Croi 2010 Maldarelli V14 Lowres

Frank MaldarelliHIV Drug Resistance Programme, NCI-Frederick, MD, US

Traduzione non ufficiale, né rivista dall’Autore; la presentazione originale in lingua inglese può essere consultata suhttp://app2.capitalreach.com/esp1204/servlet/tc?c=10164&cn=retro&e=12382&m=1&s=20431&&espmt=2&mp3file=12382&m4bfile=12382&br=80&audio=false

Cosa vuol dire “cura dell’HIV”?

• eradicazione del virus

Cura sterilizzante?

• remissione clinicaCura

funzionale?

• ripristino della situazione preinfezione, quasi senza postumi

Guarigione?

Il termine “cura dell’HIV” è in sé approssimativo, perché può significare diverse cose.In questa presentazione l’accezione è quella di eradicazione del virus dall’ospite, sicché l’obiettivo è comprendere la virologia dell’eradicazione dell’HIV.

Cura sterilizzante = eradicazione dell’HIV

Cosa è necessario per parlare di eradicazione

Cosa NON è necessario per parlare di eradicazione

ASSENZA di evidente replicazione dell’HIVViremia NON rilevabileASSENZA di trattamento antiretroviraleDurata INDEFINITA

Eliminazione di TUTTE le cellule infettate dall’HIVRipristino COMPLETO delle funzioni immunitarie

Eradicazione dell’HIV: è possibile?Tre punti del problema Persistenza di ostacoli fondamentali da superare nella

comprensione della patogenesi dell’HIV Necessità di superare gli ostacoli all’eradicazione Necessità di strategie per l’eradicazione

Le domande alla base degli ostacoli che ancora persistono per la comprensione della patogenesi dell’HIV:Quale è la natura della replicazione

dell’HIV durante la terapia antiretrovirale?

Durante la terapia antiretrovirale, quale è lo stato delle cellule

infettate dall’HIV?È dovuta a cicli attivi di replicazione?È imputabile a reservoir costituiti da cellule dalla lunga sopravvivenza?È da collegarsi all’esistenza dei cd. santuari?Oppure, a una combinazione di tutto ciò?Non siamo ancora giunti a un

consenso condiviso

Sono attivate?Sono quiescenti?Una combinazione di questi due stati?Oppure sono capaci di espansione?

La risposta dell’HIV alla terapia antiretrovirale:la cinetica del decadimento delle cellule infette

Nella prima fase dall’inizio della HAART - le prime una-due settimane - la viremia declina rapidamente, con un’emivita di circa un giorno. In questa fase a essere colpite sono le cellule T attivate, dalla breve emivita, e che non trasmettono il virus a nuove cellule.Ma ci sono anche cellule dalla vita più lunga: durano e producono virioni più a lungo, perciò sostengono la viremia più a lungo. Il virus continua a non essere trasmesso a nuove cellule, ma queste cellule non sono ancora morte.Infine, quando la viremia scende sotto le 50 copie/mL, quello che accade resta incerto.

Linfocitiattivati

Macrofagi dalla maggiore

sopravvivenza?

Cosa succede?

HAART

108

107

106

105

104

Cellu

le in

fetta

te d

a HIV

Limite di sensibilità

dei test

1 giorno 14 giorni più a lungoL’emivita delle cellule infette

L’HIV in corso di HAART soppressiva: i primi studi suggerivano la persistenza della replicazione

Gli studi sui campioni ematici dei pazienti delle “prime HAART”, quale il regime AZT+3TC+RTV,* hanno permesso di capire cosa succedeva durante la terapia.Un’osservazione era che non tutti i regimi erano uguali, ma c’erano differenze di potenza del regime e di durata della soppressione.La replicazione virale sembrava continuare durante la terapia.

