Capitolo 6 – Bioccumulo su Mytilus galloprovincialis · 2008, utilizzando un protocollo di...

Capitolo 6 – Bioaccumulo Mytilus galloprovincialis

ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 495

Capitolo 6 – Bioccumulo su Mytilus galloprovincialis

6.1 Il Campionamento

La campagna di campionamento per le indagini di bioaccumulo è stata eseguita nel mese di Dicembre

2008, utilizzando un protocollo di trapianto di mitili (Mytilus galloprovincialis) prelevati da una

popolazione naturale (Cicero e Di Girolamo, 2001).

Gli organismi sono stati prelevati da una mitilicoltura di Portonovo (Ancona) e in parte

immediatamente traslocati nella stessa area (TC041), utilizzata come sito di riferimento per valutare

l’effetto della procedura di traslocazione. Entro le 24 h, gli organismi sono stati traslocati in due siti

posti nell’area del Terminale. Le due stazioni di campionamento erano state inizialmente previste in

prossimità del Terminale e a tale scopo durante le attività di monitoraggio nella fase di bianco erano

state ubicate strutture di biomonitoraggio contenenti i mitili trapiantati (Mytilus galloprovincialis); a causa

tuttavia della intensa attività di pesca a strascico che abitualmente si svolge nella zona sono state

successivamente sistemate in una posizione più protetta, in corrispondenza dell’impianto di

mitilicoltura “VISMA”. Le due stazioni (TC039, TC040) di campionamento sono state mantenute nel

medesimo impianto di mitilicoltura anche per la fase di cantiere.

La posizione delle stazioni con il dettaglio delle coordinate geografiche è riportata nel Capitolo 3 par.

3.2.

In ciascun sito è stato trapiantato un numero di individui compreso tra 200 e 300, di taglia compresa

approssimativamente tra il 70 % e il 90 % delle dimensioni massime della popolazione da cui sono stati

raccolti.

Il periodo di esposizione degli organismi, scelto in funzione del raggiungimento delle condizioni di

equilibrio, è stato di circa 4 settimane. Al termine di tale periodo gli organismi sono stati recuperati e

mantenuti ad una temperatura costante di circa +4°C, avvolti in panni umidi fino al momento della

dissezione dei tessuti, avvenuta in laboratorio entro 24 ore dal momento del prelievo.

Per ogni stazione di campionamento, sono stati preparati, a seconda delle analisi di laboratorio da

eseguire, un diverso numero di replicati, ciascuno costituito dalle intere parti molli di più organismi. Per

la determinazione dei metalli, degli IPA, degli organostannici, dei PCB e dei pesticidi sono stati

preparati tre replicati; per la determinazione dei VOC due replicati; per la determinazione dei parametri

microbiologici è stato preparato un replicato. Subito dopo la dissezione e la relativa suddivisione nei

replicati, i tessuti sono stati posti alla temperatura di -20°C fino alle successive fasi di preparazione per

le analisi. Le analisi microbiologiche sono state condotte invece nel più breve tempo possibile senza

ricorrere al congelamento dei tessuti.



6.2 Analisi chimiche

6.2.1 Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA)

Gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) costituiscono una classe di composti organici, che può avere

origine sia naturale che antropica. Sono infatti tra i costituenti del petrolio, grezzo e raffinato (in

particolare quelli di minor peso molecolare a due o tre anelli condensati) o possono derivare da processi

di combustione incompleta di combustibili fossili o altro materiale organico (in particolare quelli di

peso molecolare medio-alto, costituiti da quattro o cinque anelli condensati).

A causa di processi di trasporto ambientale gli IPA sono oggi considerati contaminanti ubiquitari

nell’ambiente, presentando infatti livelli di concentrazione rilevabili (valori di “background”) anche in

zone lontane da possibili fonti dirette o indirette, comprese le aree marine. Tuttavia la presenza di IPA

nell’ambiente costituisce sicuramente un indicatore dell’entità delle attività antropiche nella zona.

Le caratteristiche chimico-fisiche degli IPA (la limitata o scarsa solubilità in acqua, la relativa resistenza

a degradazione chimica, fisica e biologica, il grado di lipofilicità generalmente elevato) ne determinano

la persistenza ambientale e la generale tendenza a non distribuirsi uniformemente nell’ambiente

acquatico, ma ad accumularsi nei comparti sedimenti e biota. Ciò determina la possibilità di

bioaccumulo di questi composti, realizzandone la diffusione attraverso i vari anelli della catena

alimentare nei diversi comparti ambientali.

Per le ragioni esposte e per la comprovata tossicità e cancerogenicità perlomeno di alcuni IPA nei

confronti di varie specie animali e dell’uomo, gli idrocarburi policiclici aromatici risultano una tra le

classi di composti organici più significative dal punto di vista ambientale, frequentemente oggetto di

indagine ai fini di caratterizzazione e monitoraggio.

6.2.1.1 Materiali e metodi

Per l’analisi degli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) è stata seguita la procedura analitica di seguito

riportata. Il campione è stato sottoposto ad un processo di liofilizzazione, quindi è stato omogeneizzato

mediante un mulino elettrico con lama tagliente ed una aliquota (0.7 g circa) è stata sottoposta ad

estrazione con una miscela di solventi (esano/diclorometano 40:60 v/v) tramite estrazione a fluido

pressurizzato (PLE) impiegando uno strumento Dionex ASE 200. Contestualmente all’estrazione è

stata effettuata anche una purificazione dai lipidi inserendo sul fondo della cella dell’estrattore uno

strato di 8g di florisil purificato e disattivato al 7% con acqua purificata. L’estratto, torbido per la

presenza di acqua coestratta, è stato quindi disidratato per dibattimento con sodio solfato anidro ed è

stato concentrato a piccolo volume previa aggiunta di un solvente meno volatile di esano e

diclorometano ma con essi miscibile e compatibile con l’analisi HPLC (isopropanolo). L’estratto non è



stato mai portato a secchezza ed il volume finale è stato determinato gravimetricamente. L’estratto è

stato infine filtrato in siringa su membrana inorganica di porosità 0.2µm e trasferito in un vial da

autocampionatore.

La determinazione strumentale è stata condotta tramite un cromatografo liquido ad alte prestazioni

(HPLC) con un rivelatore a fluorescenza in grado di acquisire segnali di emissione multipli

programmabili. L’eluizione è stata condotta in gradiente binario eseguendo variazioni programmate

delle lunghezze d’onda di eccitazione e di emissione. La fase stazionaria della colonna impiegata è una

C18 SupelcoSil LC-PAH (25 cm x 2.1 mm I.D. x 5 µm), specifica per l’analisi degli IPA. Durante

l’analisi la colonna è stata termostata a 30°C per assicurare la costanza dei tempi di ritenzione e della

risposta del rivelatore. Allo scopo di evitare quenching della fluorescenza da parte dell’ossigeno e bolle

di gas nella fase mobile è stato impiegato un degassatore continuo in linea. I composti determinati sono

stati i 15 IPA rivelabili tramite fluorescenza indicati dall’ US-EPA (metodo 8310). Le lunghezze d’onda

utilizzate per rivelare i composti sono riportate nella tabella 6.2.1.1.1.

Tabella 6.2.1.1.1: Lunghezze d’onda utilizzate per rivelare gli IPA espresse in nm. Tempo (minuti)

Eccitazione (nm) Emissione A (nm) Emissione B (nm)

0,00 220 329 361 7,00 240 332 361 9,60 240 385 361 10,30 240 385 490 12,69 270 385 361 15,25 295 436 407 17,90 295 495 407

L’identificazione dei composti avviene in base alla concordanza dei tempi di ritenzione fra i picchi del

campione e quelli di uno standard esterno contenente i 15 IPA. La determinazione quantitativa è stata

effettuata mediante l’uso di una curva di taratura a otto punti, usando la tecnica dello standard esterno.

In ogni serie analitica sono stati inseriti degli standard per il controllo della risposta strumentale e dei

bianchi strumentali per garantire la non contaminazione del sistema. Sono state eseguite repliche dei

campioni in analisi, prove in bianco (bianchi di procedimento) e prove di fortificazione per assicurare la

qualità dei dati analitici.

