L’immunofenotipo leucocitario: L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnosticautilità diagnostica

Roberto CaporaleRoberto Caporale

Pistoia, 29 ottobre 2011Pistoia, 29 ottobre 2011

Bernard Shoor & Leonard Herzenberg at Stanford with one of the original BD Flow Cytometers

1974 - Becton & Dickson, using FACS technology, introduced 1st commercial Flow (FACS-1)

Sistema FACSCanto IISistema FACSCanto II

BD Biosciences

Microscopia CitometriaMicroscopia Citometria in fluorescenza in fluorescenza

Citometria a Flusso (CFM)Citometria a Flusso (CFM)

La CFM consente l’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse, misurandone le caratteristiche fisiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare che interseca una sorgente di eccitazione

FOCALIZZAZIONEFOCALIZZAZIONE IDRODINAMICAIDRODINAMICA

campionecampionesheath fluidsheath fluid

LASERLASER

Diffrazione:proporzionale alle dimensioni della cellula rilevata lungo l’asse della luce incidente 0°

Rifrazione & Riflessione:proporzionale alla granularità cellulare e alla complessità rilevate a 90° rispetto la luce incidente.

Generazione dei segnali di “scatter”Generazione dei segnali di “scatter”

SSCSSC

FSCFSC

GRANULOCITIGRANULOCITI

MONOCITIMONOCITI

LINFOCITILINFOCITI

La combinazione dei due tipi di segnali permette di ottenere un particolare diagramma

di dispersione denominato

CITOGRAMMA

nel quale si possono evidenziare fino a 5 o 6 differenti popolazioni cellulari, in base

alle sole caratteristiche fisiche

Sottopopolazioni leucocitarie in sangue perifericoSottopopolazioni leucocitarie in sangue periferico -Citogramma --Citogramma -

LINFOCITILINFOCITI

MONOCITI

LINFOCITI

MONOCITI

NEUTROFILI

LINFOCITI

MONOCITI

NEUTROFILI

EOSINOFILI

LINFOCITI

MONOCITI

NEUTROFILI

EOSINOFILI

BASOFILI

VOLUME VOLUME

COM

PLES

SITA

’ CO

MPL

ESSI

TA’

ImmunofenotipizzazioneImmunofenotipizzazione cellularecellulare- definizione -- definizione -

Insieme di metodi diretti al riconoscimento, alla quantificazione ed alla localizzazione di strutture cellulari per mezzo di reagenti immunologici (anticorpi monoclonali).

PubblicazioniPubblicazioni

Crescita delle applicazioni diagnostiche in citometria a flusso

1st

123328 references (2010)

• Esperienza dell’operatore

• Valutazione delle prestazioni e della stabilità della strumentazione

• Controlli di qualità (IQC, VEQ, EQAS)

Requisiti per una buona Requisiti per una buona analisi citometricaanalisi citometrica

Riproducibilità dei parametri di fluorescenzaRiproducibilità dei parametri di fluorescenza

Linfoma Follicolare - diagnosiLinfoma Follicolare - diagnosi

Linfoma Follicolare - MMRLinfoma Follicolare - MMR

LiquidiLiquidi::

•Sangue periferico•Aspirati Midollari•Leucaferesi•Liquor•Liquidi cavitari

SolidiSolidi::

•Linfonodi•Biopsie•Agoaspirati

Materiali idonei per indagini in CFMMateriali idonei per indagini in CFM

Regole per una corretta analisi citometrica Regole per una corretta analisi citometrica in onco-ematologiain onco-ematologia

