UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PAVIA

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “L. Spallanzani”

Laurea Magistrale in Biotecnologie Industriali

Dipartimento di Scienze del Farmaco

Studio delle cinetiche di vinificazione di un vino

Bonarda dell’Oltrepò Pavese vinificato in purezza

Relatore: Prof.ssa Maria Daglia

Correlatore: Dott.ssa Alessandra Leoni

Tesi Sperimentale di Claudia Buscaglia

Anno Accademico 2013/2014

1

INDICE

1. INTRODUZIONE pag. 4

1.1 LA VITICOLTURA IN OLTREPO’ PAVESE pag. 5

1.2 CROATINA pag. 6

1.2.1 Riferimenti normativi pag. 6

1.2.2 Sinonimi pag. 6

1.2.3 Descrizione ampelografica di foglie e grappoli pag. 7

1.2.4 Fenomeni vegetativi pag. 7

1.2.5 Caratteristiche ed attitudini colturali pag. 8

1.2.6 Coltivazione pag. 8

1.3 I MICRORGANISMI DELL’UVA pag. 9

1.4 IL PROCESSO DI VINIFICAZIONE pag. 12

1.4.1 Fermentazione alcolica pag. 13

1.4.2 Fermentazione malolattica pag. 15

2. SCOPO DEL LAVORO pag. 17

3. MATERIALI E METODI pag. 20

3.1 CAMPIONE pag. 21

3.2 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE E DEI TERRENI pag. 21

3.2.1 Preparazione del campione per analisi chimiche pag. 21

3.2.2 Preparazione del campione per analisi microbiologiche pag. 21

3.2.3 Terreni e Tamponi pag. 22

2

3.3 APPARECCHIATURE E METODI pag. 22

3.3.1 Spettrofotometro pag. 22

3.3.2 Titolatore pag. 23

3.3.3 Analizzatore enologico pag. 23

3.3.4 Distillatore enologico pag. 24

3.3.5 Microscopio ottico pag. 24

3.3.6 Conta della concentrazione cellulare pag. 25

3.3.7 Protocollo di estrazione del DNA di lievito pag. 25

3.3.8 PCR pag. 26

3.3.9 Elettroforesi su gel di agarosio pag. 27

4. RISULTATI E DISCUSSIONE pag. 29

4.1 MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO

PREVENDEMMIALE pag. 30

4.1.1 Conta della concentrazione cellulare sui grappoli

di Croatina pag. 30

4.1.2 Riconoscimento di muffe e lieviti pag. 31

4.2 MONITORAGGIO CHIMICO PREVENDEMMIALE pag. 33

4.2.1 Zuccheri, pH e Acidità totale pag. 33

4.2.2 Il rame pag. 34

4.2.3 Il colore pag. 35

4.3 MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO E

CHIMICO DEL PROCESSO FERMENTATIVO pag. 37

4.3.1 Monitoraggio microbiologico pag. 37

4.3.2 Monitoraggio chimico pag. 39

4.4 ISOLAMENTO DEI CEPPI DI LIEVITO E

SELEZIONE DEL CEPPO DI Saccharomyces cerevisiae

STARTER pag. 44

3

4.4.1 Isolamento dei lieviti coinvolti nel processo fermentativo pag. 44

4.4.2 Selezione del ceppo starter pag. 45

4.5 PROVA DI MICROVINIFICAZIONE pag. 48

4.5.1 Pressatura dell’uva Croatina pag. 48

4.5.2 Inoculo della coltura starter pag. 48

4.5.3 Monitoraggio microbiologico pag. 49

4.5.4 Monitoraggio chimico pag. 54

5. CONCLUSIONI pag. 59

5.1 Conclusioni pag. 60

5.2 Prospettive future pag. 65

6. BIBLIOGRAFIA E SITOGRAFIA pag. 66

ALLEGATI pag. 68

4

1. INTRODUZIONE

5

1.1 LA VITICOLTURA IN OLTREPO’ PAVESE

Va in premessa richiamato il dato che l’Italia, con circa 45 milioni di hl di vino

prodotti, copre il 17% della produzione mondiale di vino. Un risultato frutto anche di

una crescita qualitativa, con circa il 60% di vini D.O.C., D.O.C.G. e I.G.T., da cui

discende un giro di affari stimabile attorno ai 13,5 miliardi di euro all’anno, con

l’aggiunta di oltre 2 miliardi di euro di indotto. In un contesto generale stimolante, va

registrato il costante consistente calo del consumo di vino in Italia, passato dai 45 litri

pro-capite all’anno nel 2007, ai 43 nel 2009 e con la prospettiva di scendere sotto i 40,

quando ancora negli anni ‘70 si sfioravano i 120 litri pro-capite. Le cause di questo

calo sono complesse e molteplici; tra queste sembra emergere la contrazione dei

consumi, come conseguenza immediata della crisi economica globale, e una pressione

mediatica caratterizzata anche da allarmismi sull’uso dell’alcool, che hanno accelerato

il cambio di stile di vita degli italiani [1].

L’Oltrepò Pavese si caratterizza per una forte connotazione agricola e per alcune

eccellenze agroalimentari costituite, innanzitutto, dal settore vitivinicolo [2]. La

viticoltura dell’Oltrepò Pavese è nota e apprezzata sin da tempi molto remoti e si è

specializzata fino a caratterizzarne il paesaggio collinare. Le fonti storiografiche

antiche concordano nell’attribuire l’inizio della coltivazione della vite, e

conseguentemente della vinificazione, ai Greci e agli Etruschi. E’ opinione fondata che

furono proprio gli Etruschi, nel corso della loro fase espansionistica nel VI secolo a.C.,

a portare la coltura della vite nella Pianura Padana. L’Oltrepò Pavese si caratterizza

quindi per un’antica e profonda vocazione vitivinicola che dura da più di duemila anni

e che, attraverso una lunga evoluzione, è giunta all’attuale conformazione: una

superficie di 1.098 chilometri quadrati, dei quali un terzo di pianura e due terzi di

collina e montagna; di questi il 30% circa appartiene alla zona di produzione D.O.C.,

con 13.600 ettari a vigneto pari al 13% circa dell’intera area dell’Oltrepò, di cui quasi

l’80% produce uva D.O.C. Molti e variegati sono i vini D.O.C. prodotti nell’area

oltrepadana: 8 tipologie di vini rossi, 2 di rosati, 11 di bianchi, 2 spumanti classici e 8

spumanti Charmat, per un totale di quasi 45 milioni di bottiglie prodotte annualmente

(di cui più di 11 milioni di Spumante), anche se quasi l’80% appartiene alle prime

quattro tipologie, nell’ordine Bonarda, Barbera, Riesling Italico e Pinot Nero [1].

6

Dal punto di vista vitivinicolo l’Oltrepò Pavese si distingue in Italia per l’importanza e

la peculiarità delle produzioni. Le colline dell’Oltrepò costituiscono la terza area di

produzione di vini certificati in Italia per numero di ettari a vite iscritti all’Albo

Vigneti (dopo il Chianti e l’Astigiano) e per ettolitri prodotti e il primo bacino

vitivinicolo della Lombardia (con il 63% della superficie vitata produce il 55% del

vino dell’intera regione). I vitigni più coltivati sono Croatina (4.000 ettari), Barbera

(3.000), Pinot Nero (quasi 3.000), Riesling (1.500), Moscato (500). Con questi vitigni

si copre l’84% dell’intera superficie viticola dell’Oltrepò. La produzione di Pinot

Nero in Oltrepò rappresenta circa il 75% dell’intera produzione nazionale del vitigno,

così come la Croatina rappresenta circa il 70% dell’intera produzione nazionale [3].

La viticoltura oltrepadana si trova oggigiorno ad affrontare le attuali sfide del settore,

tra cui la richiesta da parte di un sempre maggior numero di consumatori di prodotti di

qualità e nei quali sia riconoscibile il legame con il territorio di origine [2].

1.2 CROATINA

1.2.1 Riferimenti normativi

Nome: Croatina N.

Codice: 071

Sinonimi ufficiali: Croatina N.

Annotazioni: Esclusivamente per la designazione dei vini delle DOP Oltrepò Pavese e

Colli Piacentini

Data di ammissione: 25/05/1970, decreto pubblicato sulla G.U. 149 del 17/06/1970

[4].

1.2.2 Sinonimi

Il nome “Croatina” subisce nella pratica varie deformazioni, che non sono proprie di

determinate zone e località, ma derivano evidentemente da pronunce individuali

diverse. In Oltrepò Pavese sono in uso il nome “Croatina” e alcune sue varianti (o

taluna delle sue varianti): “Crovattina, Croattina, Croata, Crovattino, Croatino,

7

Crovalino, Crovettina”, ecc. Sono utilizzati anche i sinonimi “Neretto” per l’Oltrepò

Pavese e “Uva Vermiglia” per Voghera [4].

1.2.3 Descrizione ampelografica di foglie e grappoli

Le foglie sono di media grandezza, pentagonali, più lunghe che larghe, quinquelobate

o trilobate. La pagina superiore delle foglie è glabra, mentre quella inferiore è

aracnoidea, con le nervature di 1°-2°-3° ordine aracnoidee. Il lembo risulta alquanto

piegato a coppa, con superficie liscia o molto lievemente ondulata. I lobi sono un po’

contorti. L’angolo alla sommità dei lobi terminali è acuto. I denti laterali sono

sensibilmente regolari a due grandezze, prevalentemente convessi oppure rettilinei, a

base larga. Il colore risulta verde cupo sulla pagina superiore (che presenta una

lucentezza opaca), con nervature principali più chiare, verde chiaro sulla pagina

inferiore, con nervature principali sfumate di rosso all’inserzione sul picciolo. Il

picciolo è corto o medio-corto. In autunno le foglie assumono una colorazione

dapprima verde con larghe chiazze di color rosso vinoso, poi rossa e gialla.

Il grappolo maturo è grande (20-25 cm), conico, alato, di media compattezza o

compatto. Il peduncolo è di lunghezza media (circa un terzo della lunghezza del

grappolo), semi-legnoso, piuttosto grosso, ben visibile. Presenta pedicelli medio-corti,

di color rosso feccioso; cercini evidenti, di color rosso violaceo; e pennelli corti ed

incolori. L’acino è medio, di forma sferoide o appena visibilmente ellissoidale,

regolare, con sezione trasversale circolare e ombelico non persistente. La buccia è

abbastanza pruinosa, di color turchino regolarmente diffuso, piuttosto spessa,

consistente e coriacea. Il succo è incolore; la polpa succosa, a sapore semplice. I

vinaccioli sono solitamente due per acino e sono sempre presenti [4].

1.2.4 Fenomeni vegetativi

Germogliamento: generalmente nella terza decade di Aprile.

Fioritura: verso il 20 Giugno.

Invaiatura: verso il 15-18 Agosto.

Lignificazione: verso il 5 Agosto.

Maturazione dell’uva: fra la I e la IV epoca, nella prima decade di Ottobre.

Caduta delle foglie: dalla fine di Ottobre alla metà di Novembre [4].

8

1.2.5 Caratteristiche ed attitudini colturali

La “Croatina” presenta molta vigoria, richiedendo una potatura lunga e ricca; una

produzione generalmente abbondante e una resistenza abbastanza notevole all’oidio e

al marciume dell’uva in annate non molto piovose ed una resistenza non superiore al

comune alla peronospora, mentre teme le tignole.

L’uva Croatina viene utilizzata essenzialmente per la vinificazione. Tuttavia, dato il

suo sapore zuccherino e dato che, per la sua resistenza al marciume, si conserva bene,

trova anche un buon impiego per il consumo diretto [4].

1.2.6 Coltivazione

La coltivazione è consigliata in Piemonte e idonea in Lombardia, Emilia-Romagna,

Sardegna e nella provincia di Verona.

