashi Clin Infect Dis 2008:46:1864


False positive BG results

• Haemodialysis using cellulose membranes• Albumin• Intravenous immune globulin• Use of cellulose depht filters for

intavenous administration• Gauze packing of serosal surfaces

(abdominal surgery)• Intravenous amoxicillin-clavulanic acid

(AZITROMICIN and PENTAMIDINE inhibit the BG assay)


BG diagnostic thresholds

• T. tridentatus: cutoff 11 pg/ml for single sample, ≥7 pg/ml two consecutive samples

• L. polyphemus: cutoff 80 pg/ml POSITIVE, < 60 pg/ml NEGATIVE, value between 60 and 79 pg/ml INDETERMINATE


Β 1,3-D-glucan testing performance

• 456 autopsies, 54 (11.8%) IFI

• 52% IFIs, leukaemia underlying disease, 65% received

antifungals prior to death

• Β-glucan testing within 2 weeks of death

• Sensitivity 85%, specificity 95% (60pg/mL cutoff)

• Concordance between blood culture and Β-glucan was

81%

Obayashi Clin Infect Dis 2008:46:1864


• 279 pazienti: 117 IFI, 122 a rischio IFI ma neg, 40 volontari.

• 117 con IFI: 70 proven and probable, 27 emoc +, 20 Pneumocystis +

• Sono state eseguite GM (galattomannano), M (mannani), BG (beta glucani)


Risultati

•279 pz, 77.8 sensibilità, 92.5 specificità


Our experience…PATIENTS

• The study has been

conducted between March

2009 and February 2010.

• 269 patients at risk of IFI

have been evaluated with

the detection of β-(1-3) D-

glucans and

galactomannan.

wardsN° patients

Ematology and Bone

Marrow Transpl.

214

(79.5%)

Intensive Care Unit 23 (8.5%)

Infectious disease 15 (5.5%)

Others 17 (6.5%)

tot. 269

(100%)


119 patients have been classified with EORTC/ IFICG (European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive

Fungal Infections Cooperative Group) criteria:

• 17 patients with PROVEN IFI

• 10 patients with PROBABLE

• 20 patients with POSSIBILE

• 72 patients NO IFI


• Have been analyzed 696 samples, each one for b-(1→3)-D-Glucan and Galactomannan

• Multiple samples were tested for most of the patients (min 2-max 27 samples)

• Interpretation of BG values was as follows:• <60 pg/ml negative• 60-79 pg/ml Indeterminate• >80 pg/ml, positive


Examples of different kinetic curve


Detection of GALACTOMANNANS

• All samples have been analyzed with

PLATELIA™ Aspergillus (Bio Rad)

• An index of ≥ 0.5 was considered positive.


PLATELIA™ Aspergillus


RESULTS


Valutation of agreement BG vs GM

Concordanza

(%)

Totale

(%)

Campioni

concordanti

GM+ BG+ 869.8

GM- BG- 61.8

Campioni

discordanti

GM+ BG- 3.826.4

GM- BG+ 22.6


Frequenza

%

Ricerca Galattomannano

Assente Dubbio Presente Totale

160

59.48

8

2.97

9

3.35

177

65.80

4

1.49

0

0

0

0

4

1.49

64

23.79

4

1.49

20

7.43

88

32.71

228

84.76

12

4.46

29

10.78

269

100

Chi- Square (χ2) = 0.0005

Ric

erca

β

-Glu

cano

Tota

leP

osi

tivo

Dubbio

Neg

ativ

o


BG and GM assay results for the diagnosis of IFI according EORTC criteria

best performance of BG vs GM

Caratteristiche

pazientiIFI

Provate

IFI

Probabili

IFI

PossibiliNo IFI

Totale

N° pazienti 17 10 20 72 119

N° pazienti

GM +

5

(29.4%)

5

(50%)

3

(15%)

7

(9.7%)20

N° pazienti

GM -12

(70.5%)

5

(50%)

17

(85%)65

(90.2%)

99

N° pazienti

BG +

15

(88.2%)

8

(80%)

14

(70%)

15

(20.8%)

52

N° pazienti

BG -

2

(11.7%)

2

(20%)6

(30%)

57

(79.1%)

67

Provata con l’isolamento di Candida spp, Aspergillus spp, Trichosporon e Scedosporium


Patients characteristics

accord. EORTC

Test Sensitivity

(%)

Specificity

(%)