L’eluizione è stata effettuata mediante un gradiente binario acqua acetonitrile (50-50 % in 35 minuti), ad

un flusso iniziale di 0,5 ml/min. L’eluizione in gradiente ha seguito lo schema indicato in tabella tabella

6.2.1.1.2.



Tabella 6.2.1.1.2: Eluizione in gradiente.

Tempi (minuti) Acqua (%) Acetonitrile (%) Flusso (ml/min) 0,00 50 50 0,500 2,00 50 50 0,500 12,00 13,2 86,8 0,500 16,50 0 100 0,640 21,50 0 100 0,800 28,00 0 100 0,800 28,05 50 50 0,800 31,00 50 50 0,500 34,50 50 50 0,500

Le concentrazioni indicate nei risultati analitici sono state espresse in µg/g rispetto alla sostanza secca

(s.s.) dei campioni analizzati. Il limite di quantificazione risulta di 0,0005 µg/g.

Il controllo di qualità sui risultati è stato effettuato, per ogni batch analitico, mediante l’analisi di

repliche, campioni di controllo del laboratorio, bianchi di procedimento, bianchi strumentali, e

campioni di verifica della validità della taratura.

Il laboratorio verifica periodicamente l’accuratezza dei propri risultati analizzando materiali di

riferimento certificati sia di organismo che di biota, tra i quali NIST 1944, 1941b, 2977 e IAEA 406 e

383 a vari livelli di concentrazione.

Allo scopo di monitorare le proprie prestazioni analitiche il laboratorio partecipa dall’Ottobre 2003 al

circuito di Laboratory Performance Studies organizzato dal QUASIMEME (Quality Assurance

Laboratory Performance Studies for Environmental Measurements in Marine Samples) eseguendo, con

cadenza semestrale, l’analisi di campioni incogniti a più livelli di concentrazione inviati dall’ente

organizzatore e comunicando i propri risultati allo scopo di confrontarli con i valori assegnati.



6.2.1.2 Risultati

Al fine di poter valutare l’accumulo di IPA sono stati prelevati tre pool significativi di Mytilus

galloprovincialis per ognuna delle tre stazioni di campionamento della campagna di dicembre 2008.

Nella tabella 6.2.1.2.1 sono riportate, per ciascuna stazione, le concentrazioni riscontrate nei singoli pool

ed il loro valore medio.

I valori medi di IPA totali delle stazioni poste in prossimità dell’area di posa del terminale (0,135 e 0.171

µg/g s.s.) risultano leggermente maggiori del valore medio riscontrato per la stazione di controllo (0,121

µg/g s.s.). Osservando il profilo di composizione dei singoli IPA (Figura 6.2.1.2.1) la differenza risulta

dovuta non tanto agli IPA a medio-basso grado di condensazione aromatica (Fenantrene, Fluorantene e

Pirene) quanto ai composti a maggior peso molecolare (Crisene, Benzo(b)Fluorantene,

Benzo(k)fluorantene, Benzo(g,h,i)perilene, Indeno(1,2,3,c,d)pirene). L’osservazione sembra suggerire

una presenza leggermente maggiore di IPA derivanti da processi di combustione in corrispondenza

delle stazioni prossime al terminale. Si tratta tuttavia di concentrazioni contenute che non evidenziano

impatti significativi.

Capitolo 6 – Bioaccumulo


Tabella 6.2.1.2.1: Concentrazioni di IPA espresse in µg/g in Mytilus galloprovincialis – fase di cantiere – Dicembre 2008. Stazione TC039M TC040M TC041M

Replicato I II III media I II III media I II III media

u.m. µg/g s.s. µg/g s.s. µg/g s.s. µg/g s.s. µg/g s.s. µg/g s.s. µg/g s.s. µg/g s.s. µg/g s.s. µg/g s.s. µg/g s.s. µg/g s.s.

naftalene 0,010 0,008 0,008 0,009 0,019 0,020 0,021 0,020 0,006 0,007 0,011 0,008 acenaftene <0,0005 <0,0005 <0,0005 <0,0005 0,001 0,001 0,001 0,001 <0,0005 <0,0005 0,001 <0,0005 fluorene 0,006 0,005 0,005 0,005 0,009 0,010 0,010 0,010 0,007 0,007 0,008 0,007 fenantrene 0,030 0,025 0,025 0,027 0,027 0,029 0,028 0,028 0,025 0,025 0,025 0,025 antracene 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 fluorantene 0,019 0,014 0,012 0,015 0,015 0,017 0,018 0,017 0,018 0,032 0,017 0,022 pirene 0,021 0,015 0,014 0,016 0,019 0,020 0,021 0,020 0,016 0,026 0,020 0,021 benzo(a)antracene 0,004 0,004 0,006 0,005 0,008 0,008 0,009 0,008 0,003 0,006 0,004 0,004 crisene 0,022 0,019 0,017 0,019 0,022 0,023 0,020 0,022 0,010 0,013 0,012 0,012 benzo(b)fluorantene 0,014 0,011 0,010 0,011 0,017 0,018 0,017 0,017 0,004 0,005 0,009 0,006 benzo(k)fluorantene 0,006 0,005 0,004 0,005 0,004 0,005 0,005 0,005 0,002 0,002 0,002 0,002 benzo(a)pirene 0,005 0,004 0,003 0,004 0,003 0,004 0,004 0,003 0,002 0,003 0,003 0,003 dibenzo(a,h)antracene 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 benzo(g,h,i)perilene 0,010 0,007 0,003 0,007 0,009 0,012 0,011 0,011 0,005 0,003 0,003 0,004 indeno(1,2,3,c,d)pirene 0,011 0,011 0,003 0,008 0,006 0,007 0,008 0,007 0,003 0,003 0,005 0,004 Somma IPA 0,161 0,130 0,113 0,135 0,160 0,179 0,175 0,171 0,105 0,135 0,123 0,121



Terminale Mitili, Cantiere Dicembre 2008, Concentrazioni medie di IPA nelle tre stazioni

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

nafta

lene

acen

aftene

fluore

ne

fenan

trene

antra

cene

fluora

ntene

piren

e

benz

o(a)an

trace

ne

crise

ne

benz

o(b)flu

orante

ne

benz

o(k)flu

orante

ne

benz

o(a)pir

ene

diben

zo(a,

h)antra

cene

benz

o(g,h,i

)perile

ne

indeno

(1,2,3,

c,d)pi

rene

µg/g

s.s

.

TB039MTB040MTB041M

Figura 6.2.1.2.1: Concentrazioni di IPA totali espresse in µg/g nei mitili delle tre stazioni – fase di cantiere – Dicembre 2008. Confrontando le concentrazioni di IPA totali determinate nei mitili nelle varie campagne succedutesi

nel tempo (figura 6.2.1.2.2) si nota come, nelle due stazioni situate in prossimità del terminale, i livelli

della campagna di cantiere di dicembre 2008 risultino leggermente maggiori di quelli riscontrati nelle

ultime due campagne di bianco (febbraio e marzo 2007) e inferiori a quelli della campagna di gennaio

2007. Tale andamento è giustificato dalle fluttuazioni stagionali delle concentrazioni di IPA nei mitili

legate ai cicli biologici degli organismi. Nella stazione di controllo si riscontrano invece, per la

campagna di cantiere, concentrazioni leggermente inferiori anche alle ultime due campagne di bianco.

Nel complesso si può tuttavia concludere che le variazioni di livelli di IPA nei mitili indagati siano da

ricondurre essenzialmente alla variabilità stagionale legata ai cicli biologici piuttosto che ad impatti

antropici nell’area.

TC039M TC040M TC041M



Terminale Mitili: Concentrazioni medie di IPA totali nelle campagne di cantiere di bianco

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

TB039M TB040M TB041M

stazione

µg/g

s.s

.

Cantiere Dic 2008Bianco Marzo 2007Bianco Febbraio 2007Bianco Gennaio 2007Bianco Luglio 2006

Figura 6.2.1.2.2: Confronto tra le concentrazioni medie di IPA totali in mitili determinate nelle tre stazioni nelle campagne di cantiere e di bianco.

