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L’infezione con Agrobacteriumcostituisce un sistema “naturale”di trasformazione delle cellulevegetali

PIANTE TRANSGENICHE

Disegnare il transgene con cui “trasformare:

1) Promotore2) gene di interesse3) secondo promotore4) marcatore selezionabile

COME OTTENERE UN TRANSGENE

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PROMOTORI: 1. promotori universali attivi in modo costitutivo, in tutti i tessuti

della pianta, e in tutti i tipi di piante; devono garantire livelli elevati di espressione genica

2. promotori tessuto-specifici: esprimeranno il gene soltanto in alcuni tessuti

3. promotori tempo-specifici: attivi soltanto in alcuni momenti del ciclo vitale della pianta, come la fioritura, la germinazione, la maturazione dei frutti

4. promotori regolati: saranno attivi soltanto in determinate condizoni – quali luce, calore, mancanza di umidità, oppure in presenza di specifici segnali biochimici

Viene costruito un vettore Ti modificato contenente il gene che si desidera inserire nella pianta e una resistenza antibiotica, tra le regioni fiancheggiantiil T-DNA.Questo vettore può essere replicato in E. coli ma possiede anche una originedi replicazione di A. tumefaciens.

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Per coniugazione questo plasmide Ti modificato può essere trasferito in un ceppo di A. tumefaciens che contiene a sua volta un plasmide Ti ingegnerizzato(“disarmato”), ossia privo dei geni chiave della patogenesi, ma in grado di promuovere il trasferimento del T-DNA nelle cellulevegetali.

Con questo ceppo, contenente un sistema binario di plasmidi si procede all’infezione e alla integrazione del gene di interesse nella pianta

Per la rigenerazione di piante intere da singole cellule si utilizzano solitamente cellule estratte dalle foglie usando un punzone a cerchi ottenendo così dei dischi fogliari.

Questi verranno incubati per breve tempo in terreno con A. tumefaciens la cui infezione saràfacilitata dai fattori rilasciati dalle cellule al margine del disco.

I dischi verrano poi trasferiti in terreni stimolanti lo sviluppo dei germogli in presenza di antibiotici come kanamicina, per selezionare le cellule che hanno ricevuto il plasmide, e cefotaximine per uccidere l'Agrobacterium.

I germogli sviluppatisi verranno trasferiti in terreno stimolante la formazione di radici; i due terreni differiscono per il rapporto delle concentrazioni di auxina e citochinine.Uno dei maggiori vantaggi di tale tecnica è la velocità del processo: da quattro a sette settimane per l'ottenimento della pianta a partire dal disco fogliare.

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1. sopravvivenza delle cellule trasformate (o di piante giovani) suterreno selettivoIl terreno contiene un antibiotico oppure un erbicida a seconda del marcatore selezionabile del transgeneSoltanto le cellule trasformate avranno acquisito la resistenza all’antibiotico o all’erbicida, le altre muoiono. Nella foto le piantine morte sono bianche in quanto l’antibiotico usato uccide innanzitutto i cloroplasti.

METODI PER IDENTIFICARE I TRASFORMANTI

The transformed plants in thistop dish are resistant toRoundUp herbicide (glyphosate). The untransformed plants in the bottom dish are not:

2. presenza di un gene reporter. secondo questa strategia il marcatore in particolari condizioni mostra un colore blu o verde generalmente.

Il colore verde è dato dalla, Green Fluorescent Protein (GFP). Il gene deriva da aluni tipi di meduse e codifica per una proteina che emette una fluorescenza verde se illuminata con gli UV.

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gene per la LUCIFERASI

Once a transgenic plant is regenerated, some tests need to be done to verify that it's new gene is integrated and working properly.Make sure that the plant contains the marker: grow it on selective media.Make sure the entire transgene is integrated:Do a PCR using primers specific to the entire transgeneDo a Southern to detect a specific piece of DNA Make sure the plant possesses the desired trait:Does the plant display the new phenotype? Do a protein assay. Look to see if the proteins are present, folding properly, and functioning properly. Make sure the plant is viable: Grow the plant to full maturity. Make sure it can reproduce. Make sure its offspring also contain the transgene. Possible problems with transgene placement:Transgene lands inside the coding sequence of another important gene of the plantand disrupts its functionPositional effects: transgene lands in an unexpressed region of DNA or lands rightbehind another promoter Copy number: usually you just want a single copy of the transgene integrated, notseveralSilencing: the plant's natural defenses against viral attack might notice the overexpression of the transgene and shut it down. It may be possible to get aroundthis by using a "quieter" regulated promoter in the transgene.