La varietà è ammessa nelle seguenti denominazioni di origine e/o indicazioni

geografiche:

- DOC: Bonarda dell'Oltrepò Pavese, Bramaterra, Buttafuoco dell'Oltrepò

Pavese o Buttafuoco, Casteggio, Cisterna d'Asti, Colli di Parma, Colli

Piacentini, Colli Tortonesi, Colline Novaresi, Coste della Sesia, Gutturnio,

Oltrepò Pavese, Piemonte, San Colombano al Lambro o San Colombano,

Sangue di Giuda dell'Oltrepò Pavese o Sangue di Giuda, Valli Ossolane.

- IGT: Alto Mincio, Barbagia, Bergamasca, Colli del Limbara, Collina del

Milanese, Delle Venezie, Emilia o dell'Emilia, Forlì, Isola dei Nuraghi,

Marmilla, Nurra, Ogliastra, Parteolla, Planargia, Provincia di Mantova,

Provincia di Nuoro, Provincia di Pavia, Quistello, Ravenna, Romangia, Ronchi

Varesini, Rubicone, Sabbioneta, Sebino, Sibiola, Terrazze Retiche di Sondrio,

Terre Lariane, Tharros, Trexenta, Vallagarina, Valle del Tirso, Valli di Porto

Pino, Veneto, Verona o Provincia di Verona o Veronese.

L’evoluzione della superficie vitata dal 1970 ad oggi, rilevata dai censimenti ISTAT

(dati espressi in ettari) è apprezzabile nella seguente tabella [4]:

9

Anno Superficie vitata in ettari

1970 5250

1982 5802

1990 4487

2000 3280

2010 5684

Tabella 1.1 Superficie coltivata a Croatina

Figura 1.1 Fotografie del vitigno

La figura mostra, a titolo d’esempio, la foto di una foglia di Croatina, a sinistra, e di un

grappolo di Croatina, a destra.

1.3 I MICRORGANISMI DELL’UVA

La vite e i grappoli d’uva presentano una complessa ecologia microbica che include

funghi filamentosi, lieviti e batteri con differenti caratteristiche fisiologiche ed effetti

sulla produzione di vino [5].

I grappoli d’uva rappresentano la prima fonte di comunità microbiche, coinvolte in

modo prominente nella qualità del frutto, nel processo di vinificazione e nella qualità

finale dei vini. La superficie dei grappoli fornisce un ambiente ricco di nutrienti per i

microrganismi, che cambiano durante il processo di maturazione dell’uva [6].

10

Alcune specie di microrganismi si ritrovano solo sulla pianta, come i microrganismi

responsabili delle patologie della vite (tra cui i funghi parassiti fitopatogeni e i funghi

saprofiti), mentre altre hanno la capacità di sopravvivere e crescere anche nei vini e

costituiscono il consorzio microbico del vino (Wine Microbial Consortium WMC).

Questo consorzio comprende specie di lievito, i batteri acido lattici e i batteri acido

acetici [5].

I microrganismi presenti sull’uva possono essere suddivisi in diversi gruppi in accordo

alla specificità tecnologica che hanno sia sulla vite, sia nella produzione di vino. La

vite e i grappoli d’uva possono essere colpiti da diverse patologie, di cui le più

conosciute sono la peronospora (Plasmopara viticola), l’oidio (Erysiphe necator), e la

muffa grigia (Botrytis cinerea), che vengono controllate attraverso applicazioni

fitochimiche preventive. Inoltre, i grappoli d’uva possono essere colonizzati da muffe

saprofite (Cladosporium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp.) responsabili di

diversi marciumi del grappolo e della produzione di micotossine. I funghi finora citati

non hanno alcuna capacità di crescere nei vini e il loro effetto sulla qualità dei vini è

dovuto unicamente al livello di danno apportato al frutto. Contrariamente, i

microrganismi del WMC sono in grado di vivere e crescere nei vini. Le specie

appartenenti al WMC possono essere suddivise in tre gruppi:

- Le specie facilmente controllabili o innocue, senza la capacità di danneggiare il

vino quando sono applicate le good manufacturing practises (GMP’s). Queste

specie includono i basidiomiceti che non sono in grado di fermentare gli

zuccheri del succo d’uva né di sopravvivere nel vino e il fungo dimorfo

ascomicete Aureobasidium pullulans.

- Le specie fermentanti, responsabili della conversione degli zuccheri e

dell’acido malico. Appartengono a questo secondo gruppo le specie di

ascomiceti ossidative debolmente fermentanti o fermentanti (Candida spp.,

Kloeckera apiculata/Hanseniaspora uvarum, Metschnikowia spp., Pichia spp.)

presenti nelle fasi di pre-fermentazione o all’inizio del processo fermentativo.

Tra queste i lieviti apiculati e i lieviti formanti film (come Pichia spp.) sono

considerati dei comuni contaminati dei grappoli, del succo e del vino, con la

capacità di produrre sapori cattivi. I lieviti fermentanti includono quelli

responsabili del processo fermentativo tra questi Saccharomyces cerevisiae è il

11

più importante, ma altre specie (S. bayanus, S. pastorianus e S.paradoxus)

possono condurre o partecipare al processo.

- Le specie dannose in sensu stricto, responsabili delle alterazioni del vino anche

quando sono applicate le GMP’s. Tra queste si ritrovano le specie responsabili

della produzione di sapori cattivi (per esempio Dekkera bruxellensis) o della

formazione di sedimenti e intorbidamenti (per esemoio Zygosaccharomyces

bailii).

Per quanto concerne i batteri, i batteri acido acetici sono considerati innocui in quanto

sono facilmente controllabili in GMP’s. Mentre i batteri acido lattici sono più difficili

da collocare: tra questi troviamo Oenococcus oeni che è il principale responsabile della

fermentazione malolattica e specie di Lactobacillus e Pediococcus che possono essere

responsabili di fermentazioni spontanee e possono in alcuni casi risultare dannose [5].

La comunità microbica dei grappoli è influenzata da diversi fattori sia biotici, sia

abiotici: il pH dei frutti, i livelli di composti contenenti carbonio e azoto, le piogge, la

temperatura, lo stadio di maturazione della vite e il suo stato di salute [6].

La popolazione dei lieviti sui grappoli d’uva è approssimativamente compresa tra 102 e

104 cellule/g. I grappoli d’uva sani sono colonizzati principalmente da specie di

Candida e Pichia ubiquitarie e altamente eterogenee. In generale, è possibile

suddividere i lieviti e i batteri appartenenti al WMC in tre gruppi:

- I lieviti basidiomiceti ossidativi oligotrofici, i funghi simili ai lieviti A.

pullulans e i batteri acido lattici (Lactobacillus spp., O. oeni). Si tratta di

specie ubiquitarie favorite da un ambiente povero di nutrienti e dalla presenza

di grappoli sani.

- I lieviti ascomiceti ossidativi copiotrofici (molte specie di Candida), i lieviti

apiculati debolmente fermentanti (Hanseniaspora spp.), i lieviti formanti film

(Pichia spp.) e i lieviti fermentanti (C. zemplinina, Metschnikowia spp.).

Queste specie aumentano durante il processo di maturazione della vite a

causa dell’aumento della disponibilità di nutrienti.

- I lieviti copiotrofici fortemente fermentanti (Saccharomyces spp.,

Torulaspora spp., Zygosaccharomyces spp., Lachancea spp. e Pichia spp.) e i

batteri acido acetici aerobi obbligati (Gluconobacter spp.,

Gluconoacetobacter spp., Acetobacter spp.). La proliferazione di questo terzo

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gruppo di lieviti è direttamente correlata a un aumento della disponibilità di

nutrienti risultante da un danno nel grappolo d’uva. Le specie di

Saccharomyces sono tuttavia presenti in piccole quantità e con una frequenza

bassa anche in presenza di grappoli danneggiati e un loro isolamento

necessita l’utilizzo di tecniche di arricchimento. [5].

1.4 IL PROCESSO DI VINIFICAZIONE

La vinificazione è una delle più antiche tecnologie applicate dall’uomo e oggi

rappresenta uno dei più prosperosi processi biotecnologici utilizzati. La vinificazione è

il risultato di una serie di trasformazioni biochimiche portate avanti dall’azione di

differenti enzimi appartenenti a diversi microrganismi: i lieviti e i batteri [7].

La vinificazione è un complesso processo microbico nel quale lieviti e batteri giocano

un ruolo fondamentale. Dopo la pigiatura, i lieviti, in particolare S. cerevisiae,

consumano lo zucchero del mosto per produrre etanolo durante la fermentazione

alcolica. In seguito, i batteri acido lattici, in particolare O. oeni, convertono l’acido

malico in acido lattico durante la fermentazione malolattica. Entrambi, lieviti e batteri,

producono aromi responsabili delle proprietà sensoriali del vino. Quando entrambe le

fermentazioni sono completate, le popolazioni microbiche devono essere ridotte perché

i metabolismi microbici post-fermentativi possono pregiudicare le qualità

organolettiche del vino. È molto importante monitorare la presenza di questi

microrganismi sulla buccia dei grappoli d’uva, nel mosto in fermentazione,

nell’equipaggiamento utilizzato per la vinificazione e nella fase di invecchiamento del

vino [8].

Le tappe classiche della vinificazione in rosso sono le seguenti:

- Operazioni meccaniche sulle uve – pigiatura, diraspatura, riempimento della

vasca;

- Fermentazione – fermentazione alcolica principale e macerazione;

- Svinatura – separazione del vino dalle vinacce per sgrondatura e pressatura;

- Fermentazioni di completamento – esaurimento degli ultimi grammi di

zucchero con la fermentazione alcolica e fermentazione malolattica [9].

13

1.4.1 Fermentazione alcolica

La trasformazione più importante che avviene nel mosto durante il processo di

vinificazione è la fermentazione alcolica degli zuccheri, in particolare degli esosoi

(glucosio e fruttosio), che porta alla produzione di etanolo e diossido di carbonio e alla

formazione di un elevato numero di sottoprodotti. La fermentazione può essere

condotta utilizzando i lieviti indigeni presenti naturalmente sui grappoli d’uva oppure

aggiungendo lieviti selezionati a mosti leggermente solfitati. Negli ultimi anni,

quest’ultima pratica risulta la più applicata. Nelle fasi iniziali della fermentazione,

differenti specie di lieviti indigeni presenti nei grappoli apportano un contributo

importante. Le specie predominanti appartengono ai generi Brettanomyces, Candida,

Cryptococcus, Debaromyces, Dekkera, Hanseniaspora, Hansenula, Kloechera,

Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Torulaspora, Schizosaccharomyces e

Zygosaccharomyces. Con l’avanzamento della fermentazione, queste specie dette

“non-Saccharomyces” muoiono, lasciando spazio alla specie S. cerevisiae, più

tollerante all’etanolo, di predominare e completare il processo fermentativo [7].

Un elevato numero di studi ha messo in luce i diversi fattori che influenzano la

fermentazione, limitando la crescita e l’attività metabolica dei lieviti:

- I fattori della vinificazione, come la temperatura di vinificazione, il pH e la

concentrazione degli zuccheri nel succo d’uva;

- La disponibilità limitata dei nutrienti;

- L’effetto inibitorio dell’etanolo che può rappresentare un fattore di stress

chimico;

- Altri fattori di stress, quali la presenza di elevati livelli di SO2 e CO2, la

presenza di microrganismi competitivi come alcune specie di batteri acido

acetici o di lieviti killer produttori di tossine killer.

I principali meccanismi biochimici del metabolismo del lievito durante la

fermentazione alcolica sono riassunti nella Figura 1.2. Quando la concentrazione di

zucchero è elevata, come nel mosto, S. cerevisiae può metabolizzare unicamente

attraverso la via fermentativa. La trasformazione del glucosio in etanolo avviene

attraverso la glicolisi, con la produzione di piruvato, che è in seguito trasformato in

etanolo e CO2 da due addizionali reazioni enzimatiche. In condizioni anaerobiche, una

piccola frazione degli zuccheri del mosto, approssimativamente l’8%, è trasformata in

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glicerolo e piruvato attraverso la fermentazione gliceropiruvica. Durante il processo

fermentativo, i lieviti producono, a partire dal piruvato, una serie di composti volatici

che vanno a costituire il cosiddetto “bouquet di fermentazione”: tra questi i principali

sono gli alcoli superiori, gli acidi grassi, le aldeidi e gli esteri. Inoltre, vengono a

formarsi dei prodotti indesiderati, quali H2S e altri composti solforici volatili, i diacetili

e altri composti carbonilici correlati e anche alcuni composti fenolici volatili

indesiderati: si tratta di composti aromatici considerati negativi o sgradevoli [7].