T039M T040M T041M



6.2.2 Metalli


Campionamenti e prelievo degli organismi

Per ogni stazione di campionamento, sono stati preparati 3 replicati, ciascuno costituito dalle intere

parti molli di più organismi, dei quali sono stati registrati i parametri relativi alla dimensione delle valve

(lunghezza) ed al peso dei tessuti. Subito dopo la dissezione e la relativa suddivisione nei replicati, i

tessuti sono stati posti alla temperatura di -20°C fino alle successive fasi di preparazione per le analisi.

Procedura analitica

Una volta scongelati, i tessuti sono essiccati in stufa a ventilazione forzata per 48h alla temperatura di

35°C, quindi omogeneizzati mediante un mulino a lame.

Il metodo prevede la digestione dei tessuti mediante mineralizzazione. Vengono prelevati 0,5g circa di

campione (peso secco) e trasferiti in reattori di teflon, dove si addizionano 1ml di H2O2 e 7ml di HNO3.

I contenitori prima di essere inseriti nel forno a microonde, vengono chiusi utilizzando una coppia

serraggio di 22 m/N. Ciò permette alla miscela acido-campione di raggiungere temperature e pressioni

molto elevate. Il ciclo operativo impiegato per la mineralizzazione prevede 4 min a 800 Watt e 100°C,

0 min a 800 Watt e 120° C, 5 min a 1000 Watt 200 °C, 15 min a 1000 Watt e 200 °C, ventilazione e

raffreddamento (20 min).

Dopo il ciclo di mineralizzazione i campioni sono raffreddati a temperatura ambiente e portati al

volume di 25 ml.

I Bianchi Analitici sono preparati con soluzioni composte da 1ml di H2O2 + 7 ml di HNO3 e processati

con le stesse modalità operative utilizzate per la mineralizzazione dei campioni.

Determinazioni analitiche

La determinazione di Cu, Fe, Ni ,Mn, Zn, Cr e Ba è stata effettuata mediante Spettrofotometria in

Emissione Atomica ICP-OES Sequenziale ( Varian- Liberty AX); il Cd, l’As e il Pb sono stati analizzati

mediante Spettrofotometria in Assorbimento Atomico con sistema di atomizzazione a fornetto di

grafite e correzione del fondo mediante effetto Zeeman (Varian, SpectrAA 220Zeeman); per il

mercurio si è utilizzata la tecnica della concentrazione su amalgama d’oro, desorbimento e rivelazione

con spettrofotometro UV (spettrometria atomica DMA-80).

Per valutare l’adeguatezza del metodo analitico sono stati stimati alcuni parametri di qualità come

l’accuratezza, il limite di quantificazione ed il recupero. Il limite di quantificazione per ciascun metallo,

relativo alla metodica impiegata, viene riportato in tabella 6.2.2.1.1.



Tabella 6.2.2.1.1: Metalli: limiti di quantificazione. Parametro Limite di quantificazione (mg/kg)

Piombo 0,050 Cadmio 0,010 Arsenico 2,00

Bario 2,00 Cromo 1,00 Rame 1,00 Ferro 10,00

Manganese 1,50 Nichel 1,00 Zinco 1,00

Mercurio 0,0005

L’accuratezza è stata valutata mediante l’analisi di materiali di riferimento certificati: Standard Reference

Material 2976 (mussel tissue); i risultati ottenuti sono riportati in tabella 6.2.2.1.2.

Tabella 6.2.2.1.2: SRM 2976: Valori certificati e relative percentuali di recupero.

Elemento Valore certificato (mg/kg) Recupero %

Arsenico 13,3 ± 1,8 88 Cadmio 0,82 ± 0,16 92 Rame 4,02 ± 0,33 94 Ferro 171,0 ± 4,9 85

Mercurio 0,0610 ± 0,0036 96 Piombo 1,19 ± 0,18 93 Zinco 137 ± 13 86

Allo scopo di monitorare le proprie prestazioni analitiche il laboratorio partecipa dall’Ottobre 2003 al

circuito di Laboratory Performance Studies organizzato dal QUASIMEME (Quality Assurance

Laboratory Performance Studies for Environmental Measurements in Marine Samples) eseguendo, con

cadenza semestrale, l’analisi di campioni incogniti inviati dall’ente organizzatore e comunicando i propri

risultati allo scopo di confrontarli con i valori assegnati.

6.2.2.2 Risultati

Nella tabella 6.2.2.2.1 sono riportati i valori di concentrazione per i vari elementi (mg/kg di peso

secco) misurati nei tessuti di Mytilus galloprovincialis nella campagna di dicembre 2008.

La stazione TC041 è considerata stazione di bianco ed è stata prelevata a Portonovo (Ancona).

Le concentrazioni misurate risultano essere pressoché omogenee tra la stazione di controllo e le stazioni

esposte. In alcuni casi si registrano concentrazioni medie leggermente inferiori nella stazione di

controllo rispetto alle altre due stazioni; questo è vero soprattutto per mercurio e cadmio. Per il Hg il



valore medio osservato nei campioni prelevati a Portonovo risulta pari a 0,087 mg/kg p.s., mentre i

valori medi registrati nelle stazioni TC039 e TC040 sono rispettivamente 0,2010 mg/kg p.s. e 0,2217

mg/kg p.s.; per il Cd i campioni della stazione TC041 mostrano una concentrazione media pari a 0,656

mg/kg p.s., a fronte di valori medi pari a 1,927 mg/kg p.s. nella stazione TC039 e 1,227 mg/kg p.s.

nella stazione TC040.

Viceversa, per alcuni analiti si registrano concentrazioni maggiori nel controllo; in particolare per Ferro,

Manganese e Bario.



Tabella 6.2.2.2.1: Concentrazioni di metalli espresse in mg/kg in Mytilus galloprovincialis – fase di cantiere – campagna Dicembre 2008. Area Terminale – Mytilus galloprovincialis – Cantiere – Dicembre 2008

Pb Cd As Ba Cr totale Cu Fe Mn Ni Zn Hg Stazione Replicato mg/kg

p.s. mg/kg

p.s. mg/kg

p.s. mg/kg

p.s. mg/kg

p.s. mg/kg

p.s. mg/kg

p.s. mg/kg p.s.mg/kg

p.s. mg/kg p.s. mg/kg

p.s.

I 1,767 2,082 2,78 < 2,00 1,67 5,34 469,56 14,97 5,17 241,55 0,2240 II 1,878 1,994 3,10 < 2,00 1,91 4,83 490,60 13,25 3,74 203,79 0,2230 III 1,638 1,705 2,85 < 2,00 1,48 4,39 398,83 11,37 2,11 208,50 0,1560

TC039M

media 1,761 1,927 2,91 < 2,00 1,69 4,85 453,00 13,20 3,67 217,95 0,2010

I 2,045 1,026 2,11 < 2,00 2,22 4,74 697,21 15,87 < 1,00 233,28 0,2270 II 1,279 1,094 2,47 < 2,00 1,76 2,97 518,75 9,52 2,17 139,68 0,2500 III 2,905 1,560 2,68 < 2,00 3,03 4,80 851,91 19,00 4,59 228,56 0,1880

TC040M

media 2,076 1,227 2,42 < 2,00 2,34 4,17 689,29 14,80 3,38 200,51 0,2217 I 1,091 0,677 2,19 2,75 2,53 5,08 766,26 21,67 < 1,00 128,15 0,0820 II 1,047 0,627 2,44 2,85 2,45 5,96 774,88 22,44 < 1,00 123,60 0,0880 III 1,418 0,665 2,81 10,03 3,09 6,26 838,23 34,65 < 1,00 101,38 0,0900

TC041M

media 1,185 0,656 2,48 5,21 2,69 5,77 793,12 26,25 1,00 117,71 0,08667 Nelle figure 6.2.2.2.1-11 sono rappresentate le concentrazioni medie ottenute nella campagna di cantiere e nelle quattro campagne di bianco, per ciascun

metallo.

Si osserva che per cadmio, cromo, ferro, nichel e zinco, i valori misurati risultano superiori nella campagna di cantiere di dicembre 2008 rispetto agli anni

precedenti; però per il cromo e il ferro tale comportamento si registra anche nella stazione di controllo spaziale (TC041), ragion per cui per questi metalli

si può supporre che l’aumento di concentrazione non sia direttamente correlabile ai lavori di cantiere.