AZT, azidotimidina, zidovudina: Retrovir® 3TC, lamivudina: Epivir®, RTV, ritonavir: Norvir®

Gli approcci per indagare sui reservoirI primi approcci diretti a indagare sui reservoir condussero a poche ma determinanti osservazioni.All’inizio si era in grado di studiare il plasma e eseguire test ultrasensibili sulla viremia, subordinate a coltivazioni in vitro, e di sequenziare l’acido nucleico.Era altresì possibile analizzare le cellule mononucleate del sangue periferico. In questo sangue si trovavano cellule infette e non infette; alcune di quelle infette producevano virioni e altre avevano provirusintegrati. Quest’ultimo gruppo è eterogeneo, perché alcune cellule sono non funzionali e non producono virioni, altre possono farlo.

Gli approcci per indagare sui reservoirIn un certo numero di studi ben condotti, è stato possibile isolare cellule quiescenti, che sono quelle che non producono virioni dell’HIV ma contengono provirus e, con un’appropriata attivazione, possono produrre virus infettivi.

Complessivamente, queste prime indagini rivelavano che: la viremia residua era infettiva nelle

coltivazioni in vitro, la viremia residua era geneticamente

diversa (caratteristica che vedremo tornare),

infine, che il virus che poteva essere indotto dalle cellule quiescenti contenenti provirus era anch’esso infettivo.

Cellule quiescenti Cellule attivate

I potenziali reservoirFunzionali Anatomici

Linfoidi CD4 memoria CD4 regolatori CD34+

Macrofagi Microgliali Cellule di Langerhans Istiociti Alveolari

In aggiunta a quelli funzionali, erano stati proposti i reservoir anatomici, ipotizzando una insufficiente penetrazione degli antiretrovirali come causa della persistente replicazione.

Sistema Nervoso Centrale

Tessuto linfoide

associato all'intestino

(GALT)

Tratto Genito

Urinario

Identificare la fonte della viremia durante la terapia antiretrovirale è essenziale per l’eradicazione

Cicli attivi di replicazione Reservoir stabili

La produzione di HIV da replicazione attiva

è bloccata dalla HAART:serve una HAART potenziata

La produzione di HIV proveniente dai reservoir

NON è bloccata dalla HAART:servono nuove strategie

Cellule infette Non infette

Identificare la fonte della viremia durante la HAART è essenziale per ogni strategia:se c’è replicazione nonostante la terapia, allora una cellula infetta sarà in grado di produrre virioni e di infettare altre cellule, quindi la produzione di HIV può essere bloccata dalla sola terapia antiretrovirale. Ma se la produzione di HIV proviene da reservoir stabili, allora non sarà bloccata dalla terapia e, quindi, serviranno nuove strategie.

Identificare la fonte della viremia durante la terapia antiretrovirale: le limitazioni originarieI test di rilevazione di livelli

molto bassi di viremia Dati cliniciIn questa fase, c’erano ancora limitazioni nell’approcciarsi agli studi sui reservoir: I test erano sufficientemente

sensibili? Inoltre, anche ai più bassi livelli

di RNA erano solo studi semi-quantitativi

Dubbi c’erano anche sui dati clinici: C’erano pochi studi

randomizzati I campioni di questi studi

avevano piccole dimensioni La frequenza delle misurazioni

era bassa C’erano pochi confronti

pre/post terapia

Come superare questi limiti? la misurazione “single copy” della viremia da HIV-1

Il “Drug Resistance Program” sviluppò un test “single copy” per individuare la viremia da HIV a livelli estremamente bassi in un modo preciso e quantitativo: metodica PCR in tempo reale misurazione lineare 1-106 copie HIV-1 RNA limite di rilevazione 0,2 copie/ml plasma

Questo test: NON misura attività biologica NON è approvato da FDA

La slide seguente mostra due tra i primi esempi di applicazione di questo test su pazienti che iniziavano la terapia antiretrovirale.