• Quesito diagnostico (dialogo con i clinici)• Caratteristiche del campione da analizzare• Scelta di adeguate combinazioni di anticorpi monoclonali• Regolazione dello strumento e “compensazione” delle

fluorescenze• Strategie di “gating” per il riconoscimento delle popolazioni

cellulari da analizzare• Integrazione con i laboratori di morfologia, citogenetica e

biologia molecolare• Formulazione di una risposta adeguata e conclusiva

Metodo di studio in citometria Metodo di studio in citometria

• Valutazione delle normali componenti cellulari del sangue midollare

• Valutazione dello stadio maturativo di tali componenti

• Dimostrazione della presenza nel campione di cellule anormali

• Eventuale dimostrazione della loro clonalità

• Evidenziazione di fenotipi peculiari allo scopo di identificare una determinata entità nosografica e/o utili per lasciare una traccia in corso di follow-up (MMR)

Espressione del CD45 nei leucocitiEspressione del CD45 nei leucociti

Sangue Periferico vs Sangue MidollareSangue Periferico vs Sangue Midollare

Sangueperiferico

Sanguemidollare

Maturazione Mieloide: SIDE SCATTERMaturazione Mieloide: SIDE SCATTER

MATURAZIONE MIELOIDE:MATURAZIONE MIELOIDE: granulocitopoiesigranulocitopoiesistem cell Blasto

mieloidepromieloc

itaMielo cita granulo

cita

CD66c

CD13

CD11bCD11a

CD66bCD11c

CD16CD64

Meta mielocita

CD34

CD33

CD15

stem cell Blasto mieloide

promonocita

Mono cita

CD13CD33

CD14CD11b

CD36CD64

MATURAZIONE MIELOIDEMATURAZIONE MIELOIDEmonocitopoiesimonocitopoiesi

CD34

0

100

PROMIELO MIELO METAMIELO GRAN

CD11bCD11b

CD1CD100

CD1CD166

CD64CD64

CD1CD133

MATURAZIONE MIELOIDE:MATURAZIONE MIELOIDE: variabili di espressione variabili di espressione

Interpretazione suInterpretazione su CD66bCD66b//CD11bCD11b

BM normale Sindrome mielodisplastica+ mature

immatureimmature

blocco maturativoblocco maturativoblastiblasti

Maturazione MieloideMaturazione MieloideInterpretazione su Interpretazione su CD66bCD66b//CD11bCD11b

CD16 CD16

CD15CD64

CD10

CD13

CD11

bCD

11b

Maturazione mieloide in BM normaleMaturazione mieloide in BM normale

R4

CD16 CD16

CD15CD64

CD10

CD13

CD11

bCD

11b

Maturazione mieloide in BM con MDSMaturazione mieloide in BM con MDS

Maturazione mieloide in BM con MDSMaturazione mieloide in BM con MDS

Maturazione monocitaria in BM con Maturazione monocitaria in BM con LMMCLMMC

Mean values of bone marrow leucocyte Mean values of bone marrow leucocyte populationspopulations

A. Santagostino

Cell count 34.5 x 106 cell/ml (SD 28.0)Erythroid 10.8% (SD 5.7)Lymphocytes 12.4% (SD 5.9)

CD3 61.4% (SD 15.1) CD4 29.3% (SD 11.3)CD8 30.8% (SD 13.1) NK 11.2% (SD 9.2)CD19 18.9% (SD 14.0)CD19+10+ 43.10% (SD28.6) CD19+20+ 45% (SD28.9)

Monocytes (CD14) 3.2% (SD 1.5)CD34+ cells 0.9% (SD 0.7)Whole myeloid serie 72.2% (SD 8.7)

Immature/blast 3.6% (SD 2.1)Promyelocytes 12.3% (SD 6.3)Myelo and metamyelo 28.4% (SD 11.4)band and mature 48.9% (SD 15.5)Eosinophils 1.9% (SD 1.5)

Plasmacells 0.4% (SD 0.3)

CD16 FITCCD16 FITC//CD13 PECD13 PE//CD34 PerCP-Cy5.5CD34 PerCP-Cy5.5//CD11b PE-Cy7CD11b PE-Cy7//CD117 APCCD117 APC//CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7