Figura 1.2 Rappresentazione schematica dei principali meccanismi biochimici del

metabolismo dei lieviti durante la fermentazione alcolica.

15

1.4.2 Fermentazione malolattica

La fermentazione malolattica è condotta da batteri acido lattici e solitamente avviene

pochi giorni dopo la fermentazione alcolica. Si tratta di un processo molto importante,

perché cambia la composizione del vino e ne migliora le qualità organolettiche. Il

principale effetto della fermentazione malolattica è la riduzione dell’acidità totale del

vino e l’aumento del suo pH, come risultato della decarbossilazione dell’acido L-

malico in acido L-lattico. Inoltre, l’attività dei batteri gioca un ruolo importante nella

stabilizzazione del vino e ne assicura un arricchimento nella composizione aromatica.

Tutto l’acido malico, che rappresenta il più importante acido organico del vino insieme

all’acido tartarico, è degradato. Oltre a ridurre l’acidità totale del vino, la

fermentazione malolattica produce un cambiamento delle caratteristiche

organolettiche, perché il sapore più pungente dell’acido malico è rimpiazzato dal

sapore più delicato dell’acido lattico. I batteri acido lattici associati ai mosto d’uva e ai

vini appartengono a quattro generi: Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus e

Pediococcus, ma nella maggior parte dei casi la fermentazione malolattica è condotta

da O. oeni [7].

Alcuni batteri acido lattici possono diminuire la qualità del vino ed essere considerati

dannosi. Questo avviene:

- Se la fermentazione malolattica è condotta in presenza di zuccheri. In queste

condizioni, i batteri possono metabolizzare gli esosi producendo, oltre ad

etanolo e CO2, anche acido acetico, aumentando considerevolmente l’acidità

del vino.

- Se producono acroleina, che può reagire con i tannini e produrre un sapore

amaro sgradevole.

- Se sintetizzano polisaccaridi extracellulari a partire dagli zuccheri residui,

portando ad un deterioramento del vino.

- Se producono il cosiddetto “mousy off-flavour”.

- Se portano alla formazione di composti dannosi per la salute, quali

l’etilcarbammato e le amine biogene [7].

Il controllo della fermentazione può essere fatto determinando le cellule vitali di lievito

per conteggio, dopo 48 ore di crescita, delle colonie formate dopo spatolamento di 100

16

μl della soluzione di lievito opportunamente diluita su un mezzo nutritivo solido in una

piastra Petri. Oltre al controllo microbiologico, è possibile seguire la fermentazione

con determinazioni chimiche più semplici e immediate, quali la quantità di zuccheri

consumati nel caso della fermentazione alcolica e quella di acido malico consumato

nel caso della fermentazione malolattica [9].

Il monitoraggio dei ceppi di S. cerevisiae coinvolti nel processo fermentativo può

essere condotto utilizzando un’amplificazione delle sequenze delta del DNA del lievito

attraverso PCR. Si tratta di un metodo semplice, ceppo-specifico e riproducibile [10].

17

2. SCOPO DEL LAVORO

18

La presente ricerca, oggetto della tesi, è stata sviluppata durante il tirocinio svolto

presso il laboratorio di analisi di Riccagioia S.C.p.A., Centro di Ricerca, Formazione e

Servizi della Vite e del Vino.

Lo scopo della ricerca è stato lo studio sul campo dell’andamento prevendemmiale del

vitigno Croatina e il successivo monitoraggio delle uve da esso derivate durante la fase

di fermentazione spontanea del mosto ottenuto, fino al completamento del processo di

vinificazione. Questo studio ha portato all’identificazione dei principali fattori che

partecipano e influenzano il processo fermentativo.

È stato pertanto necessario suddividere il presente lavoro di tesi in due parti: una fase

prevendemmiale e una fase fermentativa, i campioni provenienti da entrambe le fasi

sono stati sottoposti a monitoraggio costante, effettuato tramite analisi chimiche e

microbiologiche. Durante il monitoraggio microbiologico della fase fermentativa sono

stati isolati i lieviti implicati nel processo di fermentazione. I ceppi di lievito

individuati sono stati conservati come colture pure glicerinate, mantenute alla

temperatura controllata e costante di –80°C, e tra questi è stato scelto un ceppo di

Saccharomyces cerevisiae che è stato in seguito utilizzato come starter per una prova

di microvinificazione. Le analisi chimiche e microbiologiche sono state effettuate sul

vino sottoposto a microvinificazione e i risultati ottenuti sono stati comparati con

quelli ottenuti dalla fermentazione di tipo spontaneo.

L’obiettivo di questo lavoro è stato pertanto quello di seguire in modo costante e

dettagliato l’andamento dell’uva Croatina dal campo, all’ottenimento del mosto

sottoposto a fermentazione fino ad arrivare al completamento del processo di

vinificazione, andando ad analizzare due vini: il primo ottenuto con una fermentazione

spontanea e il secondo con una fermentazione indotta (inoculando un ceppo di S.

cerevisiae indigeno); e cercando di ottenere dei prodotti finiti di Bonarda dell’Oltrepò

Pavese. Si è inoltre testata la capacità di un lievito indigeno selezionato, naturalmente

presente sull’uva, di portare a termine la vinificazione. L’utilizzo di un lievito

autoctono può essere visto come un modo di valorizzazione del prodotto, in quanto

marcatore di tipicità del vino oggetto di studio.

L’ottenimento di vini finiti è necessario per poter effettuare in seguito eventuali analisi

sui composti nutraceutici presenti, confrontando un vino sottoposto a processo di

19

macerazione (vino fermentato spontaneamente) a uno ottenuto da un mosto privo di

bucce e, quindi, non macerato (vino sottoposto a microvinificazione).

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3. MATERIALI E METODI

21

3.1 CAMPIONE

Le analisi chimiche e microbiologiche sono state effettuate su uva di qualità Croatina,

proveniente da un vigneto controllato a partire dalla fase di invaiatura dell’uva (dal 26

Agosto 2014) e sono state portate avanti per un mese. I campionamenti sono stati fatti

a cadenza settimanale fino al giorno della vendemmia (avvenuta il 24 Settembre 2014).

Le analisi di monitoraggio sono continuate sul mosto in vinificazione, ottenuto

dall’uva Croatina in purezza, per tutta la durata della fermentazione di tipo spontaneo

avvenuta con processo di macerazione. I campionamenti, nella fase di fermentazione,

sono stati fatti ogni 48 ore nelle prime fasi del processo fermentativo e

successivamente a cadenza settimanale. A partire dal 31 Ottobre 2014 sono state

effettuate ogni 48 ore le analisi su 10 l di mosto, ottenuto da uva Croatina non

macerata, sottoposto al processo di microvinificazione indotto con l’inoculo di un

ceppo starter selezionato di Saccharomyces cerevisiae.

3.2 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE E DEI TERRENI

3.2.1 Preparazione del campione per analisi chimiche

I grappoli sono campionati in sacchetti di plastica e pigiati direttamente all’interno dei

sacchetti per ottenere il mosto da sottoporre alle analisi successive. Il mosto in

vinificazione è campionato in bottigliette di plastica e sottoposto a filtrazione prima di

essere analizzato. All’inizio del processo fermentativo, il mosto, risultato molto

torbido, è stato centrifugato a 2500 rpm per 3 minuti prima di procedere con le analisi.

Per le analisi in Wineflow il mosto di Croatina che ha subito il processo di

macerazione è stato decolorato a contatto con il carbone, in quanto si tratta di un vino

rosso, e successivamente filtrato per eliminare i residui di carbone.

3.2.2 Preparazione del campione per analisi microbiologiche

I grappoli e il mosto di Croatina sono campionati in sacchetti di plastica sterili. Il

campionamento viene eseguito cercando di mantenere il più possibile una condizione

di sterilità. I grappoli vengono pigiati manualmente direttamente all’interno del

sacchetto e il mosto ottenuto per pigiatura, come quello già in vinificazione, viene

opportunamente diluito con acqua peptonata (la cui composizione è descritta nel

22

paragrafo 3.2.3) per poter essere piastrato. Tutte le procedure microbiologiche sono

svolte sotto cappa utilizzando materiali sterili.

3.2.3 Terreni e Tamponi

- Composizione dell’Acqua peptonata (g/l) e relativo valore di pH: Triptone

10,0 g/l, NaCl 5,0 g/l, Acqua distillata q.b., pH 7,2.

- Composizione del terreno Yeast Extract Peptone Dextrose (YEPD) Agar

(g/l) e relativo valore di pH: Estratto di lievito 10,0 g/l, Peptone 20,0 g/l,

Glucosio 20,0 g/l, Agar 15,0 g/l, Acqua distillata q.b., pH 5,5.

- Composizione del mezzo colturale Yeast Extract Peptone Dextrose (YEPD)

(g/l) e relativo valore di pH: Estratto di lievito 10,0 g/l, Peptone 20,0 g/l,

Glucosio 20,0 g/l, Acqua distillata q.b., pH 5,5.

- Composizione del terreno Wallister’s Laboratory (WL) Nutrient Agar

(mg/l) e relativo valore di pH: Estratto di lievito 4000,0 mg/l, Caseina

idrolizzata 5000,0 mg/l, Glucosio 50000,0 mg/l, Potassio diidrogenofosfato

550,0 mg/l, Cloruro di potassio 425,0 mg/l, Cloruro di calcio 125,0 mg/l,

Solfato di magnesio 125,0 mg/l, Cloruro di ferro 2,5 mg/l, Verde di bromo

cresolo 22,0 mg/l, Agar 17000,0 mg/l, Acqua distillata q.b., pH 5,5.

I terreni e i tamponi vengono sterilizzati in autoclave a 120°C per 30 minuti. I terreni,

una volta sterilizzati, vengono piastrati sotto cappa su piastre Petri con un diametro di

90 mm e lasciati solidificare.

3.3 APPARECCHIATURE E METODI

3.3.1 Spettrofotometro

Lo strumento utilizzato è Lambda 35 UV/VIS Spectrometer (Perkin Elmer). L’analisi

del colore sul mosto e sul vino è stata svolta tramite spettrofotometria a doppio raggio.

23

L’analisi del campione è fatta applicando il programma Wine color analysis, che

sottopone il campione a una scansione da 780 nm a 380 nm. Il campione di vino è

caricato in cuvettes di quarzo e analizzato contemporaneamente al bianco (costituito da

acqua distillata). Lo strumento misura i valori di assorbanza a 420, 520 e 620 nm e i

valori L*, a* e b*, che, inseriti in programmi di calcolo reperibili online [11, 12],

permettono il calcolo della componente di rosso (R), verde (G) e blu (B) presente nel

campione.

3.3.2 Titolatore

Lo strumento utilizzato è T 50 (Mettler Toledo). Il titolatore automatico ha permesso

l’analisi del pH del mosto, effettuata su circa 40 ml di mosto a una temperatura

controllata di 20°C, e l’analisi dell’acidità totale in acido tartarico espressa in g/l.

Quest’ultima è stata effettuata su 10 ml di mosto a cui sono aggiunti 60 ml di acqua

distillata e usando NaOH 0,1 M come titolante. Sul vino in fase di affinamento sono

state valutate la solforosa libera e la solforosa totale (derivata dalla somma della

solforosa libera con la solforosa combinata, costituita dalla SO2 legata ai composti

organici che entrano nella composizione del vino) espresse in mg/l. La misura è stata

effettuata con una titolazione potenziometrica: è stato aggiunto a 50 ml di vino una

piccola quantità di ioduro di potassio KI come catalizzatore e si è poi proceduto con la

titolazione utilizzando dello iodio I2 0,01 N come titolante. La determinazione

dell’acidità totale è avvenuta applicando il metodo ufficiale previsto dall’OIV e

descritto nel Compendium dei metodi internazionali di analisi, alla sezione acidità

totale [13], e recepiti in Gazzetta ufficiale (G.U.) dell’Unione europea C 43/1 del

19/02/2010.