Proven

GM 29 95

BG 88 95

GM+BG 94

Probable

GM 50 90

BG 80 90

GM+BG 90

Possible

GM 15

BG 70

GM+BG 70

No IFIGM 91

BG 80


Comparison of quantitative value of BG and GM

Beta glucano (pg/ml)

<6060-

80

80-

90

90-

150

150-

300>300 Totale

GM

presente

(>0.5)

23 4 1 8 18 31 85

GM

assente

(<0.5)

416 29 10 53 34 69 611

Totale 439 33 11 61 52 100 696

p < 0.0001


Andamento BG in osteomielite da Scedosporium apiospermum durante terapia

0

100

200

300

400

500

600

0 15 30 45 75 105 135

giorni dalla diagnosi

Co

nc

.BG

pg

/ml

Isolamento Scedosporium


Andamento BG in endocardite da Candida parapsilosis durante terapia con

CASPOFUNGINA

0

100

200

300

400

500

600

0 15 30 45

giorni

Co

nc

.BG

pg

/ml

Ripetuti isolamenti da emocoltura di Candida parapsilosis


Andamento BG in candidemia da Candida tropicalis in paziente cardiotrapiantato

0

100

200

300

400

500

600

0 7 15 22 30 40 50

giorni

Co

nc

.BG

pg

/ml


Andamento BG in pz leucemico terminale con unico isolamento diCandida tropicalis da broncoaspirato, infezione polmonare da

Pseudomonas aeruginosa!

0

100

200

300

400

500

600

0 7 15 21 30

giorni

Co

nc

.BG

pg

/ml


Possibili cross-positività??


Risultati colturali vs. BGRisultati emocolture/liquor

BETAGLU NEG POS TOT

DUBBIO 4 (0.7) 3 (0.6) 7 (1.3)

NEG 246 (47) 76 (14.5) 322 (61.4)

POS 134 (26) 61 (11.6) 195 (37.2)

TOT 384 (73.3) 140 (26.7) 524 (100)


Coltural yeast Results vs. BG

0

2

4

6

8

10

NEG POS

CRYPTO

CPA/SCN

CPA

CAND LUS

CAL


Bacterial positivity in BG +

0

10

20

30

40

NEG POS

isolati batterici nelle NO IFI (BG+)

SCN

PSE

PNE

G+

G-


Consideration on the BG assay

• BG are widely diffused in nature. All materials must be free of interfering glucan.

• The procedure of the test require attention on specimen handling to avoid contaminations.

• The procedure is completely manual, except for reading and interpretation of results.


Vantaggi:

• Incrementata diagnostica di IFI diverse da Aspergillosi e Candida

• Alto valore Predittivo Negativo

• Molto utile nelle Candidemie,

• In qualche caso può essere positivo anche in Cryptococcosi


Necessità di uso appropriato

• Utile in associazione con GM e Mannani per incrementare la sensibilità di IA e Candidemia

• Possibile cross positività con batteriemie da Pseudomonas aeruginosa, non nella nostra esperienza

• Può essere usato nella diagnosi di infezioni del SNC.

• Non bene conosciuta cinetica di wash-out, possibile positività prolungata (6 mesi nel fegato).


CONCLUSIONI…

Senza alcuna pretesa!!!!


• Il nostro studio ha evidenziato l’utilità del test per la ricerca di (1→3)-b-D-Glucano nella sierodiagnosi di un ampio numero d’infezioni fungine invasive, come aspergillosi e candidosi.

• La sua alta sensibilità e specificità lo rende un ottimo marker di screening d’infezioni fungine opportunistiche, utile soprattutto nella popolazione di pazienti a rischio, come quelli severamente immunocompromessi e quelli ricoverati in unità di terapia intensiva.


• In questo studio, il saggio per la ricerca di (1→3)-b-D-Glucano mostra una sensibilità notevolmente maggiore rispetto al test del Galattomannano, ed appare, come atteso, marcatamente superiore nella diagnosi di candidosi invasive

• Tuttavia, il b-Glucano è noto non essere un buon marker di Zygomicosi e Cryptococcosi, infezioni che, seppur rare, possono coinvolgere questi soggetti a rischio


• Un numero esiguo di pazienti mostra risultati positivi al test del Galattomannano e negativi al b-Glucano

• Per questo motivo l’utilizzazione combinata delle due tecniche risulta, a nostro parere, più vantaggiosa, in quanto permette l’incremento della sensibilità diagnostica e l’identificazione dei risultati falsi negativi in ciascun test


Grazie per l’attenzione

Diagnostica micologica: galattomannano e...

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