Per quanto riguarda l’arsenico si evidenzia che nella campagna di cantiere i valori diminuiscono in tutte le stazioni.

Tutti gli altri metalli mostrano differenze non significative con le altre campagne di monitoraggio.



0

0,5

1

1,5

2

2,5

staz 039 staz 040 staz 041

mg/Kg

Piombo

luglio'06 gennaio'07 febbraio'07 marzo'07 dicembre'08

Figura 6.2.2.2.1: Concentrazioni medie di piombo (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2


mg/Kg

Cadmio


Figura 6.2.2.2.2: Concentrazioni medie di cadmio (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).



0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

s taz 039 s taz 040 s taz 041

mg/Kg

Ars en ico

lu g lio '0 6 g e n n a io '0 7 fe b b ra io '0 7 m a rzo '0 7 d ice m b re '0 8

< LO Q

Figura 6.2.2.2.3: Concentrazioni medie di Arsenico (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).

-0,2

0,2

0,6

1

1,4

1,8

2,2

2,6

3


mg/Kg

Bario


<LOQ

Figura 6.2.2.2.4: Concentrazioni medie di Bario (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).



0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

2,4

2,7

3


mg/Kg

Cromo


<LOQ

Figura 6.2.2.2.5: Concentrazioni medie di cromo (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).

0

3

6

9

12


mg/Kg

Rame


Figura 6.2.2.2.6: Concentrazioni medie di rame (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).



0

80

160

240

320

400

480

560

640

720

800

s taz 039 s taz 040 s taz 041

mg/Kg

Ferro

lu g lio '06 g enna io '07 febb ra io '07 m a rzo '07 d ice m bre '08 Figura 6.2.2.2.7: Concentrazioni medie di ferro (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).

0

5

10

15

20

25

30


mg/Kg

Manganese


Figura 6.2.2.2.8: Concentrazioni medie di manganese (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).



0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

2,4

2,8

3,2

3,6

4


mg/Kg

Nichel


<LOQ<LOQ

Figura 6.2.2.2.9: Concentrazioni medie di nichel (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).

0

22

44

66

88

110

132

154

176

198

220


mg/Kg

Zinco


Figura 6.2.2.2.10: Concentrazioni medie di zinco (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).



0

0,1

0,2

0,3

0,4


mg/Kg

Mercurio


Figura 6.2.2.2.11: Concentrazioni medie di mercurio (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).



6.2.3 Policlorobifenili (PCB) e Pesticidi organoclorurati

I Policlorobifenili (PCB) sono una classe di sostanze di origine antropica molto utilizzata in passato per

le particolari proprietà dielettriche che li rendono ottimi isolanti termo-elettrici e quindi adatti ad una

grande varietà di usi (fluidi dielettrici negli accumulatori, trasformatori, fluidi idraulici, oli lubrificanti,

additivi, ecc). Sono sostanze persistenti, tossiche e bioaccumulabili, che sono diventate ubiquitarie

nell’ambiente, ragione per cui si trovano livelli di “background” diversi da zero anche in zone lontane

da possibili fonti dirette o indirette. I PCB che hanno una conformazione co-planare “diossina simili”

suscitano particolare interesse per la loro tossicità.

I pesticidi organoclorurati sono sostanze di origine antropica ad attività insetticida il cui meccanismo

d’azione è prevalentemente a danno del sistema nervoso; le loro caratteristiche chimico-fisiche li

rendono, unitamente ai PCB, sostanze di elevata rilevanza ambientale per le loro caratteristiche di

persistenza e tossicità. Alcuni di questi composti, come per esempio i DDT, danno origine a prodotti

metaboliti (DDD e DDE) che risultano altrettanto tossici e persistenti dei prodotti di partenza.

Queste sostanze organoclorurate sono caratterizzate da una elevata stabilità chimica, ragione per cui

nell’ambiente vengono scarsamente degradati per azione chimica o biologica, hanno bassa solubilità in

acqua ed elevata lipofilicità. Per queste caratteristiche queste sostanze tendono, nell’ambiente acquatico,

ad accumularsi nei sedimenti e nel biota.


Il principio del metodo prevede l’estrazione con solvente dei PCB e pesticidi clorurati da organismi

marini, successiva purificazione e determinazione gas-cromatografica con rivelatore a cattura di

elettroni (ECD). Si tratta di un rivelatore selettivo particolarmente sensibile a sostanze elettroaffini e

quindi, adatto all’analisi di composti alogenati che possiedono questa caratteristica.

L’estrazione dagli organismi (mitili o vongole) è stata effettuata mediante sonicazione con miscela di

solventi utilizzando un bagno ad ultrasuoni termostatato. Si pesano 1-2 g di campione liofilizzato ed

omogeneizzato, si aggiungono una spatola di sodio solfato anidro (trattato in muffola a 400°C per 6

ore) e 20 ml di una miscela n-esano/diclorometano (70:30 v/v). Si addiziona il surrogato e dopo aver

agitato bene, il campione viene posto in un bagno ad ultrasuoni per 30 minuti alla temperatura di 40°C;

si dibatte per 30 minuti, si centrifuga e si allontana l’estratto organico raccogliendolo in una beuta. Si

effettuano quindi due successive estrazioni del campione aggiungendo 10 ml della stessa miscela e

ripetendo la procedura con ultrasuoni e dibattimento; gli estratti, separati dal campione dopo

centrifugazione, vengono riuniti nella stessa beuta di raccolta, portati a piccolo volume mediante

rotavapor e purificati.



L’estratto concentrato è ripreso con 3x1 ml di n-esano e trasferito su colonna cromatografica impaccata

con 2,5 g di gel di silice disattivato al 15% e 1 cm di sodio solfato anidro. Il gel di silice utilizzato nella

purificazione è stato preparato nel seguente modo: attivato in stufa a 130°C per 16 ore, quindi posto a

raffreddare in essiccatore e disattivato mediante aggiunta del 15% di acqua bidistillata estratta con

diclorometano; il gel così trattato non viene utilizzato prima di 24 ore.

Si lascia percolare la soluzione avendo cura di non mandare a secco la colonna e si effettua quindi la

ripartizione dei PCB e pesticidi in due frazioni ottenute eluendo la colonna prima con 10 ml di n-esano

e poi con10 ml di una miscela n-esano/diclorometano (50:50). Le due frazioni separate, raccolte in

beuta, vengono concentrate a piccolo volume con l’evaporatore rotante, quindi vengono addizionate

con il PCB 209 in qualità di standard interno e portate ad un volume finale di 1 ml con isottano; infine

si trasferiscono in un vials per autocampionatore, per l’analisi gas-cromatografica.

Per quanto riguarda i campioni di mitili aventi maggiore contenuto lipidico, si è resa necessaria una

prima purificazione su Florisil. L’estratto organico, concentrato a piccolo volume, viene trasferito su

colonna cromatografica impaccata con 2,5 g di questo adsorbente e 1 cm di sodio solfato anidro; il

Florisil utilizzato è attivato in stufa a 130°C fino al momento dell’analisi. A questo punto si ripartiscono

i PCB e i pesticidi in un’unica frazione eluendo la colonna con 20 ml di Diclorometano; la frazione,

concentrata su rotavapor, è pronta per la purificazione su gel di silice.

I singoli congeneri di PCB analizzati (28, 31, 35, 52, 77, 81, 101, 105, 110, 118, 126, 128, 138, 153, 156,

169, 180) così come i pesticidi clorurati HCB, α HCH, β HCH, γ HCH (o Lindano), Aldrin, Dieldrin,

2,4’ DDT, 2,4’ DDD, 2,4’ DDE, 4,4’ DDT, 4,4’ DDD, 4,4’ DDE sono stati scelti tra quelli ritenuti più

significativi sotto il profilo sanitario ed ambientale e segnalati nell’allegato 1 del DM Ambiente n.56 del

14/04/2009 (Dlgs 152/2006). Tra questi, i PCB “diossina simili” 81, 77, 118, 105, 126, 156 e 169,

rivestono particolare interesse per la loro tossicità.

L’identificazione dei composti è stata effettuata mediante il confronto dei tempi di ritenzione dei picchi

incogniti con quelli degli standard di riferimento degli analiti da determinare; inoltre, la loro presenza

nel campione è stata confermata iniettando gli estratti su due colonne cromatografiche a diversa

polarità.