3.3.3 Analizzatore enologico

L’analizzatore enologico utilizzato è il Wineflow (Gibertini), che permette l’analisi del

contenuto in g/l di Glucosio/Fruttosio e di Acido L-Malico. Le analisi sono condotte

utilizzando dei reattivi enzimatici che sfruttano l’assorbanza nell’UV per effettuare la

reazione NAD → NADH e sono forniti dalla stessa ditta dello strumento. Il vino viene

opportunamente diluito utilizzando l’Enodil, una soluzione idroalcolica, come

diluente: il fattore di diluizione è in funzione del limite di linearità del metodo che si

24

vuole eseguire e della concentrazione attesa del campione. Il limite di linearità dello

strumento è di 5,0 g/l nel caso dell’Acido L-Malico 0-5 e di 4,0 g/l nel caso di

Glucosio/Fruttosio. Sul vino in fase di affinamento sono state svolte le analisi per

valutare il contenuto in Acido L-Lattico e in Acido Acetico (come espressione

dell’acidità volatile), entrambi espressi in g/l. La procedura di analisi ha comportato

l’utilizzo di reattivi enzimatici forniti dalla Gibertini e ha previsto le stesse accortezze

descritte sopra. Le analisi si sono svolte applicando il metodo ufficiale previsto

dall’OIV e descritto nel Compendium dei metodi internazionali di analisi, alle sezioni

Acido L-Malico, Glucosio e fruttosio e Acido Lattico [13], e recepiti in G.U.

dell’Unione europea C 43/1 del 19/02/2010.

3.3.4 Distillatore enologico

Lo strumento utilizzato è il Super Dee (Gibertini), che ha permesso la determinazione

del titolo alcolometrico volumico (TAV) effettivo nei vini in fermentazione. Il vino

viene distillato dopo aggiunta di 4 gocce di silicone, usato come agente antischiuma, e

circa 10 ml di calcio ossido 2M (120 g/l), che previene l’eventuale distillazione di

composti acidi volatili. La soluzione idroalcolica che si ottiene, è analizzata per

determinare il contenuto alcolico del vino e la sua densità tramite l’utilizzo di una

bilancia idrostatica. La bilancia idrostatica di cui il laboratorio è fornito è Super

Alcomat (Gibertini). La determinazione del TAV è avvenuta applicando il metodo

ufficiale previsto dall’OIV e descritto nel Compendium dei metodi internazionali di

analisi, alla sezione grado alcolico per volume [13], e recepiti in G.U. dell’Unione

europea C 43/1 del 19/02/2010.

3.3.5 Microscopio ottico

I microrganismi isolati durante la fase prevendemmiale sui grappoli d’uva e i lieviti

isolati durante la fase fermentativa, sono stati osservati al microscopio utilizzando un

ingrandimento di 40X, ideale per visualizzare lieviti e muffe. Sono state inoltre scattate

delle foto di come appaiono le colonie al microscopio grazie alla presenza di una

videocamera, collegata a un computer, posta tra l’obiettivo e le lenti oculari.

25

3.3.6 Conta della concentrazione cellulare

Per la conta della concentrazione cellulare è stato applicato il metodo ufficiale

riconosciuto nel Compendium dei metodi internazionali di analisi dell’OIV, alla

sezione analisi microbiologiche di vini e mosti [13].

I campioni sono diluiti opportunamente dapprima con acqua peptonata e in seguito 100

μl di campione sono distribuiti uniformemente per spatolamento su terreno WL

Nutrient Agar.

Per il calcolo della concentrazione cellulare si contano sulle piastre, incubate per 48

ore a una temperatura costante e controllata di 25 ± 2°C, le unità formanti colonie

(UFC), applicando la seguente formula:

UFC/ml = ∑C / (1*n1 + 0,1*n2) d1

Dove:

∑C = somma del numero di colonie delle piastre contabili;

n1 = numero di piastre della prima diluizione considerata contabile;

n2 = numero di piastre della seconda diluizione considerata contabile;

d1 = fattore di diluizione relativo alla prima diluizione considerata contabile.

Si considerano contabili le piastre che hanno un numero di colonie compreso tra 10 e

300.

3.3.7 Protocollo di estrazione del DNA di lievito

Il protocollo per l’estrazione degli acidi nucleici da lievito utilizzato in questo lavoro è

stato quello proposto da Querol (1992) [14]. In breve, le cellule sono state coltivate

overnight in 5 ml di brodo YEPD. La coltura è stata centrifugata a 3500 rpm per 20

minuti. Il pellet è stato sospeso in 500 μl di una soluzione contenente 0,9 M sorbitolo,

0,1 M EDTA a pH 7,5 a cui sono stati aggiunti 500 μg/ml di enzima litico zymoliasi e

14mM ß-mercaptoetanolo (1μl/ml). Le provette sono state incubate a 30°C per 60

minuti, miscelando ogni 30 minuti, per lisare la parete cellulare. Gli sferoplasti così

ottenuti sono stati centrifugati a 3500 rpm per 15 minutu e il pellet è stato sospeso in

500 μl di Tris-HCl 0,05 M, 0,02M EDTA a pH 7,4. Dopo risospensione, 50 μl di sodio

dodecil solfato (SDS) al 10% è stato aggiunto e la miscela è stata incubata a 65°C per

30 minuti. Subito dopo, 200 μl di acetato di potassio 5 M sono stati aggiunti per

permettere la precipitazione delle proteine e le provette sono state poste in ghiaccio per

26

30 minuti. Il lisato è stato quindi centrifugato a 14000 rpm in una eppendorf per 5

minuti. I surnatanti sono stati trasferiti in eppendorf nuove ed il DNA è stato

precipitato mediante aggiunta di 1 isovolume di isopropanolo (circa 800 μl). Le

eppendorf sono state nuovamente centrifugate a 14000 rpm per 10 minuti. Il DNA è

stato lavato con etanolo al 70% (1 ml) e poi centrifugato a 14000 rpm per 5 minuti. Il

pellet è stato essiccato a 50°C per 15 minuti, dissolto in 75 μl di soluzione TE (10 mM

Tris-HCl, 1 mM EDTA a pH 8) e mantenuto a 4°C per 12 h. L’estratto è stato trattato

con 0,5 mg/mL RNasi a 37°C per 30 minuti. Infine, il DNA è stato conservato a -20°C.

La concentrazione e la purezza di DNA è stata determinata misurando l’A260nm e

l’A280nm.

3.3.8 PCR

L’analisi delle sequenze interdelta è stata condotta per lo studio dei lieviti isolati nel

corso del processo fermentativo del mosto di Croatina: valutando la presenza di

Saccharomyces cerevisiae e il grado di diversità tra i lieviti spontanei. Il genoma di S.

cerevisiae contiene sequenze ripetute di DNA, le sequenze delta, associate al

trasposone Ty1. Gli elementi delta costituiscono le ripetizioni terminali (LTR) della

sequenza dei trasposoni Ty1 e Ty2 in lievito; questi si possono trovare sia associati al

retrotrasposone, sia dispersi nel genoma, in questo caso prendono il nome di “elementi

delta”. Il numero e la posizione di questi elementi hanno una certa variabilità

intraspecifica che può essere utilizzato come un’impronta digitale genetica per

identificare i ceppi di S. cerevisiae. Si tratta di una metodica che prevede

un’amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain Reaction). L’amplificazione è

stata condotta per gli isolati selezionati durante il monitoraggio fermentativo basandosi

sullo studio del marcatore molecolare interdelta. Il protocollo sperimentale prevede

l’amplificazione di specifiche zone del genoma comprese tra due sequenze delta

tramite l’utilizzo di primers specifici e separazione elettroforetica dei prodotti di

amplificazione per valutarne la qualità. La reazione di PCR è stata condotta partendo

dal DNA genomico degli isolati in un volume finale di 25 μl contenente 10 μl di

miscela per l’amplificazione delle sequenze interdelta Hot Start (composta da Buffer

1X, MgCl2 2 mM, dNTPs 200 μM, Taq-polimerasi 1U), 2,5 μl di primer δ12, 2,5 μl di

primer δ21, il campione di DNA quantificato e acqua sterile filtrata fino a raggiungere

27

il volume finale di 25 μl. La sequenza nucleotidica dei primers utilizzati è riportata

nella seguente tabella [10]:

Primer Sequenza nucleotidica (5’-3

’)

Temperatura

di Melting

δ 12

TCAACAATGGAATCCCAAC

Tm 54°C

δ 21 CATCTTAACACCGTATATATGA Tm 54°C

Con la PCR (Eppendorf) di cui il laboratorio è dotato, è stato applicato il seguente

ciclo termico:

1) 95°C per 3 minuti DENATURAZIONE INIZIALE

2) 95°C per 30 secondi DENATURAZIONE

3) 42°C per 30 secondi ANNEALING

4) 72°C per 2 minuti ESTENSIONE

5) 95°C per 30 secondi DENATURAZIONE

6) 45°C per 30 secondi ANNEALING

7) 72°C per 2 minuti ESTENSIONE

8) 72°C per 7 minuti ESTENSIONE FINALE

3.3.9 Elettroforesi su gel di agarosio

I prodotti di amplificazione sono stati separati tramite corsa elettroforetica su gel di

agarosio al 2,5% (p/v) in TAE 1X (contenetnte Trisbase (T), Acido acetico (A) e

EDTA (E)), utilizzando come riferimento un marker di pesi molecolari noti. La

separazione dei frammenti è stata eseguita a 100V per 90 minuti. Il gel di agarosio

utilizzato ha la seguente composizione:

Agarosio 3,75 g

TAE 1X 150 ml

Bromuro di etidio 6 μl

Per 5 cicli

Per 30 cicli

28

In ogni pozzetto sono stati caricati 15 μl di DNA amplificato e 2μl di Blu di

bromofenolo (BBF), come addensante e tracciante per valutare l’avvenuta corsa

elettroforetica. Il gel viene visualizzato utilizzando un transilluminatore a raggi UV.

29

4. RISULTATI E DISCUSSIONE

30

4.1 MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO PREVENDEMMIALE

4.1.1 Conta della concentrazione cellulare sui grappoli di Croatina

Il monitoraggio microbiologico sui grappoli è stato svolto nel mese precedente la

vendemmia. I grappoli di Croatina, campionati in buste di plastica sterili, sono stati

pigiati manualmente all’interno delle buste per ottenere il mosto. Il mosto è stato

diluito utilizzando come tampone l’acqua peptonata e le diluizioni 10-1

, 10-2

e 10-3

sono state piastrate per spatolamento su terreno WL Nutrient Agar. Le piastre ottenute

sono state incubate in termostato a 25 ± 2°C per 48 ore, per permettere la crescita dei

microrganismi. L’analisi delle piastre ha permesso la conta delle colonie. La scelta di

utilizzare un mezzo colturale generico, diluendo semplicemente il campione, senza

l’utilizzo di mezzi di arricchimento specifici (come l’uso di particolari mezzi colturali,

antibiotici o condizioni d’incubazione diverse), ha permesso l’isolamento delle specie

più rappresentative e aventi una velocità di crescita maggiore. Si è così ottenuto il

grafico della cinetica dell’andamento della popolazione microbica, costituita dalle

specie più rappresentative, sui grappoli d’uva.

Grafico 4.1 Cinetica dell’andamento della popolazione microbica sull’uva

Il grafico riporta la cinetica dell’andamento della popolazione microbica sui grappoli di

Croatina. Il picco massimo si riscontra nella settimana precedente la raccolta dell’uva, con una

concentrazione cellulare di 1,51 x 104 UFC/g.