La replicazione dell’HIV persiste nei pazienti in HAART soppressiva

800

HIV-

1 RNA

(cop

ie/mL

plasm

a)

HAART

giorni di partecipazione allo studio200 400 6000

HIV-

1 RNA

(cop

ie/mL

plasm

a)

HAART

giorni di partecipazione allo studio200 400 600 8000

HAART: d4T, stavudina: Zerit®, 3TC, lamivudina: Epivir®, EFV, efavirenz: Sustiva®

Test bDNA Test bDNA<75 copie/mL test single copy test single copy <1 copia/mL

Possiamo misurare la viremia sia col test bDNA sia col “single copy”, che riflettono similmente l’andamento della viremia. Quando questa scende sotto il limite di rilevazione del test bDNA, possiamo ancora riscontrare la presenza del virus con il test "single copy", notando che la viremia sembra avere andamenti diversi nei due pazienti.

Durante la terapia, la viremia è INDIPENDENTE dal regime di trattamento

Maldarelli et al. hanno avuto la possibilità di studiare campioni provenienti dallo studio Abbott 98-863*: lopinavir/ritonavir vs regimi con nelfinavir 130 pazienti randomizzati pazienti in soppressione da > 1 anno differenza del 20% nel fallimento

virologico di nelfinavir rispetto a lopinavir/ritonavir

valutazione con esame “single copy”.L’ipotesi di Maldarelli et al. era che i regimi a base di nelfinavir sarebbero dovuti essere associati a una maggiore viremia e quelli con lopinavir/ritonavir a una minore. Così sono stati effettuati i test “single copy”… per scoprire che, invece, i regimi lopinavir/ritonavir e quelli con nelfinavir avevano esattamente le stesse medie e mediane e distribuzioni di viremia.

RNA virale Log10 (copie/mL)

Grad

o di d

istrib

uzion

e (pe

rcenti

le)

* Lopinavir–Ritonavir versus Nelfinavir for the Initial Treatment of HIV Infectionhttp://content.nejm.org/cgi/content/full/346/26/2039

Maldarelli et al., 2007

Durante la terapia, la viremia è INDIPENDENTE dal regime di trattamento

Per “peggiorare le cose”, questi risultati sono stati confrontati con quelli di un regime di trattamento contenente NNRTI seguito da pazienti della clinica NIAID/CCMD, ottenendo gli stessi esatti risultati.In definitiva, questi studi mostravano che la viremia durante terapia soppressiva è indipendente dal regime che si sta seguendo.

RNA virale Log10 (copie/mL)

Grad

o di d

istrib

uzion

e (pe

rcenti

le)

* Lopinavir–Ritonavir versus Nelfinavir for the Initial Treatment of HIV Infectionhttp://content.nejm.org/cgi/content/full/346/26/2039

Maldarelli et al., 2007

Il decadimento finale dell’HIV RNA si verifica in più fasi

In studi ulteriori su pazienti seguiti fino a 7 anni, s’è osservato che: la viremia declinava dopo i primi

uno-due anni con un’emivita di circa 63 settimane (terza fase)

infine, un livello di viremia stabile, dall’emivita praticamente infinita.

Questi dati, un’analisi longitudinale, suggerivano che ci fossero una terza e una quarta fase di decadimento dell'RNA dell'HIV, e che la viremia persistente non è attribuibile a replicazione in corso.

HIV-

1 RNA

nel p

lasma

(log 1

0co

pie/m

L)

settimana

Palmer et al., 2008

Indagare il meccanismo della viremia cronica usando l’intensificazione antiretrovirale

Per capire di più, s’è studiato il meccanismo della viremia cronica usando l’intensificazione della HAART in pazienti: in soppressione virale da oltre 1 anno secondo i test commerciali con ≥ 1 copia/mL (cioè “viremici”) secondo i test “single copy” senza nessuna precedente resistenza alla HAART

I pazienti hanno ricevuto HAART intensificata per 30 giorniL’ipotesi di ricerca era che: l’assenza di cambiamento

dei livelli di RNA virale indicasse l’assenza di replicazione;

la presenza di riduzioni o incrementi nei livelli di RNA indicasse la replicazione.