L’analisi quantitativa viene eseguita con il metodo dello standard interno rapportando l’area del picco

identificato con l’area del PCB 209 aggiunto al campione a concentrazione nota; la curva di

calibrazione, è preparata con soluzioni standard di PCB e pesticidi clorurati, che coprono l’intervallo di

concentrazione atteso nei campioni.

Il limite di quantificazione del metodo (LOQ) per ciascuna sostanza corrisponde a 0,10 ng.

Lo strumento e le condizioni gas-cromatografiche utilizzate sono state le seguenti:



GC/ECD 6890N Agilent Technologies;

Colonna 1: Rtx-CLPesticides, lunghezza 60 m, D.I. 250 µm, Film Thickness 0,25 µm; Gas di trasporto:

Elio flusso di 0,9 ml/min.

Colonna 2: Rtx-PCB, lunghezza 60 m, D.I. 250 µm, Film Thickness 0,25 µm;

Gas di trasporto: Elio flusso di 1,3 ml/min.

Iniettori: split/splitless in modalità splitless, temperatura di 250°C.

Temperatura del forno: isoterma 75°C per 0.5 min., quindi rampa di 10°C/min. fino a 200°C, a seguire

rampa di 2°C/min. fino alla temperatura finale di 300°C a cui resta per 7 minuti.

Rivelatori: ECD temperatura 300°C.

Le procedure per il controllo di qualità sono state le seguenti:

aggiunta al campione prima dell’analisi, di una quantità nota dei PCB 112 e 155 in qualità di

surrogato; la stima del recupero di questi congeneri, normalmente assenti nei campioni ambientali,

viene utilizzata per verificare la bontà della procedura analitica nei vari passaggi. Un recupero

stimato inferiore al 70% del surrogato porta alla ripetizione dell’analisi;

esecuzione di bianchi di processo per ogni serie di campioni analizzati;

uso di standard di controllo per ogni sequenza di campioni analizzati;

stima della accuratezza del metodo mediante utilizzo di materiali di riferimento certificati e

partecipazione semestrale al circuito interlaboratorio “QUASIMEME” per gli analiti PCB e

pesticidi in matrice biota.

6.2.3.2 Risultati

I pool sono stati suddivisi in tre replicati per ciascuna stazione e il commento dei dati si riferisce alla

media delle tre analisi effettuate per ogni pool.

Policlorobifenili

I risultati dei policlorobifenili determinati nei mitili, durante la campagna di cantiere del Terminale sono

mostrati in tabella 6.2.3.2.1.



Tabella 6.2.3.2.1: Concentrazione dei policlorobifenili (PCB) – fase di cantiere - Dicembre 2008.

Stazione TC039M TC040M TC041M

Replicato I II III I II III I II III

u.m. ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

PCB 31 0,57 0,80 0,38 3,59 2,94 2,70 0,87 0,97 0,52 PCB 28 0,83 1,10 0,56 2,33 2,05 2,08 1,35 1,47 0,81 PCB 52 0,45 0,34 0,33 7,25 7,30 8,12 0,42 0,35 0,26 PCB 35 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 PCB 101 11,70 13,56 12,12 5,03 4,77 4,94 14,70 14,93 12,95 PCB 110 1,34 1,42 1,55 2,86 2,94 3,32 1,59 1,52 1,22 PCB 81 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 PCB 77 <0,10 0,60 0,54 0,46 0,95 0,65 0,36 <0,10 <0,10 PCB 118 0,87 1,13 0,85 1,73 1,77 1,99 1,35 1,68 1,12 PCB 153 4,43 5,53 4,05 6,71 5,47 4,61 5,24 5,61 4,87 PCB 105 <0,10 <0,10 <0,10 0,70 0,78 0,95 <0,10 <0,10 <0,10 PCB 138 2,47 2,92 2,81 2,25 2,29 2,57 3,17 3,38 2,91 PCB 126 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 0,24 0,18 0,16 PCB 128 0,22 0,21 0,13 0,13 0,11 0,10 0,18 0,23 0,30 PCB 156 <0,10 <0,10 0,15 0,13 0,15 0,19 0,21 0,20 0,11 PCB 180 0,32 0,30 0,24 0,23 0,25 0,29 0,40 0,30 0,17 PCB 169 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 ΣPCB’s 23,20 27,93 23,73 33,40 31,76 32,52 30,07 30,82 25,40 Media ΣPCB’s

24,95 32,56 28,76



La sommatoria dei PCB riscontrata nei tre pool di mitili è mostrata in figura 6.2.3.2.1. Il range di

concentrazione rilevato va da 24,95 ng/g p.s. della stazione TC039M a 32,56 ng/g p.s. della stazione

TC040M; la stazione di controllo TC041M ha una concentrazione intermedia pari a 28,76 ng/g p.s.

0

9

18

27

36


stazioni

Σ PC

Bs n

g/g

p.s.

Figura 6.2.3.2.1: Bioaccumulo dei PCB totali nelle tre stazioni di campionamento – fase di cantiere – Dicembre 2008.

Analizzando i singoli PCB (figura 6.2.3.2.2) si rileva la presenza nei tre campioni di tutti i congeneri

analizzati ad esclusione dei PCB 35 e 81. I più abbondanti risultano essere il 101, il 153, il 138 e nella

sola stazione TC040M anche il PCB 52..

Per quanto riguarda i congeneri “diossina simili” (81, 77, 118, 105, 126, 156 e 169) sono stati rilevati, nei

tre pool di mitili, i PCB 77, 105, 118, 126 e 156.

Altri PCB

0

6

13

19

26

32


stazioni

ng/g

p.s.

31 28 52 101 110 153 138 128 180

PCB "diossina simili"

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0


stazioni

ng/g

p.s.

77 105 118 126 156

Figura 6.2.3.2.2: Bioaccumulo dei diversi congeneri nelle tre stazioni di campionamento – fase di cantiere – Dicembre 2008.



Come mostrato nella figura sottostante (figura 6.2.3.2.3) la percentuale relativa dei congeneri “diossina

simili”, è uguale nelle stazioni TC039M e TC041M mentre è più alta nella stazione TC040M dove sono

stati riscontrati valori più alti dei PCB 105 e 118.

TC039M

7%

93%

PCB "Diossina-simili" Altri PCB

TC040M

11%

89%


TC041M

7%

93%


Figura 6.2.3.2.3: Percentuale dei diversi congeneri nelle tre stazioni di campionamento – fase di cantiere – Dicembre 2008.

Pesticidi organoclorurati

Le concentrazioni dei pesticidi riscontrati nella campagna di cantiere del Terminale sono mostrati in

tabella 6.2.3.2.2.



Tabella 6.2.3.2.2: Concentrazione dei pesticidi clorurati – fase di cantiere – Dicembre 2008. Stazione TC039M TC040M TC041M

Replicato I II III media I II III media I II III media

u.m. ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

ng/g p.s.

α-HCH <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 HCB <0,10 <0,10 0,10 0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10

LINDANO 0,28 0,30 0,27 0,28 0,15 0,12 0,14 0,14 0,29 0,38 0,35 0,34 β-HCH <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 0,13 0,14 0,14 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10

ALDRIN <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 DIELRIN <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 0,33 0,34 0,39 0,35 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 2,4 DDE 0,91 0,82 1,16 <0,10 <0,10 <0,10 0,62 1,00 0,69 4,4 DDE 2,01 2,45 1,97 3,16 3,19 3,54 2,37 2,66 2,11 2,4 DDD <0,10 <0,10 <0,10 0,46 0,40 0,40 <0,10 <0,10 <0,10 2,4 DDT <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 4,4 DDD 1,90 2,01 1,51 1,43 1,41 1,70 2,99 2,57 1,93 4,4 DDT 1,55 1,87 1,08

-

0,63 0,71 0,88

-

1,74 1,72 1,61

-

Σ DD's 6,38 7,15 5,72 6,42 5,68 5,71 6,52 5,97 7,72 7,95 6,34 7,34



DDs

La sommatoria dei DDs (somma del 2,4 e 4,4 DDT, 2,4 e 4,4 DDD, 2,4 e 4,4 DDE), mostrata in

figura 6.2.3.2.4, va da 5,97 ng/g p.s. rilevati nella stazione TC040M a 7,34 ng/g p.s. della stazione

TC041M che corrisponde al campione di controllo.