NORMALENORMALE

MDSMDS

Maturazione Mieloide: SIDE SCATTERMaturazione Mieloide: SIDE SCATTER

Stetler-Stevenson, Blood 2001

• Hypogranulation of PMN 84%• CD11b/CD16 abnormal 70%• CD13/CD16 abnormal 78%• CD64+ granulocytes 66%• CD10- granulocytes 11%• CD45-dim blasts 53%• CD56+ granulocytes 21%• CD56+ monocytes 33%• My-cells expressing non-My Ags 38%

MDS ABNORMALITIES BY FCMMDS ABNORMALITIES BY FCM

CD16 FITCCD16 FITC//CD13 PECD13 PE//CD34 PerCP-Cy5.5CD34 PerCP-Cy5.5//CD11b PE-Cy7CD11b PE-Cy7//CD56 APCCD56 APC//CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7

CD19

nuclearenucleareTdT

CD22citoplasmaticocµ

CD10CD20

CD34

stem cell Cellula pre-pre B

Cellula pre B

Cellula B

citoplasmaticoCD79a

SmIg

PROFILO ANTIGENCOPROFILO ANTIGENCO Maturazione linfoide BMaturazione linfoide B

Maturazione linfoide BMaturazione linfoide BCD20 FITCCD20 FITC//CD10 PECD10 PE//CD34 PerCP-Cy5.5CD34 PerCP-Cy5.5//CD38 PE-Cy7CD38 PE-Cy7//CD19 APCCD19 APC//CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7

Intensità di espressione nelle M. Intensità di espressione nelle M. LinfoproliferativeLinfoproliferative

MCLMCL

CLLCLL

CD22 FITCCD22 FITC//CD200 PECD200 PE/ / CD19 PerCP-Cy5.5CD19 PerCP-Cy5.5 / / CD5 PE-Cy7CD5 PE-Cy7/ / CD23 APCCD23 APC / /CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7

MCLMCL

CLLCLL

Intensità di espressione nelle M. Intensità di espressione nelle M. LinfoproliferativeLinfoproliferativeKappa FITCKappa FITC//Lambda PELambda PE/ / CD20 PerCP-CD20 PerCP-

Cy5.5Cy5.5 / / CD38 PE-Cy7CD38 PE-Cy7/ / CD19 APCCD19 APC / /CD45 CD45 APC-Cy7APC-Cy7

Presenza o assenza di marcatori nelle Presenza o assenza di marcatori nelle M. LinfoproliferativeM. Linfoproliferative

MCLMCL CLLCLL

Espressione di ZAP-70 nelle CLLEspressione di ZAP-70 nelle CLL

VALUTAZIONE HCLVALUTAZIONE HCLCD103 FITCCD103 FITC//CD11c PECD11c PE/ / CD20 PerCP-CD20 PerCP-

Cy5.5Cy5.5 / / CD25 PE-Cy7CD25 PE-Cy7/ / CD19 APCCD19 APC / /CD45 CD45 APC-Cy7APC-Cy7

VALUTAZIONE T-LDGLVALUTAZIONE T-LDGLCD57 FITCCD57 FITC//CD5 PECD5 PE/ / CD3 PerCP-Cy5.5CD3 PerCP-Cy5.5 / /

HLA-DR PE-Cy7HLA-DR PE-Cy7/ / CD8 APCCD8 APC / /CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7

ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NKCD158a E CD158b SULLE CELLULE NK

pattern atteso in una popolazione pattern atteso in una popolazione policlonalepoliclonale

CD158a

CD158b

ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SU CELLULE KIR+CD158a E CD158b SU CELLULE KIR+

pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità

CD158a

CD158a CD158a

CD158a

CD158b

CD158b

CD158b

CD158b

pattern compatibili con l’ipotesi di clonalitàpattern compatibili con l’ipotesi di clonalità

ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK

pattern atteso in una popolazione policlonalepattern atteso in una popolazione policlonale

VALUTAZIONE PLASMACELLULEVALUTAZIONE PLASMACELLULE

CD19 CD138 CD38 CD56 FSC / SSC debole presente Brillante assente ↑↑ assente presente Ridotta presente ↑↑↑