30 giorni

intensificazioneASSENZA di replicazione

replicazionein corso

tempo

HIV-

1 RNA

(cop

ie/mL

)102

101

100

L’intensificazione con raltegravirNON riduce la viremia persistente

Questo esempio, uno studio su raltegravir i cui dati sono stati presentati nel 2009, mostra che non ci sono state differenze prima durante o dopo l’intensificazione della terapia.

raltegravirpreintensificazione

postintensificazione

HIV-

1 RNA

(cop

ie/mL

plasm

a log

10)

tempo (giorni) McMahon, CID

L’intensificazione della terapia antiretrovirale NON riduce la viremia persistente

Questo tipo di esperimenti è stato condotto più volte e con mezzi diversi, ma tutti gli studi di intensificazione sembrano negare che ci sia replicazione durante la HAART.Infatti, l’intensificazione della terapia antiretrovirale NON riduce i livelli di HIV-1 nel plasma, negli studi condotti con: efavirenz (Sustiva®) atazanavir/ritonavir (Reyataz®/r) lopinavir/ritonavir (Kaletra®/r) ritonavir (Norvir®)

I risultati degli studi di intensificazione appaiono incompatibili con la possibilità di una replicazione attiva del virus come fonte della persistente viremia.Va sottolineato che si trattava di popolazioni di pazienti altamente selezionati (cd. “meraviglie senza blip virali”) ma, comunque, rappresentativi di soggetti in soppressione virale di lunga durata.

Analisi genetica dell’HIV RNA per individuare la replicazione in corso

Diversi studi hanno permesso, attraverso l’analisi filogenetica, di comprovare l'assenza di replicazione durante la terapia, come in questa rappresentazione schematica.In assenza di replicazione, le popolazioni potrebbero sì differire in qualche modo, ma con piccola o nessuna divergenza tra le popolazioni.All’opposto, in caso di replicazione, potremmo attenderci forti divergenze tra il pre e il post terapia.Va detto che questa è un'analisi poco sensibile, perché le popolazioni virali, almeno nelle nostre mani, cambiano molto lentamente anche in assenza di terapia antiretrovirale. divergenza divergenza

prima della terapiadurante la terapia

Asse

nza d

i rep

licaz

ione

Replicazione in corso

In questi dati di Mary Kearney*, se guardiamo all’analisi filogenetica dell’HIV prima e durante la terapia antiretrovirale, vediamo che i campioni sia prima della terapia, sia nella prima fase di declino, sia nella seconda fase, sia nella soppressione

<50 copie, sono distribuiti in modo uguale tra le popolazioni considerate nella nostra analisi filogenetica: ciò suggerisce che non ci sia evidenza genetica di replicazione.Questi studi sono stati replicati da altri e comprovati da diversi studi pre e post terapia antiretrovirale.

giorni di partecipazione allo studio

♦CD

4 (ce

llule/

µL)

HI

V RN

A (co

pie/m

L)

Non ci sono evidenze genetiche di replicazione in corso durante la soppressione virale dalla HAART

*Mary Kearney, CROI 2010

0,001 sostituzioni/sito

Analisi della viremia da HIV dopo soppressione virale prolungata

Abbiamo già visto cosa accade nei primi uno-due anni di terapia. Bailey e Siliciano hanno invece studiato pazienti in soppressione virale da molti anni, osservando il virus proveniente dal DNA cellulare, dal plasma e dalle cellule CD4 quiescenti.Nello studio del 2006 si trova questo notevole albero filogenetico, che mostra il virus proveniente dal plasma e dai CD4 quiescenti, e, in aggiunta, un clone plasmatico predominante (PPC): Bailey e Siliciano lo hanno isolato ripetutamente, e visto che ha una sequenza costante nel tempo, che non è presente nei CD4 né è tra le componenti principali del DNA cellulare.La fonte di questo virus è incerta, ma si tratta di ciò che circola durante la quarta fase di decadimento della viremia.Cosa potrebbe essere? che si tratti, come suggerisce John Coffin, d’una sorta di “fossile” che

emerge dopo che tutte le altre cellule infettate dal virus sono state rimosse?

o si tratta di un insieme di cellule produttive in espansione? La risposta resta incerta.