0

3

5

8

10


stazioni

Σ D

Ds n

g/g

p.s.

0

3

5

8

10


stazioni

ng/g

p.s.

Σ DDE Σ DDD Σ DDT

Figura 6.2.3.2.4: Bioaccumulo dei DDs nelle tre stazioni di campionamento – fase di cantiere – Dicembre 2008.

Analizzando gli isomeri del DDT e dei suoi metaboliti si osserva che il DDE, in particolare il 4,4 DDE

è più abbondante degli altri.

TC039M

49%

28%

23%


TC040M

56%

32%

12%


TC041M

43%

34%

23%


Figura 6.2.3.2.5: Percentuale di DDE, DDD e DDT nelle tre stazioni di campionamento – fase di cantiere – Dicembre 2008.

Come mostra la (figura 6.2.3.2.5) le percentuali relative di DDE, DDD e DDT determinate nei campioni

di mitili, sono simili tra loro nelle stazioni TC039M e TC041M mentre nella stazione TC040M è più

bassa la percentuale dei DDT e più alta quella dei DDE.



HCB (Esaclorobenzene)

L’Esaclorobenzene è stato rilevato in tracce solo nella stazione TC039M dove è poco superiore al limite

di rilevabilità del metodo.

HCHs

La concentrazione degli esaclorocicloesani, espressa come sommatoria degli isomeri alfa, beta e gamma

(figura 6.2.3.2.6), è di 0,27 ng/g p.s. nella stazione TC039M e di 0,34 ng/g p.s. nella stazione

corrispondente al controllo TC041M.

0,0

0,2

0,3

0,5

0,6


stazioni

α+β+

γ H

CH n

g/g

p.s.

0,0

0,2

0,3

0,5

0,6


stazioni

ng/g

p.s.

α-HCH γ-HCH β-HCH

Figura 6.2.3.2.6: Bioaccumulo degli HCHs nelle tre stazioni di campionamento – fase di cantiere – Dicembre 2008.

Analizzando la distribuzione dei tre isomeri si nota la presenza del lindano (γ-HCH) in tutte e tre le

stazioni e del β-HCH nella sola stazione TC040M.

Aldrin e Dieldrin

L’Aldrin è sempre al di sotto del limite di quantificazione del metodo, pari a 0,10 ng/g.

Il Dieldrin è stato rilevato nella sola stazione TC040M ed è pari a 0,34 ng/g p.s.

Riguardo all’analisi dei contaminanti organici clorurati effettuata nei campioni di mitili trapiantati

durante la fase di cantiere si nota che, rispetto al campione di controllo prelevato nell’area da cui

provengono i mitili naturali (TC041M), non c’è un palese incremento di concentrazione dei composti

determinati.

Per quanto riguarda i PCB si osserva una concentrazione leggermente superiore nella stazione TC040M

dove troviamo una percentuale maggiore anche dei PCB “diossina –simili”.

Per quanto riguarda invece i pesticidi clorurati, in particolare i DDs e gli HCHs, notiamo una



concentrazione leggermente superiore nel campione di controllo.

Solo l’esaclorobenzene e l’aldrin, assenti nel campione di controllo sono stati rilevati in tracce nelle due

siti di trapianto.

Confronto tra la fase di bianco e la fase di cantiere relativo al bioaccumulo di policlorobifenili e

pesticidi clorurati.

Per il confronto dei dati di bioaccumulo tra la fase di bianco e la fase di cantiere relativo ai campioni di

mitili trapiantati nell’area del terminale, sono state messe in relazione la campagna di bianco di gennaio

2007 e la campagna di cantiere di dicembre 2008.

Confronto gennaio 2007 – dicembre 2008.

Le sommatorie dei PCBs, dei DDs e degli HCHs, le concentrazioni dell’HCB, dell’Aldrin e del Dieldrin

determinati nei campioni di Mytilus galloprovincialis per le due campagne, sono mostrate nelle figure

6.2.3.2.7-11.

Bianco - Gennaio 2007

0 5 10 15 20 25

TB039M

TB040M

TB041M

Staz

ion

i

ng/g p.s.Σ PCBs

Canriere - Dicembre 2008

0 7 14 22 29 36

TC039M

TC040M

TC041M

Staz

ion

i

ng/g p.s.Σ PCBs

Figura 6.2.3.2.7: Sommatoria dei PCB - Confronto tra fase di bianco gennaio 2007 e fase di cantiere dicembre 2008.


0 2 4 6 8 10

TB039M

TB040M

TB041M

Staz

ion

i

ng/g p.s.Σ DDs


0 2 4 6 8 10

TC039M

TC040M

TC041M

Staz

ion

i

ng/g p.s.Σ DDs

Figura 6.2.3.2.8: Sommatoria dei DDs - Confronto tra fase di bianco gennaio 2007 e fase di cantiere dicembre 2008.




0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5

TB039M

TB040M

TB041M

Staz

ion

i

ng/g p.s.Σ HCHs


0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5

TC039M

TC040M

TC041M

Staz

ion

i

ng/g p.s.Σ HCHs

Figura 6.2.3.2.9: Sommatoria degli HCHs - Confronto tra fase di bianco gennaio 2007 e fase di cantiere dicembre 2008.


0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

TB039M

TB040M

TB041M

Staz

ion

i

ng/g p.s.HCB


0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

TC039M

TC040M

TC041M

Staz

ion

i

ng/g p.s.HCB

Figura 6.2.3.2.10: Concentrazioni di HCB - Confronto tra fase di bianco gennaio 2007 e fase di cantiere dicembre 2008.


0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

TB039M

TB040M

TB041M

Staz

ion

i

ng/g p.s.Aldrin Dieldrin


0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

TC039M

TC040M

TC041M

Staz

ion

i

ng/g p.s.Aldrin Dieldrin

Figura 6.2.3.2.11: Concentrazioni di Aldrin e Dieldrin - Confronto tra fase di bianco gennaio 2007 e fase di cantiere dicembre 2008.

Dalla figura si nota come i PCBs determinati nella fase di cantiere siano, in assoluto, più alti di quelli

riscontrati nella fase di bianco ma, rispetto al relativo campione di controllo TC041M, la

concentrazione dei PCB nei campioni trapiantati è paragonabile.



Per i DDs non si evidenzia, invece, una grande differenza di concentrazione tra la campagna di cantiere

e quella di bianco sia per la stazione di controllo che per le stazioni del terminale.

Per gli esaclorocicloesani la situazione è inversa, ovvero la concentrazione nei campioni prelevati nella

fase di bianco è mediamente più alta di quella riscontrata nella fase di cantiere ma, così come per i

PCBs, i valori determinati nei due siti del terminale sono proporzionali a quelli della relativa stazione di

controllo.

Per quanto riguarda l’esaclorobenzene e il Dieldrin si nota una differenza tra le due campagne; nella

fase di cantiere nella stazione di controllo sono entrambi assenti e si evidenzia un bioaccumulo di HCB

e Dieldrin rispettivamente nelle stazioni TC039M e TC040M. Nella campagna di bianco erano invece

presenti sia nel controllo che nelle altre stazioni comunque nello stesso ordine di grandezza.

Infine, l’Aldrin non è mai stato rilevato in entrambe le campagne.



6.2.4 Composti Organostannici


La determinazione di composti organostannici (TBT – Tributilstagno, DBT – Dibutilstagno e MBT –

Monobutilstagno) nei campioni di biota è stata effettuata basandosi sulle metodiche adottate da Binato et

al. (1998) e Morabito et al. (1995, 2001). La procedura analitica consiste in una serie di fasi sequenziali:

estrazione, derivatizzazione, purificazione e infine determinazione analitica mediante analisi

gascromatografica accoppiata a un rivelatore a spettrometria di massa a trappola ionica (GC/MS/MS).