PARAMETRI INDAGATI

plasmacellule normali

plasmacellule trasformate

IPOTESI DIAGNOSTICA

Immunofenotipo plasmacellule normali

Combinazione MoAb FITCFITC PEPE PerCP-Cy5.5PerCP-Cy5.5 PE-Cy7PE-Cy7 APCAPC APC-H7APC-H7 HV-450HV-450

1 CD138 CD117 CD20 CD38 CD56 CD45 CD19

Combinazione MoAb FITCFITC PEPE PerCP-Cy5.5PerCP-Cy5.5 PE-Cy7PE-Cy7 APCAPC APC-H7APC-H7 HV-450HV-450

1 CD138 CD117 CD20 CD38 CD56 CD45 CD19

Immunofenotipo plasmacellule trasformate

• CD19-CD56-• CD19-CD56+

Immunofenotipo plasmacellule trasformate

Plasma cells: normal vs clonal

Ocqueteau et al, AJP 152,1655,1998

Normal & reactive

CD45+

CD38 +++CD138 ++

CD56-

CD19+

CD117-

k & l(polyclonal)

CD20-

MGUS

CD45+/-

CD38 +++/++CD138 ++

CD56-/+

CD19-/+

CD117-

CD20-

k &/or l(monoclonal in a

proportion of PCs)

Clonal

CD56++

CD45-

CD38 ++CD138 ++

CD19-

CD117-/+

CD20-

k or l(monoclonal)

CD45+

CD38 +++CD138 ++

CD56-

CD19+

CD117-

CD20-

k & l(polyclonal)

Myeloma

CD56++

CD45-

CD38 ++CD138 ++

CD19-

CD117-/+

CD20-

k or l(monoclonal)

MM: dimostrazione di monoclonalità

  IF1 IF2 IF3 IF4CD19 + + - -CD56 - - + -% PC <0.4 >0.4 NS NS

Immunofenotipi plasmacellulari

IF2 % PC=15% PC=15%

% PC=19%% PC=19%

% PC=5%% PC=5%

IF3

IF4

IF1

21%

5%

62%

12%

0%10%20%30%40%50%60%70%

IF1 IF2 IF3 IF4

CD45

CD117 CD56

CD38

fattori prognostici in CFMfattori prognostici in CFMCD20

  CD20+ CD38dim CD45- CD56- CD117+IF1 / / / 18 /IF2     3 3 1IF3 9 13 5   31IF4 2 2 2 12 10

TOT IF 11 15 10 33 42

Nuovi targets per la terapia contro il Nuovi targets per la terapia contro il MMMM

SANGUE MIDOLLARE MM

SANGUE PERIFERICO MM

Presenza di PC-MM su Sangue periferico:

SANGUE PERIFERICO NORMALE

Malattia Minima ResiduaMalattia Minima ResiduaA

B

DIAGNOSI

MMR

Sensibilità strumentale = 1/10000

Utilità della citofluorimetria nel paziente affetto da MM:

• distingue tra plasmacellule normali, reattive e patologiche

• determina eventuali fattori prognostici

• identificare nuovi targets per la terapia contro il mieloma

• un’elevata sensibilità nel valutare la MMR

• possibilità di evidenziare PC-MM anche su sangue periferico

Conclusioni (I)

• L’analisi multiparametrica multicolore consente una L’analisi multiparametrica multicolore consente una maggiore opportunità di discriminare sottopopolazioni maggiore opportunità di discriminare sottopopolazioni cellulari.cellulari.

• E’ necessario applicare buone procedure di validazione E’ necessario applicare buone procedure di validazione strumentale e ottimizzare la scelta delle combinazioni dei strumentale e ottimizzare la scelta delle combinazioni dei reagenti.reagenti.

• L’elettronica digitale ha decisamente aiutato nella L’elettronica digitale ha decisamente aiutato nella esecuzione di analisi complesse fino a poco tempo fa esecuzione di analisi complesse fino a poco tempo fa impensabili.impensabili.

Conclusioni (II)