PPC(clone plasmatico

predominante)

• Isolato ripetutamente

• Sequenza costante nel tempo

• NON presente nei CD4 quiescenti

• NON tra le componenti principali del DNA cellulare

HIV DNA cellulare HIV nel plasmaHIV da CD4 quiescenti

Ostacoli fondamentali nella comprensione dell’infezione da HIV

Quale è la natura della replicazione dell’HIV durante la terapia antiretrovirale? È dovuta a cicli attivi di replicazione? È imputabile a reservoir costituiti da cellule dalla lunga sopravvivenza? È da collegarsi all’esistenza dei cd. santuari? Oppure, a una combinazione di tutto ciò?

Durante la terapia antiretrovirale, quale è lo stato delle cellule infettate dall’HIV? Sono attivate? Sono quiescenti? Sono in grado di espandersi?

Stato delle cellule infette da HIV durante la terapia

Replicazione spontanea di HIV

Replicazione di HIV inducibile

Da un punto di vista virologico il problema sembra semplice: “si tratta di replicazione costante o di qualcosa di inducibile, o di entrambi i fenomeni?” Si tratta di una produzione costante, data da cellule che semplicemente non muoiono e

– integrando del provirus – producono piccole quantità di HIV, oppure abbiamo un gran numero di queste cellule infette, che però sono realmente latenti e perciò non

producono nessun RNA ma che, stimolate da antigeni, sono in grado di dare origine a viremia? e, questi provirus integrati, avranno LTR (long terminal repeats, sequenze esterne contenenti elementi

regolatori dell'espressione genica) che richiedono trascrizione?

stimolazione di antigeni




In cellule in cui l'HIV si replica spontaneamente, i fattori di trascrizione dovrebbero già essere legati, con conseguente produzione di RNA, pur modesta.

Al contrario, nella circostanza della produzione “inducibile”, i provirus sarebbero complessati nella cromatina e non in grado di produrre RNA, e il rimodellamento della cromatina potrebbe consentire il legame dei fattori di trascrizione e la produzione di RNA.

U3 R U5

HIV mRNA__________________________________________+1

fattori di trascrizione

La cromatina è l'insieme del DNA e di particolari proteine (gli "istoni") che lo "impacchettano" all'interno del nucleo dellacellula

“latente”

Strategia indiretta:1.Attivazione del rimodellamento della cromatina

2.Azione su HIV




Azione diretta su HIV

U3 R U5

HIV mRNA_________________________________________________________

+1


U3 R U5

HIV mRNA_________________________________________________________

+1


rimodellamento della cromatina

occorrerebbero approcci diversi per l'eradicazionesecondo della natura dei reservoir

Come superare questi ostacoli appena illustrati?



Superare gli ostacoli nella comprensione della persistenza dell’HIV

Scienza di base: dobbiamo capire la natura della replicazione dell’HIV

durante la terapiaCome procedere?

Durante la terapia, come decadono le popolazioni infette?Da quali popolazioni di cellule infette provengono i cloni plasmatici predominanti (PPC)? sono popolazioni in espansione? o sono popolazioni in contrazione?

Serve una caratterizzazione dettagliata dei tipi di cellule infettate da HIV classificazione delle cellule e loro

analisi molecolare misurazione delle molteplici forme

di acido nucleico di HIV distinzione dell’HIV attivo dagli

integranti difettosiApplicazione di modelli animali analisi dei principi potenzialmente

in grado di disturbare i reservoir


Scienza di base: dobbiamo capire quale è lo stato delle cellule infette

durante la terapiaCome procedere?

Caratterizzare l’interazione tra fattori cellulari e virali nello stabilire un’infezione di basso

livello o latente nel mantenimento della

soppressione viraleAnalisi quantitativa dei tipi cellulari e dell’infezione virale sangue periferico e siti anatomici

Analisi dettagliata dei segnali cellulariImpiego di modelli in vitro di attivazione

costante inducibile

U3

R U5

HIV mRNA_________________________________________________________

+1


“latente”


Scienza clinica: quale è la natura dei reservoir in vivo? Come procedere?