Al campione liofilizzato e omogeneizzato è stato aggiunto come standard interno TTBT

(tetrabutilstagno). Il campione è stato estratto in bagno a ultrasuoni con una soluzione di tropolone

0,05% p/v in metanolo, previa acidificazione. Il surnatante è stato separato mediante centrifugazione e

quindi sottoposto a estrazione con diclorometano, previa aggiunta di una soluzione di NaCl 10% p/v in

acqua Milli-Q. L’estratto è stato concentrato e quindi ripreso in n-esano. I solventi usati sono per analisi

di pesticidi residui. L’estratto è stato derivatizzato con reattivo di Grignard. Dopo eliminazione del

reattivo in eccesso, la fase organica è stata concentrata e purificata su colonnine riempite di Florisil.

L’eluato (n-esano) è stato concentrato a volume noto e iniettato in GC/MS/MS.

La determinazione analitica è stata effettuata mediante Gascromatografo accoppiato ad uno

Spettrometro di massa (GC/MS/MS).

Gascromatografo: modello TRACE GC (ThermoQuest)

Detector: Spettrometro di massa a trappola ionica modello PolarisQ (Thermofinnigan)

Per la quantificazione sono state utilizzate curve di calibrazione preparate con soluzioni standard di

TBT, di DBT e di MBT, con TTBT come standard interno. L’accuratezza della metodica è stata

valutata da analisi ripetute di materiale certificato di riferimento.

6.2.4.2 Risultati

I valori di concentrazione di TBT, di DBT e di MBT determinati nei campioni di mitili (Mytilus

galloprovincialis) prelevati nel corso della campagna di campionamento del dicembre 2008 sono elencati

nella tabella 6.2.4.2.1. Per ciascun composto, i dati di concentrazione riportati sono espressi sia come

rapporto della massa dell’analita come catione (rispettivamente (C4H9)3Sn+ per il TBT, (C4H9)2Sn2+ per il

DBT, (C4H9)Sn3+ per il MBT) per grammo di campione secco, che come rapporto della massa

dell’analita come stagno (Sn) per grammo di campione secco. Per ogni campione, ottenuto dall’unione

di tutte le parti molli di più individui, omogeneizzate e liofilizzate, sono state analizzate tre repliche.



Tabella 6.2.4.2.1: Concentrazioni di TBT, di DBT e di MBT nei Mytilus galloprovincialis. Valori espressi come concentrazioni sul peso secco (s.s.) – fase di cantiere.

TBT DBT MBT

ng Sn ng Sn ng Sn Stazione Replicato ng TBT g-1 p.s. g-1 p.s.

ng DBT g-1 p.s. g-1 p.s.

ng MBT g-1 p.s. g-1 p.s.

I 331 136 13 7 <6 <4 II 337 138 15 8 <6 <4 III 300 123 12 6 <6 <4

TC039M

media 323 132 13 7 <6 <4

I 307 126 16 8 <6 <4 II 313 128 17 9 <6 <4 III 350 143 16 8 <6 <4

TC040M

media 323 132 16 8 <6 <4

I 107 44 11 5 <6 <4 II 330 135 13 7 <6 <4 III 327 134 13 7 <6 <4

TC041M

media 255 104 12 6 <6 <4

Il TBT è stato rilevato in tutti i campioni analizzati di Mytilus galloprovincialis ed è sempre risultato il

composto butilstannico più abbondante. Il TBT è stato rilevato anche in tutti i campioni di controllo. Il

DBT è risultato sempre presente anche se nelle concentrazioni poco al di sopra del limite di

determinazione (8 ng DBT g-1 s.s., 4 ng Sn g-1 s.s.). Il MBT è risultato inferiore al limite di

determinazione (6 ng MBT g-1 s.s., 4 ng Sn g-1 s.s.) in tutti i campioni analizzati.

Nella Figura 6.2.4.2.1 è rappresentato l’andamento delle concentrazioni di TBT nei campioni di Mytilus

galloprovincialis nella campagna di dicembre 2008 (fase di cantiere) e nelle quattro campagne di fase di

bianco (valori medi per ogni stazione).



Variazioni temporali del TBT nei mitili

0

20

40

60

80

100

120

140

lug-

06

gen-

07

feb-

07

mar

-07

dic-

08

Data

ng S

n g-1 s

.s.

TC039 TC040 TC041 (controllo)

Figura 6.2.4.2.1: Concentrazioni di TBT in mitili. Stazioni TC039, TC040 e TC041 durante le quattro campagne di fase di bianco e durante la campagna di fase di cantiere del dicembre 2008. Valori espressi come ng Sn g-1 sul peso secco – fase di cantiere.

In ciascuna delle campagne confrontate, le concentrazioni di tributilstagno (TBT) rilevate nei mitili

sono risultate molto simili tra le due stazioni in vicinanza del Terminale (TC039 e TC040), mentre i

valori riscontrati nell’area di controllo (TC041) non hanno seguito lo stesso andamento. Rispetto ai

valori rilevati durate la fase di bianco, le concentrazioni di TBT nei campioni di dicembre 2008 risultano

significatamene più elevati sia nelle stazioni vicine al Terminale (132 ng Sn g-1 s.s.) sia nell’area di

controllo (104 ng Sn g-1 s.s.). Durante la fase di cantiere il dibutilstagno (DBT) è stato riscontrato in

tutti tre siti d’indagine, mentre durante la fase di bianco soltanto la stazione di controllo (TC041) in

marzo 2007 risultava inquinata da questo composto. Valori di concentrazione di DBT in dicembre 2008

(6 – 8 ng Sn g-1 s.s.) sono comunque comparabili con valore misurato durante l’ultima campagna della

fase di bianco (10 ng Sn g-1 s.s.)

In base al confronto tra le concentrazioni di composti organostannici nelle stazioni del Terminale

(TC039 e TC040) e nella stazione di controllo (TC041) rilevate durante la fase di cantiere e durante le

campagne di bianco, l’esistenza di differenze significative tra le due fasi del progetto indica che durante

attività di cantiere si è manifestato un accumulo di tributilstagno, e in misura ridotta di dibutilstagno, nei

mitili prelevati sia nell’area del Terminale sia nell’area di controllo a Portonovo.

Come è già stato osservato durante la fase di bianco, elevati valori di concentrazione di TBT durante i

mesi invernali possono essere causati da numerosi fattori, tra cui una minore degradazione dei composti

organostannici nella colonna d’acqua (bassa irradiazione solare e temperatura), e variazioni stagionali

nel metabolismo dei mitili, con un aumento del peso corporeo nel periodo primaverile-estivo, che



determina un effetto di diluizione delle concentrazioni dei composti organostannici, insieme a una più

attiva depurazione (Chandrinou et al., 2007), o anche variazioni nelle immissioni di contaminanti

nell’ambiente, tra cui una maggiore risospensione dei sedimenti.

Mentre le variazioni dei livelli di TBT osservate tra le quattro campagne della fase di bianco risultano

piuttosto limitate, con valori che rientrano comunque all’interno di un intervallo di concentrazioni

basse, relativamente a quanto riportato nella letteratura scientifica, nella fase di cantiere è stato

osservato un incremento da composti organostannici, non direttamente riconducibile all’attività di

cantiere del terminale in quanto i valori risultano paragonabili all’area di controllo. Non è da escludere

l’eventuale input di contaminazione determinato da apporti fluviali che potrebbe aver contribuito al

bioaccumulo di butilstannici nei mitili nel sito di controllo. Il bivalve Mytilus galloprovincialis è

ampiamente utilizzato nel biomonitoraggio dei composti organostannici. Alcuni studi pubblicati su

mitili provenienti dal bacino Adriatico riportano un ampio intervallo di concentrazioni, con valori di

TBT compresi tra 118 e 3456 ng Sn g-1 s.s. per aree marine costiere (Nemanic et al., 2002; Boscolo et al.,

2004) e tra 16 e 3290 ng Sn g-1 s.s. per ambienti lagunari, in particolare per la Laguna di Venezia (Binato

et al., 1998; Gallina et al., 2000; Bortoli et al., 2003; Boscolo et al., 2004; ARPAV, 2004). I livelli di TBT

determinati nei campioni di mitili dell’area di Terminale risultano comparabili con i valori citati e sono

indicativi di una situazione di contaminazione moderata.