0,00E+00

2,00E+03

4,00E+03

6,00E+03

8,00E+03

1,00E+04

1,20E+04

1,40E+04

1,60E+04

19-ago-14 29-ago-14 08-set-14 18-set-14 28-set-14

UFC

/g

Campionamento

UFC/g

UFC/g

31

Dalla Grafico 4.1 si può vedere un aumento esponenziale dei microrganismi a partire

dalla terza settimana precedente la vendemmia, con un picco massimo corrispondente

alla settimana immediatamente precedente la raccolta dell’uva.

4.1.2 Riconoscimento di muffe e lieviti

È stato possibile, grazie alla morfologia delle colonie e all’analisi di quest’ultime al

microscopio ottico, distinguere due tipologie di microrganismi dominanti: le muffe e i

lieviti. Basandoci sulla percentuale di muffe e lieviti, rispetto alla totalità dei

microrganismi ottenuti dall’analisi sui grappoli nel corso del monitoraggio, è stato

possibile vedere una decrescita delle muffe a favore di un aumento dei lieviti nel corso

della maturazione dell’uva, a partire dalla fase di invaiatura fino a raggiungere la

completa maturazione. È possibile apprezzare l’andamento dei microrganismi isolati

nel seguente grafico:

Grafico 4.2 Percentuale di muffe e lieviti

La figura mostra l’andamento della percentuale di muffe e lieviti presenti sulla superficie dei

grappoli di Croatina nel corso del monitoraggio. È possibile riscontrare un aumento del

numero di lieviti e una rispettiva diminuzione di quello delle muffe con l’avvicinarsi della

vendemmia.

L’analisi al microscopio ha permesso, in base alla morfologia delle colonie osservate,

di ricondurre presumibilmente la maggior parte delle muffe isolate durante il

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80%

90%

100%

% Lieviti

% Muffe

32

monitoraggio alla specie Cladosporium, mentre la maggior parte dei lieviti alla specie

Candida. Si tratta di un’identificazione basata unicamente sull’analisi microscopica.

Durante il monitoraggio le colonie di muffe e lieviti, che hanno mostrato una differente

morfologia su terreno WL Nutrient Agar, sono state isolate e conservate come colture

pure glicerinate a -80°C, creando una libreria di isolati, e potranno essere utilizzate in

futuro per ulteriori studi più approfonditi.

Figura 4.1 Confronto tra piastre in momenti diversi del monitoraggio

La figura mostra, a titolo di esempio, le foto delle piastre corrispondenti alla diluizione 10-1

. In

queste piastre, che corrispondono al secondo campionamento, a sinistra, e al quarto

campionamento, a destra (non contabile), si può vedere il passaggio da una maggioranza di

muffe sul totale della popolazione microbica dei grappoli a una di lieviti.

Figura 4.2 Immagine al microscopio di muffe e lieviti

La figura mostra le foto che indicano come appaiono una muffa, a sinistra, e un lievito, a

destra, isolati durante il monitoraggio microbiologico sui grappoli di Croatina, osservati al

microscopio ottico con ingrandimento 40X.

33

4.2 MONITORAGGIO CHIMICO PREVENDEMMIALE

4.2.1 Zuccheri, pH e Acidità totale

Nella fase prevendemmiale sono stati valutati alcuni parametri chimici.

È stato monitorato l’andamento degli zuccheri attraverso una scala di gradi Brix. La

misura è stata fatta utilizzando un densimetro portatile DMA 35 N PAAR e misurando

la densità del mosto alla temperatura di 20°C. Il grado Brix rappresenta la percentuale

di zucchero in peso: moltiplicando il grado Brix per 10, si ottiene il peso dello

zucchero in 1 kg di mosto. Esiste una tabella di conversione fra i gradi Brix e il titolo

alcolometrico potenziale dei mosti (TAP), che è possibile consultare in allegato. 18°

Brix corrispondono ad un valore di TAP di circa 10% vol. I valori di gradi Brix sono

aumentati da 20,1° fino a raggiungere 25,4°, che approssimativamente corrisponde a

un valore di TAP di 15% vol.

Sono stati inoltre analizzati gli andamenti di pH e acidità totale: il pH si è mantenuto

piuttosto costante, oscillando da 3,17 e 3,32; mentre l’acidità è diminuita da un valore

di 10,71 g/l a un valore di 5,03 g/l.

Campionamento °Brix pH Acidità totale in

ac. tartarico (g/l)

26/08/2014 20,1 3,17 10,71

02/09/2014 22,1 3,23 8,38

09/09/2014 22,2 3,37 8,13

16/09/2014 22,5 3,35 5,83

24/09/2014 25,4 3,32 5,03

Tabella 4.1 Tabella riassuntiva dei valori chimici rilevati

La tabella riporta, per ogni campionamento effettuato prima della vendemmia, i valori di

°Brix, pH e acidità totale in acido tartarico rilevati.

34

Grafico 4.3 Andamento degli zuccheri espressi come °Brix

Grafico 4.4 Andamento di pH e acidità totale

4.2.2 Il rame

È stato valutato, tra gli altri parametri chimici, anche il contenuto in rame del mosto tal

quale ottenuto per pigiatura manuale di alcuni grappoli di Croatina. Gli acini,

provenienti dal grappolo campionato, sono stati pigiati all’interno di un mortaio, dopo

aver lavato e asciugato la superficie di questi ultimi per evitare contaminazioni del

succo con il rame eventualmente legato alla polvere presente sul grappolo, con

15

17

19

21

23

25

27

24-ago 03-set 13-set 23-set 03-ott

°BRIX

°BRIX

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

24-ago 03-set 13-set 23-set 03-ott

pH

ACIDITA' Tot (g/l)

35

l’utilizzo di un pestello e di un colino per facilitare l’allontanamento delle bucce. Il

mosto così ottenuto è stato diluito 1:10 con acqua distillata e demineralizzata e

successivamente analizzato per spettrofotometria di assorbimento atomico, applicando

il metodo ufficiale previsto dall’OIV [13]. Lo strumento ha elaborato la concentrazione

di rame in ppm e questo ha permesso di riscontrare una graduale diminuzione della

presenza di rame sui grappoli di Croatina. I dati riguardanti il contenuto in rame non

sono più stati significativi nel mosto in fermentazione, dove il rame è stato ritrovato in

concentrazioni trascurabili.

Il seguente grafico ha permesso di schematizzare l’andamento della concentrazione di

rame:

Grafico 4.5 L’andamento del rame

Il grafico mostra l’andamento del rame sui grappoli d’uva. Questo grafico permette di

visualizzare la diminuzione progressiva della presenza di rame, fino ad arrivare a

concentrazioni trascurabili.

4.2.3 Il colore

In ultimo è stato valutato il colore del mosto tal quale ottenuto dalla pigiatura manuale

di alcuni grappoli di Croatina. Durante questa fase prevendemmiale si è riscontrato un

andamento pressoché parallelo dei valori di rosso, verde e blu, come si può vedere dal

grafico riportato sotto.

0 2 4 6 8

10 12 14

26

/08

/20

14

28

/08

/20

14

30

/08

/20

14

01

/09

/20

14

03

/09

/20

14

05

/09

/20

14

07

/09

/20

14

09

/09

/20

14

11

/09

/20

14

13

/09

/20

14

15

/09

/20

14

Rame (ppm)

Rame (ppm)

36

Campionamento A420 A520 A620 L* a* b* R G B

26/08/2014 0,2000 0,2462 0,0354 88,58 15,13 8,61 255 210 204

02/09/2014 1,0000 0,9760 0,4260 52,65 24,42 21,9 181 115 95

09/09/2014 0,3011 0,2822 -0,019 89,02 20,58 17,62 255 209 190

16/09/2014 1,7560 1,3760 0,5625 40,73 29,12 36,46 152 75 38

24/09/2014 0,9870 1,0620 0,3160 54,13 34,82 24,19 194 103 90

Tabella 4.2 Tabella riassuntiva dei dati del colore

La tabella riporta i valori di assorbanza e i valori di L*, a* e b* rilevati dallo strumento e i

valori di R, G e B calcolati con l’ausilio di un programma di calcolo.

Grafico 4.6 L’andamento delle componenti R, G e B nel campione

Il grafico riporta l’andamento delle componenti di rosso (R) , verde (G) e blu (B) presenti nel

mosto di Croatina prima della vendemmia.

0

50

100

150

200

250

300

24-ago 29-ago 03-set 08-set 13-set 18-set 23-set 28-set

B

R

G

37

3. MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO E CHIMICO DEL PROCESSO

FERMENTATIVO

4.3.1 Monitoraggio microbiologico

Il monitoraggio microbiologico è stato svolto durante il processo fermentativo del

mosto ottenuto dall’uva Croatina in purezza, con lo scopo di ottenere un vino Bonarda

in purezza. La fermentazione è stata condotta con processo di macerazione e in modo

spontaneo, sfruttando il potere fermentativo dei lieviti indigeni presenti naturalmente

sull’uva. Il mosto in fermentazione, campionato in buste di plastica sterili, è stato

diluito utilizzando come tampone l’acqua peptonata e le opportune diluizioni sono

state piastrate per spatolamento su terreno WL Nutrient Agar. Le piastre ottenute sono

state incubate in termostato a 25 ± 2°C per 48 ore, per permettere la crescita dei lieviti

impiegati nel processo fermentativo. L’analisi delle piastre ha permesso la conta delle

colonie. Si è così ottenuto il grafico della cinetica dell’andamento della fermentazione.

Figura 4.3 Piastre ottenute durante il monitoraggio microbiologico

La figura mostra, a titolo di esempio, le foto delle piastre che corrispondono alle diluizioni 10-4

(A), 10-5

(B) e 10-6

(C). Si può notare la presenza di colonie morfologicamente differenti di

38

lieviti (in accordo con una fermentazione di tipo spontaneo). La foto C riporta una piastra non

contabile, dal momento che contiene un numero di colonie contabili inferiore a 10.

L’analisi delle piastre, oltre a permettere la conta delle colonie, ha confermato

l’avvenuta fermentazione di tipo spontaneo. Infatti, la morfologia delle colonie su

terreno WL Nutrient Agar è apparsa diversa. Questo è una dimostrazione del fatto che i

lieviti, coinvolti nel processo fermentativo, appartengono a ceppi diversi di S.

cerevisiae. La differente morfologia delle colonie ha permesso l’isolamento di queste

come colture pure.

Grafico 4.7 Cinetica del processo fermentativo

Il grafico riporta la cinetica dell’andamento della fermentazione del mosto di Croatina. Il picco

massimo si riscontra all’ottavo giorno di fermentazione, con una concentrazione cellulare di

1,57 x 107 UFC/ml.

La curva della fermentazione è stata seguita fino al ventinovesimo giorno, giorno in

cui si può iniziare ad apprezzare un declino nella curva della cinetica di fermentazione.

La fine della fermentazione è stata determinata attraverso l’analisi dei parametri

chimici, in particolare la concentrazione in g/l di glucosio e fruttosio. Questo

parametro ha permesso di considerare conclusa la fermentazione al quarantottesimo

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

18-set-14 28-set-14 08-ott-14 18-ott-14 28-ott-14

UFC

/ml

Campionamento

UFC/ml

UFC/ml

39

giorno dalla vendemmia, avendo rilevato un contenuto in glucosio e fruttosio pari a

1,123 g/l. I lieviti indigeni sono riusciti a portare a termine la fermentazione, benché

questa sia stata piuttosto lunga.