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POSSIBILI IMPIEGHI

1) Miglioramento del valore agricolo, orticolo o ornamentale- Resistenza a erbicidi, insetti, virus, funghi, batteri- Modificare il tenore nutritivo- Modificare la durata e l’aspetto dei fiori dopo la raccolta

2) Produzione di proteine o di metaboliti di interesse economico- le piante come bioreattori

3) Studio dell'azione di geni durante lo sviluppo o altri processi biologici

Resistenza agli erbicidiPuò essere acquisita in vari modi:

1) Conferire alla pianta la capacità di inattivare metabolicamentel’erbicida.

2) Sovraprodurre la proteina bersaglio sensibile all’erbicida, così da farne rimanere abbastanza per le funzioni cellulari, nonostante l’erbicida;

1) Il bromossinile è un erbicida che agisce inibendo la fotosintesi. La nitrilasi è un enzima isolato da Klebsiella ozaenae che inattiva il bromossinile, è stato clonato nelle piante che diventano cosìresistenti all’azione dell’erbicida.

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E’ stato isolato da un ceppo di E. coli glifosato resistente, il gene di questo enzima (EPSPS- 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato-sintasi), lo si è posto sotto il controllo di un promotore delle sequenze di arresto della trascrizione e poliadenilazione vegetali, e lo si è clonato nelle cellule delle piante.

Le piante così ottenute (tabacco, petunia, pomodoro, patata, cotone) producono una quantità di EPSPS da E. coli sufficiente a sostituire l’enzima vegetale; risultano pertanto resistenti al glifosato.

Molti erbicidi agiscono attraverso l’inibizione di un enzima o una proteina chiave della pianta inibendone la crescita.L’erbicida glifosato inibisce l’attività di un enzima della biosintesi degli amminoacidi aromatici.

Resistenza agli insetti

Gli insetti rappresentano un grave problema per l'economia dell'agricoltura. Si è cercato un sistema alternativo all'utilizzo degli insetticidi, costosi e potenzialmente pericolosi per l'uomo e gli animali superiori, modificando geneticamente le piante al fine di "difendersi" dagli insetti predatori. Ciò èpossibile attraverso almeno due modalità:

- La protossina di B. thuringiensis non permane nell’ambiente e non èpericolosa per gli animali quindi può essere utilizzata per irrorare le piante. Contro quegli insetti che attaccano i tessuti interni delle piante, si possono generare piante che esprimono i geni delle tossine di B. thuringiensis.Finora sono state prodotte diverse piante che esprimono il gene della prototossina di B. thuringiensis (pomodoro, tabacco, patata, riso, mais, melo, melanzana, pioppo, noce, abete, mirtillo e cotone)

- Inserimento ed espressione dei geni per inibitori di proteasi o di amilasi che interferiscono con l'idrolisi delle proteine vegetali o dell'amido così che l'insetto non è capace di digerire il cibo.

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Resistenza a funghi e batteri :

Le piante infettate dai funghi sintetizzano un gruppo di proteine correlate con la patogenesi (PR). Sono state modificate piante come il riso ed il tabacco in modo da produrre costitutivamente alcune di queste proteine, quali ad es. la chitinasicapace di degradare la parete dei funghi.

Per rendere le pianti resistenti all'infezione batterica è stato introdotto nelle piante il gene per il lisozima del batteriofago T4, capace di lisare batteri sia gram-positivi che gram-negativi. Tali piante hanno dimostrato resistenza verso elevate concentrazione di batteri patogeni.

Resistenza ai virus :

Anche i virus sono responsabili di danni alle coltivazioni; nasce da ciò l'esigenza di proteggere le piante ricorrendo a diverse strategie:-Fare produrre alla pianta la proteina di rivestimento di un virus che normalmente infetta quel genere di pianta; l'espressione di tale proteina è capace di attenuare i processi infettiviconferendo immunità alla pianta nei confronti di una serie di virus.- Fare sintetizzare alla pianta un RNA antisenso che impedisca la replicazione del virus ibridandosi con l' mRNA della proteina del rivestimento del virus.

Produzione di molecole di interesse farmacologicoLe piante crescono con facilità e possono produrre una biomassaconsiderevole; possono essere considerate quindi degli ottimi “bioreattori”.Diverse specie di patate e pomodori sono stati ingegnerizzati per produrre varie molecole tra cui l’interferone umano.Si sperimenta la produzione di anticorpi umani per la produzione di vaccini “edibili” utilizzabili ad es. per immunizzare dalle malattie indotte dai batteri enterici.