Quanto sono grandiCome si formano Come si conservano

Analisi quantitativa delle dimensioni dei reservoir natura della variazione dei livelli di

viremia attivazione/soppressione/espansione

Comprensione della natura dei tipi di cellule che responsabili della replicazione dell’HIV distribuzione anatomica

Caratterizzazione dell’interazione tra produzione virale e attivazione immunitaria



Tradurre tutto questo in strategie?

Strategie per l’eradicazioneRequisiti Mantenimento della soppressione della replicazione

attiva di HIV-1 Prosecuzione della HAART durante l’eradicazione

Duplice approccio Colpire le cellule infette a bassa produzione di HIV-1 Assicurare l’attivazione delle cellule che ospitano l’infezione

“latente” da HIV Soppressione permanente per un effetto duraturo

il test determinante per dichiarare l’eradicazione:

l’interruzione della HAART

Strategie per l’eradicazioneStimolare l'espressione di HIV da parte delle cellule latentemente infette HDAC (inibitori dell'istondeacetilasi) e altri approcci per rimodellare la cromatina Induzione specifica dell’HIV Immunomodulatori

Colpire le cellule infette dal basso livello di replicazione Inibizione dell’attivazione cellulare Terapia citotossica diretta Approcci di terapia genica

Approccio trapiantistico Sostituzione del midollo osseo con quello di un donatore HIV resistente

(Hütter et al., 2009) NON ampiamente applicabile

Interruzione della terapia antiretroviraleIl successo clinico, per essere confermato, richiede una sorveglianza di lungo termine.

In conclusione…La maggior parte di ciò che è stato discusso in questa relazione riguarda come i virus possono aiutarci a comprendere le cellule infette, e le cellule infette rappresentano un vero problema per noi.Eliminare le cellule infette, così come eliminare le cellule tumorali, dovrebbe essere possibile, e certamente abbiamo avuto molti successi con i tumori. Ciò potrebbe significare che un bel po’ della sopravvivenza libera da malattia sarebbe spesa nelle sale d’attesa dei medici, ma almeno sarebbe spesa senza terapia antiretrovirale.Io penso che uno dei temi critici sarà l’interruzione della terapia antiretrovirale, e una delle cose più importanti sarà capire quando cessarla.

Frank Maldarelli, immagine dal webcast dell’intervento al CROI 2010

Domande&Risposte post relazioneci sono attualmente approcci, basati su quello su cui stai lavorando, che a tuo parere sono più promettenti di altri?Basati su quello su cui sto lavorando… so che non funzionano!Dico che l’uso della terapia antiretrovirale, se riteniamo – come di fatto riteniamo – che la viremia persistente nel sangue sia una componente importante, so che non funziona. Se ragiono in termini di soppressione delle cellule infette, non credo che sappiamo abbastanza su quanto di ciascuna cellula è presente, quante di esse producano attivamente del virus. Se ci mettiamo a dar la caccia alle cellule infette in modo latente, non avremo mai un effetto sulle altre.

Domande&Risposte post relazioneHai menzionato la possibilità di replicazione nei santuari e mi chiedo se l’assenza di evoluzione genetica sia evidenza del fatto che non c’è replicazione nei santuari, in particolare nei pazienti che prendono la HAART.Ci piacerebbe pensarlo, finché misuriamo il plasma e campioniamo allo stesso modo tutti questi siti. Tutti gli studi sono stati fatti sul plasma; finché questi altri siti, i santuari anatomici, comunicano con il sangue e gli trasmettono i loro virus, ci aspetteremmo che sia così.Suppongo che sia difficile immaginare che i pazienti abbiano carica virale azzerata per 7, 8, 9 anni e abbiano replicazione in corso, magari non senza farmaci o, peggio, con piccole quantità di farmaco presenti nei santuari, la situazione ideale perché si sviluppino resistenze, ma questa non è l’osservazione corrente.

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Health & Medicine

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