CELLULE, RADIAZIONI E STUDI DEGLI EFFETTI BIOLOGICI INDOTTI DALLE RADIAZIONI IONIZZANTI

RADIOBIOLOGIA

Maria Pachera Andrea Reffo

Eugenio Saletta Kawarpreet Singh

Tutor: R. Cherubini, V. De Nadal

LNL – 26 giugno 2015

Cos’è la radiobiologia?

Radiobiologia: studio degli effetti e dell’azione delle radiazioni sui sistemi biologici

Scopo: • Individuazione dei parametri bio-fisici caratterizzanti l’azione delle radiazioni

sulla materia vivente

• Studio degli effetti biologici delle radiazioni a livello cellulare, tissutale o animale

Implicazioni: • Radioprotezione

• Radioterapia

Tipi di Radiazione

Radiazioni non ionizzanti Radiazioni ionizzanti

Direttamente ionizzanti

Indirettamente ionizzanti Sparsamente Ionizzanti

Densamente Ionizzanti

Radiazioni ionizzanti

Le radiazioni possono avere con la cellula due tipi di azione:

• diretta

• indiretta

Interazione radiazione - cellula

azione diretta azione indiretta

Grandezze Radiobiologiche

Dose assorbita[Gy]: quantità di energia assorbita da un mezzo

per unità di massa

D (Gy) = dE/dm J/Kg

LET (Linear Energy Transfer): l’energia ceduta da una radiazione lungo il proprio percorso al mezzo attraversato per unità di percorso stesso

LET= ΔE/Δx keV/µm

Efficacia Biologica Relativa (RBE)

R.B.E.: rapporto tra la dose della radiazione di riferimento e la

dose della radiazione in esame necessarie per indurre lo stesso effetto.

Dipende da fattori chimici, fisici e biologici

R.B.E.=(DRX/Dr) SF=SF0

Parte Sperimentale

• Irraggiamento con raggi γ di cellule V79 con sorgente di Cobalto-60

• Irraggiamento con protoni di cellule V79 con acceleratore di particelle

• Tramite Comet Assay: analisi dei danni al DNA in cellule V79 irraggiate con raggi γ.

Irraggiamento con γ

HAMSTER CINESE

Scopo: valutare la sopravvivenza di cellule sottoposte a radiazioni γ

Strumenti: sorgente di Cobalto 60 (Co-60)

fiaschette

materiale di laboratorio

Cobalto-60: isotopo radioattivo del Co

Modello: GB-150-Gammabeam

panoramic (Nordion,Canada)

Attività (15/06/2015): 7.6 TBq

Energia γ: 1.17 MeV e 1.33 MeV

T1/2: 5.27 anni

Simbolo: Co (A=60; Z=27)

Rateo di dose: 1Gy/min; 19.6 cm

Il Co-60 per motivi di sicurezza è contenuto in un cilindro di piombo abbastanza spesso da non far passare i raggi γ.

Raggi Gamma

Fotoni provenienti dal nucleo dell’atomo che ha perso energia

Forma di radiazione elettromagnetica ad alta energia

Per essere fermati devono trovarsi davanti almeno

10 cm di Pb

La radiazione gamma interagisce e ionizza la materia a

seconda della sua energia tramite: effetto fotoelettrico, scattering Compton e produzione di coppie.

Non viene provocata né trasmutazione né fissione.

Procedimento • Far crescere cellule V79 in terreno di coltura

• Irraggiare fiaschette a 1 Gy/min, per diverso tempo a seconda della dose scelta

• Trasferire cellule in piastre petri

• Dopo 5 gg di incubazione, lavare con violetto di genziana per fissare e colorare le

colonie

• Conteggio e raccolta dati per disegnare grafico dose-risposta

DATI RACCOLTI

DOSE (Gy) Petri1 Petri2 Petri3 Petri4 Petri5 Semina Media % SF*

Controllo 175 182 168 179 187 200 178,2 89,1

0.5 173 166 170 160 149 200 163,6 81,8

1 191 181 176 169 160 250 175,4 70,2

2 138 144 174 139 171 300 153,2 51,1

3 - 176 - 180 191 400 182,2 45,6

4 133 128 - 148 153 500 140,5 28,1

* %SF= survival fraction

Curva di Sopravvivenza

Raggi

Irraggiamento con protoni

Scopo: valutare la sopravvivenza delle cellule (V79) sottoposte ad un fascio di protoni accelerato

Strumenti: Acceleratore CN (Van de Graaff di 7 MeV)

Linea di fascio di radiobiologia

Petri in acciaio

Materiale da laboratorio

Petri in acciaio

Linea di fascio di radiobiologia

CALCOLO DELLA DOSE

D[Gy]=1.6 x 10 LET[keV/µm] F [cm ] -9 -2

F = φ·Ф φ = (fluenza in aria) / (n° particelle 1° monitor)

Ф = n° particelle 1° monitor

LET= 28.5 keV/µm

Saggio clonogenico

• Seminare le V79 in fiaschette

• Dopo alcuni giorni di duplicazione, trasferirle e farle aderire al foglio di mylar all’interno dei campioni

• Irraggiare i campioni con fascio di

protoni con 3 MeV di energia fornito dall’acceleratore CN sulla linea di fascio di radiobiologia

• Staccare le cellule dai campioni, e seminarle a numero definito in piastre Petri

• Fissare , colorare e contare le colonie formatesi dopo 5 giorni per disegnare la curva di sopravvivenza

DATI RACCOLTI

DOSE (Gy) Petri1 Petri2 Petri3 Petri4 Petri5 Semina Media % SF*

Controllo 172 142 147 162 132 200 151.0 75.5

0.5 112 112 89 111 85 200 101.8 50.9

1 134 121 144 164 112 400 135.0 33.8

2 170 165 158 166 167 800 165.2 20.7

3 105 146 117 110 95 1000 114.6 11.5

4 132 141 123 121 129 1500 129.2 8.6

* %SF= survival fraction

Curva di sopravvivenza

H+ 3 MeV

Curve di Sopravvivenza e RBE

-1 0 1 2 3 4 5

0.1

1

0 2 4

SF

Dose (Gy)Dose (Gy)

RBE (SF 60%)= Dγ /D protoni = 1.98/0.81 = 2.44 RBE (SF 90%)= Dγ /D protoni = 0.44/0.16 = 2.75

H+ 3 MeV

Raggi

0.9

0.6

0.81

0.44 0.16 1.98

Comet Assay

Scopo: valutare il danno al DNA di cellule sottoposte a radiazioni γ

Strumenti: sorgente di Cobalto 60 (Co-60)

fiaschette e vetrini

cella elettroforetica

materiale di laboratorio

microscopio a fluorescenza

Comet Assay

Tecnica per rilevare i danni al DNA su singole cellule eucariotiche

Vantaggi:

versatile

sensibile

veloce

Tipi di danno rilevati:

• singole o doppie rotture

• siti alcalo-labili

• DNA cross-link

Danni da Radiazioni

Protocollo del saggio

• Cellulle sospese in gel di agarosio a 37°C

• Trasferire la sospensione su un vetrino con superficie di gel di agarosio solido

• Porre in soluzione di lisi

• Porre in soluzione alcalina a pH 13

• Sottoporre il DNA a corsa

elettro-foretica (20 min., 25 V)

• Colorare il DNA con colorante

fluorescente

nucleoide

coda

Controllo – 0 Gy

1 Gy

3 Gy

FINE