4.3.2 Monitoraggio chimico

Il monitoraggio chimico ha permesso di seguire i principali parametri chimici durante

il processo fermentativo. I valori di pH, acidità totale in acido tartarico espressa in g/l e

il contenuto in zuccheri, inizialmente espresso come °Brix e successivamente valutato

come concentrazione della miscela di glucosio e fruttosio espressa in g/l, sono stati

analizzati per tutto il corso della fermentazione. Quando la densità del mosto è

diminuita, e quindi è diminuito il suo contenuto zuccherino (indice dell’avanzamento

della fermentazione) fino a concentrazioni misurabili con metodi chimici, sono stati

analizzati anche i valori della densità del distillato idroalcolico, ottenuto per

distillazione del mosto in vinificazione, della densità del vino e il titolo alcolometrico

volumico effettivo (TAV), attraverso l’utilizzo di una bilancia idrostatica. I risultati

ottenuti sono riportati nella seguente tabella:

40

Data pH

Acidità

tot. in

ac.

tartarico

(g/l)

°Brix Gluc/Frutt

(g/l)

Acido

Malico

(g/l)

TAV Densità

Distillato

Densità

Vino

D°20

26/09/2014 3,35 5,18 23,7 - - - - -

28/09/2014 3,52 6,57 22,3 - - - - -

01/10/2014 3,50 5,91 19,3 - - - - -

03/10/2014 - - 16,3 - - - - -

06/10/2014 - - 14,7 - - - - -

08/10/2014 3,55 6,47 11,7 - - - - -

10/10/2014 3,63 6,09 9,9 - - - - -

13/10/2014 3,62 6,32 7,5 - - - - -

15/10/2014 3,68 6,55 5,6 - - - - -

17/10/2014 3,59 6,82 4,0 43,390 1,255 10,78 0,98550 1,01350

20/10/2014 3,55 6,58 - 26,810 1,256 11,62 0,98450 1,00815

22/10/2014 3,73 6,63 - 19,850 1,215 - - -

03/11/2014 3,62 7,62 - 4,057 1,273 13,63 0,98200 0,99500

10/11/2014 3,53 7,30 - 1,100 1,300 13,38 0,98250 0,99400

17/11/2014 3,43 6,58 - 1,400 1,200 14,73 0,98095 0,99405

24/11/2014 3,48 7,01 - 1,112 1,454 13,35 0,98255 0,99375

03/12/2014 3,57 6,90 - 1,123 1,537 14,03 0,98175 0,99350

Tabella 4.3 Tabella riassuntiva dei valori chimici rilevati

La tabella riporta i valori di pH, acidità totale in acido tartarico, °Brix, glucosio e fruttosio,

acido malico, titolo alcolometrico volumico effettivo (TAV), densità del distillato e densità del

vino rilevati durante il monitoraggio chimico.

I campioni sono stati inoltre sottoposti all’analisi spettrofotometrica per valutarne il

colore. Per ogni campione sono stati valutati i valori di assorbanza a 420 nm, 520 nm e

620 nm e i valori di L*, a* e b*, che hanno permesso di calcolare la componente di

rosso, verde e blu presente nel campione. I risultati ottenuti sono riportati nella

seguente tabella:

41

Campionamento A420 A520 A620 L* a* b* R G B

26/09/2014 1,7893 4,4089 0,4687 30,03 58,73 39,45 153 0 11

01/10/2014 4,4625 12,8310 1,4270 10,54 41,59 18,17 78 0 0

03/10/2014 5,3990 15,0130 1,8120 6,17 35,38 10,64 59 0 0

06/10/2014 5,5700 14,5840 2,0140 2,89 30,10 4,99 48 0 0

08/10/2014 5,1109 13,4671 1,7185 6,91 36,34 11,92 62 0 0

10/10/2014 5,6501 14,3140 1,9840 3,88 31,77 6,69 52 0 0

13/10/2014 5,6460 13,5170 2,0730 2,32 29,22 4,00 45 0 0

15/10/2014 5,5030 13,3990 1,8890 5,24 33,90 9,04 56 0 0

17/10/2014 5,8060 13,8930 1,9940 4,48 32,84 7,73 53 0 0

20/10/2014 5,7790 13,3160 1,9760 4,79 33,32 8,26 55 0 0

22/10/2014 5,9130 13,3250 1,9700 5,20 34,03 8,97 56 0 0

03/11/2014 5,1875 11,4471 1,7519 7,18 36,86 12,37 64 0 0

10/11/2014 3,4550 5,6842 1,1174 13,69 44,45 23,30 89 0 0

17/11/2014 3,4254 5,8230 1,1057 14,17 45,34 24,11 91 0 0

24/11/2014 3,8545 6,4144 1,2714 11,30 41,52 19,36 79 0 0

03/12/2014 3,9549 6,6577 1,2838 11,32 41,73 19,43 80 0 0

Tabella 4.4 Tabella riassuntiva dei dati del colore

La tabella riporta i dati relativi al colore del mosto in fermentazione, rilevati durante il

monitoraggio chimico del vino.

42

Grafico 4.8 Grafico dell’andamento di pH, acidità totale e acido malico

Grafico 4.9 Grafico dell’andamento degli zuccheri valutati in °Brix

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

13-set 03-ott 23-ott 12-nov 02-dic 22-dic

pH

ACIDITA' Tot (g/l)

A. Malico (g/l)

0

5

10

15

20

25

13-set 23-set 03-ott 13-ott 23-ott 02-nov 12-nov 22-nov 02-dic 12-dic

° BRIX

° BRIX

43

Grafico 4.10 Grafico dell’andamento degli zuccheri valutati in concentrazione di glucosio

e fruttosio e dell’alcool

Grafico 4.11 Grafico dell’andamento dei parametri del colore R, G e B

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

13-set 03-ott 23-ott 12-nov 02-dic 22-dic

Glucosio/Fruttosio (g/l)

Alcool

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

13-set 23-set 03-ott 13-ott 23-ott 02-nov 12-nov 22-nov 02-dic 12-dic

Co

lore

Campionamento

B

R

G

44

4.4 ISOLAMENTO DEI CEPPI DI LIEVITO E SELEZIONE DEL CEPPO DI

Saccharomyces cerevisiae STARTER

4.4.1 Isolamento dei lieviti coinvolti nel processo fermentativo

Durante il monitoraggio microbiologico della fase di fermentazione del mosto, sono

stati isolati alcuni lieviti a ogni monitoraggio. L’isolamento è avvenuto prelevando con

un’ansa sterile un’aliquota della colonia selezionata e strisciandola poi su una piastra

con terreno YEPD Agar. Gli isolati sono stati incubati e fatti crescere a una

temperatura controllata di 25 ± 2°C per 48 ore. In seguito gli isolati sono stati trasferiti

in un brodo di coltura, inoculando con l’utilizzo di un’ansa sterile un’aliquota di una

colonia del lievito isolato in 2,5 ml di brodo YEPD. Le colture sono quindi state fatte

crescere in termostato a 25 ± 2°C per 48 ore. Sono stati in seguito aggiunti di 450 μl di

glicerolo al 100% e si è trasferito 1 ml di coltura glicerinata in una eppendorf

mantenuta a -80°C.

Monitoraggio Colture glicerinate

Mosto 1° 24-09 M1Lb, M1Lv

Mosto 3° 26-09 M3Lv, M3Lb

Mosto 6° 29-09 M6Lb, M6Lvs, M6Lvc

Mosto 8° 01-10 M8Lb, M8Lvs, M8Lvc

Mosto 10° 03-10 M10Lb, M10Lvs, M10Lvc

Mosto 13° 06-10 M13Lb, M13Lv

Mosto 15° 08-10 M15L1, M15L2, M15L3

Mosto 20° 13-10 M20L1, M20L2, M20L3

Mosto 22° 15-10 M22L1, M22L2, M22L3

Mosto 24° 17-10 M24L1, M24L2

Mosto 27° 20-10 M27L1, M27L2, M27L3

Tabella 4.5 Libreria degli isolati

La tabella riporta i codici dei lieviti isolati ad ogni monitoraggio e conservati come colture

pure a -80°C.

45

Figura 4.4 Lievito isolato come coltura pura

La figura rappresenta, a titolo di esempio, un tipico isolato di una coltura di lievito pura.

4.4.2 Selezione del ceppo starter

Per ridurre i tempi di analisi e partendo dal presupposto che i lieviti isolati dai primi

monitoraggi sono per lo più lieviti apiculati e ceppi di S. cerevisiae con un basso

potere fermentativo e una bassa resistenza a valori elevati di etanolo, sono stati valutati

in analisi successive solo i lieviti isolati dagli ultimi sei tempi del monitoraggio.

È stato estratto il DNA da questi sedici lieviti, seguendo il protocollo descritto nel

paragrafo 3.3.6.

Il DNA estratto è stato quantificato con l’utilizzo dello spettrofotometro, analizzando

l’assorbanza a 260 nm (per valutare la presenza di DNA) e a 280 nm (per valutare

l’eventuale contaminazione da proteine).

46

Campione A 260 nm A 280 nm μg/μl DNA Grado di

purezza

M13 Lv 0,273 0,140 2,73 1,95

M13 Lb 0,185 0,123 1,85 1,50

M15 L1 0,224 0,148 2,24 1,51

M15 L2 0,215 0,130 2,15 1,65

M15 L3 0,343 0,184 3,43 1,86

M20 L1 0,148 0,103 1,48 1,44

M20 L2 0,124 0,087 1,24 1,43

M20 L3 0,184 0,147 1,84 1,25

M22 L1 0,771 0,428 7,71 1,80

M22 L2 0,961 0,528 9,61 1,82

M22 L3 0,734 0,405 7,34 1,81

M24 L1 0,598 0,342 5,98 1,75

M24 L2 0,716 0,401 7,16 1,79

M27 L1 0,921 0,510 9,21 1,80

M27 L2 0,700 0,351 7,00 1,99

M27 L3 0,833 0,460 8,33 1,81

Tabella 4.6 Quantificazione del DNA estratto

La tabella riporta, per ciascun lievito testato, i valori di assorbanza a 260 nm e 280 nm, la

concentrazione di DNA espressa in μg/μl (ottenuta applicando la formula A260nm x 50 / μl

DNA impiegati) e il grado di purezza (cioè il rapporto tra A 260 nm / A 280 nm). Si ritiene che

un grado di purezza inferiore a 1,6 sia indice di una contaminazione proteica.

Il DNA estratto è stato quindi amplificato tramite PCR, applicando il metodo descritto

nel paragrafo 3.3.8. Gli amplificati ottenuti sono stati visualizzati attraverso

elettroforesi su gel di agarosio al 2,5%. L’osservazione del gel elettroforetico con luce

UV ha permesso di visualizzare i profili interdelta dei ceppi testati: la presenza di

bande ha confermato che i lieviti valutati erano effettivamente ceppi di S. cerevisiae. I

47

profili visualizzati hanno confermato l’avvenuta fermentazione di tipo spontaneo,

dimostrata dalla presenza di profili differenti e quindi di diversi ceppi di S. cerevisiae.

Tra questi è stato scelto un ceppo di S. cerevisiae da utilizzare come starter per una

prova di microvinificazione su 10 l di mosto ottenuto da uva di qualità Croatina

raccolta nella stessa vigna da cui si era raccolta l’uva della prima sperimentazione: la

scelta è ricaduta su un ceppo presente in modo costante negli ultimi tre tempi di

monitoraggio, che si è pertanto mantenuto attivo nell’ultima settimana di monitoraggio

microbiologico. Si tratta quindi, presumibilmente, di un ceppo in grado di tollerare

concentrazioni alcoliche elevate e con un alto potere fermentativo.

Il ceppo di Saccharomyces cerevisiae scelto è quello indicato con il codice M27L1.

Figura 4.5 Profilo interdelta del ceppo starte selezionato

La figura riporta il profilo visualizzato su gel elettroforetico dopo amplificazione delle

sequenze interdelta del ceppo di S. cerevisiae utilizzato come starter per una prova di

microvinificazione.

48

4.5 PROVA DI MICROVINIFICAZIONE

4.5.1 Pressatura dell’uva Croatina

Dal momento che la prova di microvinificazione è stata effettuata a un mese dalla

vendemmia, è stato necessario congelare il mosto privo delle bucce.

Per l’ottenimento di mosto limpido, senza presenza di bucce e semi, le uve sono state

versate direttamente all’interno di una pressa idraulica. Il principio di funzionamento

di tale pressa sfrutta la pressione dell’acqua: un cilindro, costituito da una membrana in

gomma ad uso alimentare, si gonfia con l’entrata dell’acqua e l’uva da pressare viene

quindi schiacciata tra la membrana e un cilindro in acciaio inox forato, da cui fuoriesce

il succo.

