1966

Universita’ di Bari

1-3 gruppo A 4-5 gruppo B

X-6-12 gruppo C

13-15 gruppo D 16-18 gruppo E

19-20 gruppo F Y-21-22 gruppo G

by GP&NA

Conferenza di Denver

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1-3 gruppo A 4-5 gruppo B

X-6-12 gruppo C

13-15 gruppo D 16-18 gruppo E

19-20 gruppo F Y-21-22 gruppo G

Cariotipi a confronto

Creano un’alternanza di bande chiare e scure lungo l’asse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi.

Colorano una regione specifica di alcuni o di tutti i cromosomi

C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabilidei cromosomi 1,9,16,Y

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Metodi colorazione differenziale

utilizzando la mostarda di quinacrina......

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QM-banding pattern

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DAPI e QM

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G-bande

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R-bande

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Diagramma

46,XX - cariotipo normale Femminile

46,XY - cariotipo normale Maschile

Questo modo di scrivere ci da’ due informazioni:- numero totale dei cromosomi (46)- sesso dell’organismo

47,XY,+21Maschio con 47 cromosomi (invece di 46) ed un cromosoma 21 in piu’ (sindrome di Down)

46,XX,del(14)(q23) del=delezione

46,XY,dup(14)(q22q25) dup= duplicazione

46,XX,r(7)(p22q36) r=ring (cromosoma ad anello)

Terminologia

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doppia elicadi DNA

A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A T

osservazionedel vetrino

A T C G G T A T C C T A

T A GG C A T A G G A T

denaturazione

cromosomasul vetrino

sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo

ibridazione della sonda suicromosomi denaturati sul vetrino

ATC G G

TAT C C T A

A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A TTT A GG C A T A G G A

FISH

A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A T

A T C G G T A T C C T A

T A GG C A T A G G A T

denaturazione

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filtro di emissione

specchio dicroico

filtro

di e

ccitazio

ne

obiettivo/condensatore

fotografiaCCD camera

Lampada a vaporidi mercurio

Elaborazione alcomputer

FISH : microscopio a fluorescenza

Osservazioneal microscopio

Cromosomi 1. denaturati2. colorati con DAPI

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FISH: metafase in DAPI

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FISH: segnali

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FISH: merge

1) Allestimento della coltura

2) Preparazione dei vetrini

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

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Analisi del cariotipo

sangueperiferico

terreno dicoltura

48-96h

proliferazione

colchicina(ultimi 30’)

centrifugazione

pelletrisospeso

Ipotonica (20’)

centrifugazione

pelletrisospeso

fissativo

centrifugazioni (2-3)

fissativorisospensionein poco fissativo

allestimento delpreparato

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Allestimento del preparato

fitoemoagglutinina(stimola la crescita)

1) Allestimento della coltura

2) Preparazione dei vetrini

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

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Analisi del cariotipo

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

Fluorocromi: QM, DAPI. Necessario un microscopio a flurescenza

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Colorazione QM

G-banding con Giemsa dopo trattamento con tripsina

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

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Colorazione Giemsa

1) Allestimento della coltura

2) Preparazione dei vetrini

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

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Analisi del cariotipo

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Selezione delle metafasi

Ottimama…..

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Selezione delle metafasi

Puo’essere anche cosi’..Cromosomi non ben riconoscibili, difficili anche dacontare.Scartare! (potendo)

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.. O cosi’

Selezione delle metafasi

Troppo contrattipero’ si puo’ usareper contarli.Scartare! (potendo)

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Selezione delle metafasi

Sufficiente Si possono contarePuo’ essere utile peranalizzare i cromosominon sovrapposti

Discreta

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Si possono contare, e anchese ci sono alcunesovrapposizioni,si possono analizzare

Selezione delle metafasi

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Selezione delle metafasi

Buona Si possono contare, e anchese ci sono alcunesovrapposizioni,la morfologia deicromosomi e’buona

1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL NUMERO CROMOSOMICO

2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA’

3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE

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Come si fa il cariotipo?

10

1611

9

46

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Fare il cariotipo

CARIOTIPO IN QM (specifico il bandeggio)

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Cariotipo ordinato