La distribuzione relativa dei composti butilstannici determinati in Mytilus galloprovincialis mostra la

predominanza del TBT rispetto a DBT e MBT. La prevalenza del TBT sui prodotti di degradazione

segue l’andamento generalmente riscontrato negli studi pubblicati nella letteratura scientifica su questa

specie, a cui è attribuita una scarsa capacità di degradazione del TBT (Bortoli et al., 2003). Il DBT è

stato rilevato in tutti campioni analizzati durante la campagna di dicembre 2008, ma sempre con valori

poco superiori al limite di determinazione. Il rapporto TBT/DBT in tutte tre stazioni è tra 16,5 e 18,9

(sulla base delle concentrazioni espresse come Sn). La prevalenza del TBT rispetto agli altri composti

butilstannici può indicare sia la tipologia delle fonti di questi inquinanti nell’ambiente acquatico,

derivanti principalmente dall’impiego del TBT in vernici antivegetative, sia una presenza di immissioni

relativamente recenti nell’ambiente.

Nel complesso, quindi, sia le due stazioni dell’area del Terminale sia la stazione di controllo sono

risultate caratterizzate da un moderato grado di contaminazione di composti butilstannici.



6.2.5 Composti Organici Volatili (VOC)

Con la denominazione di Composti Organici Volatili (VOC) viene indicato un insieme di sostanze in

forma liquida o di vapore, con un punto di ebollizione che va da un limite inferiore di 50-100 °C a un

limite superiore di 240-260 °C. I composti che rientrano in questa categoria sono più di 300. La loro

presenza nell’aria è dovuta principalmente alla combustione incompleta dei combustibili fossili,

all’evaporazione di solventi e di carburanti ed alla combustione del materiale vegetale. Di questa

categoria fanno parte gli idrocarburi alogenati quali i derivati alogenati del metano e dell’etilene.


Sono stati analizzati in campioni di organismo marino i seguenti composti volatili organoalogenati:

Cloroformio, Tetracloruro di Carbonio, Tricloroetilene, Bromodiclorometano, Tetracloroetilene,

Bromoformio.

I campioni di organismo sono stati campionati in vials di vetro ambrato da 40 ml del tipo “EPA

Washed” con tappo a vite e setto in Silicone/Teflon a tenuta, contenente ancoretta magnetica e pre-

pesati. La matrice organica prelevata in quantità corrispondente a circa 10 grammi, è stata sminuzzata

rapidamente, posta nel vial, immediatamente sigillata e congelata.

Prima della determinazione, i vials sono stati ripesati ed il contenuto calcolato per differenza.

L’estrazione è stata effettuata addizionando il campione di 10 ml di acqua bidistillata “organic free” e

sonicando per 30 minuti alla temperatura di 40°C. Il vial viene quindi posto in un autocampionatore per

acque e sedimenti modello 4552 accoppiato ad un Purge and Trap “Eclipse” modello 4660 entrambi

della OI Analytical.

Il metodo prevede lo strippaggio dei composti volatili dal campione di organismo insufflando nel vial

Elio ad elevato grado di purezza per 11 minuti e scaldando alla temperatura di 60 °C. I composti

vengono trasferiti in fase gassosa ed intrappolati su una trappola “trifasica” (tenax/sigel/carbosieve), da

dove vengono successivamente desorbiti a 190°C sotto flusso di Elio ed inviati, sempre sotto corrente

di Elio, in testa alla colonna gas-cromatografica .

Il Gas Cromatografo è un Agilent Technologies 6890N accoppiato ad un rivelatore a Spettrometria di

massa 5973.

Lo strumento e le condizioni gas-cromatografiche utilizzate sono state le seguenti:

colonna DB624, lunghezza 30 m, D.I. 0,25 mm, Film Thickness 1.4 µm; gas di trasporto Elio flusso

0.9 ml/min a flusso costante. Iniettore split/splitless in modalità split alla temperatura di 200°C.



Temperatura del forno: isoterma a 35°C per 4 min., quindi rampa di 15°C/min. fino ad arrivare alla

temperatura finale di 150°C a cui resta per 3 minuti.

Il rivelatore è uno Spettrometro di Massa in modalità SIM.

L’identificazione dei composti è stata effettuata mediante confronto dei tempi di ritenzione dei picchi

incogniti con quelli degli standard e mediante confronto delle abbondanze relative degli ioni.

La determinazione quantitativa è stata effettuata per interpolazione da una curva di calibrazione a 5

punti ottenuta da miscele standard a concentrazioni variabili, che hanno subito la stessa procedura dei

campioni.

Il limite di quantificazione del metodo è pari a 0,05 ng/g per ciascun composto.

6.2.5.2 Risultati

L’analisi dei composti organici volatili Cloroformio, Tetracloruro di Carbonio, Tricloroetilene,

Bromodiclorometano, Bromoclorometano, Dibromoclorometano, Tetracloroetilene e Bromoformio, è

stata effettuata su pool di mitili appartenenti alla specie Mytilus galloprovincialis.

Sono state analizzate per ciascuna stazione due repliche, con l’eccezione della stazione TC039, per la

quale è stato possibile analizzare una sola replica.

I risultati delle determinazioni analitiche dei composti organici volatili alogenati prelevati nel corso della

campagna di campionamento sono mostrati in tabella 6.2.5.2.1. I risultati sono espressi in ng/g di peso

umido.

Le determinazioni analitiche hanno fornito valori di concentrazione sempre al di sotto dei limiti di

quantificazione del metodo applicato, pari a 0,05 ng/g, con l’unica eccezione del tetracloroetilene e del

bromodiclorometano nel campione di mitilo prelevato nella stazione TC040 con un valore pari al limite

di quantificazione.



Tabella 6.2.5.2.1: Concentrazione di composti organici volatili in Mytilus galloprovincialis – fase di cantiere - Dicembre 2008.

Stazione TC039M TC040M TC041M

u.m. ng/g ng/g ng/g ng/g ng/g

Replicato I I II I II CH2BrCl

Bromoclorometano <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 CHCl3

Cloroformio <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 CCl4

Tetracloruro di carbonio <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 C2HCl3

Tricloroetilene <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 CHBrCl2

Bromodiclorometano <0,05 <0,05 0,05 <0,05 <0,05 C2Cl4

Tetracloroetilene <0,05 0,05 <0,05 <0,05 <0,05 CH Br2Cl

Dibromoclorometano <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 CHBr3

Bromoformio <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05



6.3 Analisi microbiologiche

6.3.1 Materiali e metodi

I campioni prelevati per le analisi microbiologiche sono stati conservati in contenitori sterili a 4°C per

l’immediato trasferimento in laboratorio per le analisi. I metodi analitici adottati sono stati i seguenti:

per la determinazione dei coliformi fecali e delle salmonelle si sono seguite le metodiche ufficiali

riportate nel DM 31/07/95, per gli streptococchi fecali le metodiche ufficiali riportate in MPI/25-2004,

mentre per la determinazione dei coliformi totali si sono seguite le procedure validate dal ISS riportate

in ISTISAN 35/96-3.

Tabella 6.3.1.1: Microbiologia: metodiche di riferimento.

Parametro Metodo analitico Limite di quantificazione (g)Coliformi totali RAPPORTI ISTISAN 35/96-3 10 Coliformi fecali DM 31/07/95 200

Streptococchi fecali MPI-25-2004 10 Salmonella DM 31/07/95 -

6.3.2 Risultati

Nelle tabella 6.3.2.1 vengono riportati i risultati delle analisi microbiologiche effettuate in Mytilus

galloprovincialis nella fase di cantiere.

I risultati mostrano valori di concentrazione per i coliformi totali e fecali generalmente bassi o inferiori

al limite di quantificazione. Gli streptococchi fecali sono sempre al di sotto del limite di rilevabilità del

metodo. Non è stata registrata una contaminazione microbiologica da salmonella. Tabella 6.3.2.1: Risultati delle analisi microbiologiche in Mytilus galloprovincialis – fase di cantiere – Dicembre 2008.

Area Terminale – Mytilus galloprovincialis – Cantiere – Dicembre 2008

Stazione u.m. TC039M TC040M TC041M

Coliformi fecali MPN/100g <200 200 <200

Coliformi totali UFC/g <10 500 <10

Salmonelle A-P/25g assenti assenti assenti

Streptococchi fecali UFC/g <10 <10 <10

Capitolo 6 – Bioccumulo su Mytilus galloprovincialis · 2008, utilizzando un protocollo di...

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