La pressa utilizzata in cantina ha una capacità di 80 l ed è usata nelle prove di

microvinificazione. L’utilizzo di questo strumento consente di effettuare una

pressatura soffice con una buona resa in succo delle uve, poiché la pressione

all’interno della membrana di gomma flessibile viene scaricata uniformemente verso la

gabbia esterna per tutta la sua lunghezza.

4.5.2 Inoculo della coltura starter

Per procedere con l’inoculo del ceppo di S. cerevisiae selezionato nei 10 l di mosto

limpido privo delle bucce, è stato necessario ottenere un’adeguata concentrazione

cellulare del lievito.

50 μl di coltura glicerinata del ceppo denominato con il codice M27L1 sono stati

inoculati dapprima in 5 ml di brodo colturale YEPD. Dopo una notte di crescita a una

temperatura controllata di 25 ± 2°C, 2 ml di coltura sono stati trasferiti in 400 ml di

brodo YEPD. La coltura è stata fatta crescere per una notte a 25 ± 2°C e

successivamente è stata trasferita in quaranta provette (10 ml di coltura per ogni

provetta). Le provette sono state centrifugate e il pellet, costituito dalle cellule di

lievito, è stato risospeso in 1 ml di brodo YEPD. Il contenuto delle provette è stato

trasferito in due falcon (20 ml di coltura per ogni falcon), che sono state conservate in

frigorifero a 4°C. Il contenuto delle falcon è quindi stato trasferito in acqua distillata

sterile e, in ultimo, inoculato nel mosto opportunamente scongelato.

49

Si è ipotizzato un inoculo avvenuto con una concentrazione cellulare di circa 4 x 105

UFC/ml.

La fermentazione è stata fatta partire in laboratorio, in condizioni controllate, a una

temperatura di circa 20/22°C. In seguito, la vasca contenete il mosto sottoposto a

microvinificazione, è stata posta in cantina a una temperatura di circa 16/18°C per

mimare il più possibile le condizioni avute nella precedente fermentazione.

Figura 4.6 Vasca utilizzata nella prova di microvinificazione

La figura mostra la foto della vasca, in acciaio inox, contenente i 10 l di mosto privo di bucce

nel quale è avvenuto l’inoculo del ceppo starter selezionato e il successivo processo

fermentativo.

4.5.3 Monitoraggio microbiologico

Il monitoraggio microbiologico è stato svolto durante il processo fermentativo del

mosto sottoposto a microvinificazione: Bonarda da microvinificazione. La

fermentazione è stata condotta senza processo di macerazione e inoculando un ceppo

di S. cerevisiae, selezionato tra quelli naturalmente presenti durante la fermentazione

spontanea seguita in precedenza, come starter. Il mosto in fermentazione, campionato

in buste di plastica sterili, è stato diluito utilizzando come tampone l’acqua peptonata e

le opportune diluizioni sono state piastrate per spatolamento su terreno WL Nutrient

Agar. Le piastre ottenute sono state incubate e mantenute a una temperatura controllata

di 25 ± 2°C per 48 ore, per permettere la crescita del lievito responsabile del processo

50

fermentativo. L’analisi delle piastre ha permesso la conta delle colonie. Si è così

ottenuto il grafico della cinetica dell’andamento della fermentazione.

Figura 4.7 Piastre ottenute durante il monitoraggio microbiologico

La figura mostra, a titolo di esempio, le foto delle piastre che corrispondono alle diluizioni 10-2

(A), 10-3

(B) e 10-4

(C). Si può notare la presenza di colonie uguali dal punto di vista

morfologico (in accordo con una fermentazione indotta). La foto C riporta l’unica piastra

contabile, dal momento che le piastre rappresentate nelle foto A e B contengono un numero di

colonie contabili superiore a 300.

L’analisi delle piastre, oltre a permettere la conta delle colonie, ha inizialmente

confermato l’avvenuta fermentazione di tipo indotto. Infatti, la morfologia delle

colonie su terreno WL Nutrient Agar è apparsa la stessa. Questo è una dimostrazione

del fatto che i lieviti, coinvolti nel processo fermentativo, appartengono allo stesso

ceppo di S. cerevisiae. Per una conferma definitiva del corretto andamento della

fermentazione indotta con uno starter selezionato, sono state isolate sedici colonie di

lievito, otto dal primo giorno di monitoraggio e otto dall’ultimo giorno. Queste sono

state conservate come colture pure e analizzate in prove successive.

51

Grafico 4.12 Cinetica del processo fermentativo

Il grafico riporta la cinetica dell’andamento della fermentazione del mosto sottoposto a

microvinificazione. Il picco massimo si riscontra al sesto giorno di fermentazione, con una

concentrazione cellulare di 3,7 x 106 UFC/ml.

La curva della fermentazione è stata seguita fino al trentaquattresimo giorno, giorno in

cui si può apprezzare un declino nella curva della cinetica di fermentazione. La fine

della fermentazione è stata determinata attraverso l’analisi dei parametri chimici, in

particolare la concentrazione in g/l di glucosio e fruttosio. Questo parametro ha

permesso di considerare conclusa la fermentazione al quarantesimo giorno dal suo

inizio, avendo rilevato un contenuto in glucosio e fruttosio pari a 0,8 g/l. Il lievito

indigeno testato, isolato durante la fermentazione spontanea di Croatina monitorata in

precedenza, è riuscito a portare a termine la fermentazione, che ha avuto una durata

pressoché uguale alla fermentazione di tipo spontaneo.

Per confermare che la fermentazione è stata iniziata e portata a termine dallo stesso

ceppo di S. cerevisiae utilizzato come starter, i sedici lieviti isolati e conservati come

colture pure durante la fermentazione sono stati ulteriormente testati. Dapprima è stato

isolato il DNA da questi lieviti. La quantificazione del DNA estratto è avvenuta

tramite analisi spettrofotometrica.

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

28-ott-14 07-nov-14 17-nov-14 27-nov-14 07-dic-14

UFC

/ml

Campionamento

UFC/ml

UFC/ml

52

Campione A 260 nm A 280 nm μg/μl DNA Grado di

purezza

L 1 0,220 0,042 2,20 5,24

L 2 0,368 0,161 3,68 2,28

L 3 0,304 0,159 3,04 1,91

L 4 0,283 0,120 2,83 2,36

L 5 0,434 0,184 4,34 2,36

L 6 0,444 0,155 4,44 2,86

L 7 0,181 0,053 1,81 3,42

L 8 0,211 0,064 2,11 3,30

L 9 0,384 0,149 3,84 2,58

L 10 0,523 0,209 5,23 2,50

L 11 0,488 0,190 4,88 2,57

L 12 0,503 0,245 5,03 2,05

L 13 0,331 0,159 3,31 2,08

L 14 0,542 0,230 5,42 2,36

L 15 0,421 0,207 4,21 2,03

L 16 0,434 0,173 4,34 2,50

Tabella 4.7 Quantificazione del DNA estratto

La tabella riporta, per ciascun lievito testato, i valori di assorbanza a 260 nm e 280 nm, la

concentrazione di DNA espressa in μg/μl (ottenuta applicando la formula A260nm x 50 / μl

DNA impiegati) e il grado di purezza (cioè il rapporto tra A 260 nm / A 280 nm). Si ritiene che

un grado di purezza inferiore a 1,6 sia indice di una contaminazione proteica.

Il DNA estratto è stato quindi amplificato tramite PCR, applicando il metodo descritto

nel paragrafo 3.3.8. Gli amplificati ottenuti sono stati visualizzati attraverso

elettroforesi su gel di agarosio al 2,5%. L’osservazione del gel elettroforetico con luce

UV ha permesso di visualizzare i profili interdelta dei ceppi testati: si è osservata la

presenza di un unico profilo, uguale per tutti e sedici i lieviti testati. Tale profilo è lo

stesso del ceppo selezionato, denominato con il codice M27L1, e visibile in Figura

4.11. Questo ha confermato il corretto svolgimento della prova di microvinificazione.

53

Figura 4.8 Gel elettroforetico dell’amplificazione delle sequenze interdelta

La figura riporta la foto del gel elettroforetico visualizzato con luce UV. Il gel riporta i profili

dei ceppi di lievito testati, dopo amplificazione delle sequenze interdelta tramite PCR.

Figura 4.9 Immagine al microscopio del ceppo starter di S. cerevisiae

La figura riporta l’immagine del ceppo di S. cerevisiae M27L1 osservato al microscopio

elettronico con ingrandimento 40X.

54

4.5.4 Monitoraggio chimico

Sono stati seguiti gli andamenti dei principali parametri chimici e del colore durante il

processo fermentativo del mosto sottoposto a microvinificazione. È importante

sottolineare che i valori la cui determinazione ha richiesto quantitativi maggiori di vino

(quali il TAV e le densità del distillato e del vino), sono stati determinati con frequenza

minore rispetto agli altri, data la scarsità del vino Bonarda da microvinificazione a

disposizione (10 l). I risultati ottenuti sono riportati nelle seguenti tabelle:

Data pH

Acidità

tot. in

ac.

tartarico

(g/l)

°Brix Gluc/Frutt

(g/l)

Acido

Malico

(g/l)

TAV Densità

Distillato

Densità

Vino

D°20

31/10/14 3,45 7,07 23,2 - 1,6 - - -

03/11/14 3,45 7,51 17,2 - - - - -

05/11/14 3,47 5,96 11,9 - - - - -

07/11/14 3,53 6,76 8,8 - - - - -

10/11/14 3,47 8,20 5,3 - - - - -

12/11/14 3,44 6,58 3,2 - - - - -

14/11/14 3,25 6,66 2,3 - - - - -

17/11/14 3,27 7,97 1,2 - - 11,60 1,00365 0,98455

19/11/14 - - - 18,3 1,2 - - -

24/11/14 3,48 6,39 - 11,3 0,7 12,34 0,99775 0,98370

26/11/14 - - - 8,5 0,4 - - -

03/12/14 3,62 5,53 - 2,4 0,1 13,11 0,99275 0,98280

09/12/14 3,54 5,23 - 0,8 - 13,27 0,99235 0,98260

Tabella 4.8 Tabella riassuntiva dei valori chimici rilevati

La tabella riporta i valori di pH, acidità totale in acido tartarico, °Brix, glucosio e fruttosio,

acido malico, titolo alcolometrico volumico effettivo (TAV), densità del distillato e densità del

vino rilevati durante il monitoraggio chimico del mosto in microvinificazione.

55

Questi risultati mettono in evidenza che nel vino sottoposto a microvinificazione si è

sviluppata la fermentazione malolattica. Infatti, il valore di acido malico, espresso in

g/l, è diminuito progressivamente da un valore iniziale di 1,6 a un valore finale di 0,1.

La diminuzione della concentrazione di acido malico ha portato analogamente ad una

diminuzione dell’acidità totale e a un aumento del pH .

Data A420 A520 A620 L* a* b* R G B

31/10/14 1,1168 1,6504 0,2910 45,79 53,00 23,82 192,52 61,45 70,98

03/11/14 2,6268 2,4785 1,0920 16,53 28,91 23,08 81,41 17,83 4,92

05/11/14 1,1643 1,2121 0,2943 50,32 42,19 29,39 194,00 86,65 71,40

07/11/14 1,0895 1,1942 0,3172 49,85 40,71 24,32 189,44 87,25 78,81

10/11/14 1,0459 1,1585 0,3056 50,62 40,51 22,92 191,09 89,52 82,96

12/11/14 1,1080 1,1384 0,3127 50,82 38,98 26,16 190,57 91,37 77,85

14/11/14 1,2626 1,2525 0,4140 45,48 36,23 26,18 171,33 80,49 65,26

17/11/14 1,0272 1,0904 0,2322 54,03 43,00 27,07 205,65 95,58 84,14

19/11/14 1,3174 1,1865 0,4284 45,80 33,03 29,33 168,95 84,14 60,40

24/11/14 1,5319 1,2157 0,4041 45,66 35,11 37,89 172,88 81,50 45,04

26/11/14 1,3805 1,0151 0,4056 49,62 27,08 36,22 173,95 98,45 56,46

03/12/14 1,4237 0,9635 0,4441 49,59 22,15 36,32 167,37 102,19 55,77

09/12/14 1,2659 0,8075 0,4113 54,46 16,83 34,19 173,49 118,27 70,71

Tabella 4.9 Tabella riassuntiva dei dati del colore

La tabella riporta i dati relativi al colore del mosto in fermentazione, rilevati durante il

monitoraggio chimico del vino.