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Sistema eccellente e molto efficiente, limitato a pochi tipi di piante

Applicato ad un elevato numero di piante e tessuti, facile e poco costoso

Metodo poco efficace

Si può applicare solo ai protoplasti delle cellule che si prestano ad essere rigenerati in piante vitali

Limitata utilità, si può iniettare una cellula per volta, richiede elevata manualità

Limitata ai protoplasti delle cellule che si prestano ad essere rigenerati in piante vitali

Si può applicare solo ai protoplasti delle cellule che si prestano ad essere rigenerati in piante vitali

Trasferimento genico mediato dal plasmide Ti

Bombardamento con microproiettili

Vettori virali

Trasferimento del gene nei protoplasti della pianta

Microiniezione

Elettroporazione

Fusione dei liposomi

METODI DI INTRODUZIONE DEL DNA NELLE CELLULE VEGETALI

FORMAZIONE DEI PROTOPLASTI

Uno dei metodi utilizzati per trasformarecellule vegetali prevede la formazionedi protoplasti a partire da cellule intatte.

Il tessuto vegetale viene escisso dalla pianta e sottoposto a digestione enzimatica - Vengono isolate singole cellule ed allontanata la parete cellulare.

Cellule così preparate possono piùfacilmente assumere DNA dall’esterno.I protoplasti vegetali possono essere mantenuti in coltura oppure, in uno specifico terreno di coltura, si possono rigenerare le pareti cellulari,rigenerando dalle cellule piante intere

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“GENE GUN”

MicroproiettiliMacroproiettiledi nylon

Bersaglio(cellula o tessuto)

Il bombardamento con microproiettili è il sistema più promettente. Si rivestono particelle sferiche di oro o di tungsteno di diam. di circa 0,2-0,4mm, con DNA precedentemente precipitato.Si accelerano le particelle così rivestite “ad alta velocità” (300-600 m/sec) utilizzando elio o aria compressa come forza propulsiva.Ad una tale velocità i proiettili sono in grado di penetrare la parete cellulare e la membrana delle cellule consentendo al DNA di integrarsi nel genoma della pianta.

-Agrobacterium è efficace soltanto sulle dicotiledoni, il “gene gun”si può utilizzare sia sulle monocotiledoni che sulle dicotiledoni

- Agrobacterium ha bisogno di 3-5 per produrre piante, il “gene gun”prevede tempi più lunghi (circa 5-7 mesi)

- Agrobacterium consente l’inserimento nel nuleo della cellula vegetale; con il “gene gun” il DNA si può inserire in qualunque comparimeno contenga DNA: nucleo, mitocondri, cloroplasti

Confronto tra Agrobacterium e “gene gun”

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Riduzione della biodiversitàed impatto negativo su altre specie

Trasferimento dei geni per la resistenza a specie infettanti

Piante come bioreattoriper la produzione di farmaci, vaccini e vitamine.

Comparsa di nuove allergieCreazione di piante con fiori dotati di nuovi colori

Selezione di insetti resistenti

Arricchimento del valore nutritivo

Instabilità geneticaRiduzione dell' uso di pesticidi

SVANTAGGIVANTAGGI

Eubatteri Gram-negativi

Spirilli (Proteobatteri): forma a spirale, mobili, isolati di alcune specie sono patogene (Campylobacterjejuni e Helicobacter pylori)

specie magnetotatticheMagnetospirillum magnetotatticum

specie parassite di altri batteri Bdellovibrio bacteriovorous

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-Attacca le cellule e penetra attraverso la parete cellulare replicandosi nello spazio periplasmico fino a formare una struttura detta BDELLOPLASTO

-Nuove cellule di Bdellovibrio vengono rilasciate in seguito alla lisi della cellula che lo contiene

specie parassite di altri batteri Bdellovibrio bacteriovorous

Eubatteri Gram-negativi

Batteri prostecati (Proteobatteri): organismi aerobici, chemiorganotrofi, acquatici, particolare morfologia con organo di adesione (prosteca) e particolare ciclo vitale

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RICKETTSIE GRAM -, di forma bastoncellarePARASSITI INTRACELLULARI OBBLIGATIsono batteri in grado di fare autonomamente biosintesi dei propri componenti, mentre per l’energia si approvvigionano di ATP dalla cellula parassitata

Eubatteri Gram-negativi

Mycoplasmas:sono i più piccoli organismi a vita libera; sono pleiomorfi; sono filogeneticamente affini ai Gram-positivi anche se non si colorano con la colorazione di Gram; la membrana contiene lipoglicani che la cellula non sa sintetizzare; crescita lenta e richieste nutrizionali complesse; molte specie sono patogene per l’uomo (apparato respiratorio ed uro-genitale)