I parametri G e B si sono ritrovati durante tutto il monitoraggio del vino Bonarda da

microvinificazione, come si può apprezzare anche nel Grafico 4.16. Questo è dovuto al

fatto che il vino sottoposto a microvinificazione non ha subito il processo di

macerazione. È interessante, inoltre, notare nella Tabella 4.9 come si sia verificato una

diminuzione del colore del vino in concomitanza con la partenza della fermentazione

malolattica. Cosa che non si è verificata nel vino Bonarda in purezza sottoposto a

fermentazione spontanea, nel quale non è avvenuta alcuna fermentazione malolattica.

56

Questo indica come la fermentazione malolattica, oltre a influenzare il vino in diverse

caratteristiche organolettiche, influenzi il colore finale del vino, diminuendone la

componente rossa e aumentandone quella verde.

Grafico 4.13 Grafico dell’andamento di pH, acidità totale e acido malico

Grafico 4.14 Grafico dell’andamento degli zuccheri espressi in °Brix

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

28-ott-14 07-nov-14 17-nov-14 27-nov-14 07-dic-14 17-dic-14

pH

ACIDITA' Tot (g/l)

A. Malico (g/l)

0

5

10

15

20

25

28-ott-14 02-nov-14 07-nov-14 12-nov-14 17-nov-14 22-nov-14

°BRIX

°BRIX

57

Grafico 4.15 Grafico dell’andamento degli zuccheri valutati in concentrazione di glucosio

e fruttosio e dell’alcool

Grafico 4.16 Grafico dell’andamento dei parametri del colore R, G e B

In data 30 Gennaio 2015 sono state svolte le analisi sul vino in fase di affinamento.

È opportuno ricordare che i vini oggetto di studio hanno subito alcuni trattamenti di

cantina durante il processo di vinificazione. Il Bonarda in purezza è stato svinato dopo

un mese dalla vendemmia: le bucce e i vinaccioli sono stati allontanati, ponendo fine al

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

28-ott-14 07-nov-14 17-nov-14 27-nov-14 07-dic-14 17-dic-14

Glucosio/Fruttosio (g/l)

Alcool

0

50

100

150

200

250

28-ott-14 07-nov-14 17-nov-14 27-nov-14 07-dic-14 17-dic-14

Co

lore

Campionamento

B

R

G

58

processo di macerazione. Entrambi i vini, il Bonarda in purezza e il Bonarda da

microvinificazione, sono stati trasferiti in vasche pulite al termine della fermentazione,

dove sono stati solfitati. Con solfitazione s’intende l’aggiunta di diossido di zolfo al

vino. Il diossido di zolfo presenta diverse proprietà:

- È un antisettico: inibisce lo sviluppo dei microrganismi;

- È un antiossidante;

- È un antiossidasico: inibisce istantaneamente l’azione degli enzimi ossidasici

(tirosinasi, laccasi);

- Combina l’etanale e altri composti simili, protegge l’aroma dei vini ed elimina

la nota di svanito [9].

La quantità di SO2 da impiegare nei vini ha da sempre sollevato numerose questioni:

occorre evitare dosi eccessive sia per motivi igienici, sia per prevenire alterazioni

indesiderate sull’aroma del vino. La legislazione dell’UE ha perciò progressivamente

ridotto le dosi limite fino ad arrivare a 160 mg/l per i vini rossi e a 210 mg/l per quelli

bianchi [9].

I risultati di queste analisi conclusive sono riportati nel Capitolo 5.

59

5. CONCLUSIONI

60

5.1 Conclusioni

Lo studio ha permesso di seguire le varie fasi del processo di vinificazione di un vino

Bonarda dell’Oltrepò Pavese in purezza, dal campo fino al raggiungimento del

prodotto finito, e di un vino Bonarda da microvinificazione ottenuto dalla stessa uva.

Controllo prevendemmiale

L’analisi prevendemmiale, effettuata nel mese precedente la vendemmia, ha permesso

di individuare i cambiamenti verificatesi nell’uva dall’invaiatura fino al momento della

maturazione. I cambiamenti principali sono stati: la composizione microbica dei

grappoli, con un aumento sempre maggiore del numero di lieviti, rispetto a quello delle

muffe, durante il progredire della maturazione; il cospicuo aumento del contenuto

zuccherino e la diminuzione dell’acidità totale in acido tartarico. Si è, inoltre, potuto

notare una diminuzione della concentrazione di rame, espressa in ppm, presente sui

grappoli d’uva, fino a raggiungere concentrazioni trascurabili al momento della

vendemmia.

Controllo microbiologico

I controlli microbiologici hanno permesso di seguire la fermentazione spontanea del

mosto, ottenuto dall’uva Croatina in purezza, per opera dei lieviti autoctoni,

naturalmente presenti sui grappoli d’uva al momento della raccolta. Tali lieviti sono

stati isolati, a costituire una libreria, e mantenuti a -80°C; e tra questi è stato scelto, in

seguito ad analisi di biologia molecolare, un ceppo di S. cerevisiae da utilizzare come

starter per una prova di microvinificazione. L’analisi microbiologica ha dimostrato

come sia la fermentazione spontanea, sia la fermentazione indotta, abbiano avuto esito

positivo, portando alla produzione di due vini finiti. La scelta del ceppo starter si è

quindi rivelata particolarmente felice, in quanto esso è stato in grado di portare a

termine la fermentazione, dimostrando di avere un elevato potere fermentativo e

un’elevata resistenza all’etanolo. Le fermentazioni hanno avuto una durata simile, di

circa quaranta giorni, con una cinetica di fermentazione che ha dimostrato la presenza

di un picco di cellule di lievito maggiore nella fermentazione spontanea, con 1,57 x 107

UFC/ml, rispetto alla fermentazione indotta (3,7 x 106 UFC/ml).

61

Controllo chimico

Il monitoraggio chimico durante il processo fermentativo del mosto d’uva ha permesso

di controllare l’intero processo di vinificazione, rendendolo un processo tracciabile in

ogni sua parte. Si è trattato di uno studio di particolare importanza perché,

verosimilmente, i due vini sono derivati da uve analoghe. Sono stati, infatti, ricavati a

partire da un’uva di qualità Croatina in purezza, proveniente dallo stesso vigneto e

raccolta da filari vicini a pochi giorni di distanza. I fattori di diversità sono stati:

- La presenza nel Bonarda in purezza di più ceppi di lievito autoctoni. Il

Bonarda da microvinificazione contiene, invece, solamente un ceppo di S.

cerevisiae autoctono, la cui unica presenza è stata dimostrata da analisi di

biologia molecolare;

- La presenza di bucce e vinaccioli nel Bonarda in purezza, che hanno portato

ad un vino ottenuto con processo di macerazione, mentre il Bonarda da

microvinificazione non ha avuto alcun processo di macerazione. Il processo di

macerazione ha come conseguenza la presenza nel vino di composti ad attività

nutraceutica quali polifenoli, antocianine e tannini;

- La quantità di mosto sottoposta a vinificazione: circa 1 hl per il Bonarda in

purezza e 10 l per il Bonarda da microvinificazione.

Le cinetiche di vinificazione dei principali parametri chimici analizzati hanno

permesso di valutare che i vini hanno seguito percorsi di vinificazione simili nel caso

del contenuto zuccherino, del TAV e della densità del distillato. Le differenze ritrovate

riguardano una minore acidità totale e il conseguente aumento di pH nel Bonarda da

microvinificazione, dovuti allo sviluppo della fermentazione malolattica; e una

maggiore densità del vino nel Bonarda in purezza, dovuta alla presenza di composti

estratti durante il processo di macerazione, di cui il Bonarda da microvinificazione è

privo. Le differenze tra i vini oggetto di studio sono derivate principalmente dai diversi

trattamenti di cantina a cui sono stati sottoposti piuttosto che dalle diverse

fermentazioni impiegate.

Il colore

Il controllo costante delle componenti del colore nei due vini oggetto di studio ha

messo in luce l’importanza del processo di macerazione sul colore finale del vino e ha

62

dimostrato come la fermentazione malolattica incida, oltre che su differenti

caratteristiche organolettiche, anche nel diminuire l’intensità finale del colore. Si è

notato che nel Bonarda in purezza, sottoposto a processo di macerazione, le

componenti G e B scompaiono fin dall’inizio del processo fermentativo, mentre nel

Bonarda da microvinificazione, non macerato, sono presenti tutte e tre le componenti

del colore (R, G e B) per tutto il processo fermentativo e anche nel vino finito.

Schede tecniche

Di seguito sono riportate, in Tabella 5.1, le schede tecniche dei vini Bonarda in

purezza e Bonarda da microvinificazione. I dati riportati si riferiscono alle analisi

conclusive svolte sul vino in fase di affinamento, in data 30 Gennaio 2015, e di cui è

possibile vedere i rapporti di prova riportati in allegato.

Bonarda in purezza Bonarda da

microvinificazione

pH 3,38 3,41

Acidità tot. in acido

tartarico (g/l) 7,34 5,98

Glucosio/Fruttosio (g/l) 1,12 0,31

Acido L-Lattico (g/l) 0,25 1,12

Solforosa libera (mg/l) 74,67 2,53

Solforosa totale (mg/l) 107,83 52,94

Acido acetico (g/l) 0,48 0,69

TAV 13,67 13,22

Densità Distillato 0,98220 0,98270

Densità Vino D°20 0,99350 0,99055

A420nm 4,8191 2,2075

A520nm 8,9723 1,4216

A620nm 1,5273 0,6624

R 71 132

G 0 63

B 0 15

Tabella 5.1 Schede tecniche dei vini Bonarda in purezza e Bonarda da microvinificazione

63

Dall’analisi delle schede tecniche dei due vini è possibile individuarne le analogie e le

differenze a prodotto finito.

Una prima differenza è dovuta alla fermentazione malolattica, che si è verificata nel

vino Bonarda da microvinificazione, e ha portato come conseguenza una diminuzione

dell’acidità totale e un conseguente aumento del pH, come si può vedere dal grafico

seguente:

Grafico 5.1 Confronto dei valori di pH, acidità totale in acido tartarico e acido L-lattico

nei vini oggetto di studio

I vini risultano avere delle analogie per quanto riguarda la concentrazione finale di

zuccheri (espressa come concentrazione in g/l di glucosio e fruttosio), il TAV e la

densità del distillato, mentre la densità del vino, valutata a una temperatura di 20°C,

risulta più elevata nel Bonarda in purezza. Questo è dovuto alla presenza dei prodotti

derivati dalle bucce e dai vinaccioli durante la macerazione. Le analogie dimostrano,

invece, che i due diversi tipi di fermentazione impiegati, spontanea e indotta, non

hanno avuto grandi ripercussioni sulle caratteristiche finali del vino e possono essere

apprezzate nel grafico seguente:

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Bonarda in purezza

Bonarda da microvinificazione

pH

Acidità Tot. in Acido Tartarico (g/l)

Acido L-Lattico (g/l)

64

Grafico 5.1 Valore zuccherino, TAV e densità del distillato e del vino rilevati nei vini in

fase di affinamento

Per quanto riguarda i dati relativi al colore (visibili in allegato), è stato possibile

rilevare delle differenze: il Bonarda in purezza contiene unicamente la componente

rossa, mentre il Bonarda da microvinificazione contiene tutte e tre le componenti del

colore (rosso, verde e blu). Il primo vino risulta quindi di colore rosso, mentre il

secondo assume una colorazione mattonata. Tali differenze sono dovute

principalmente al processo di macerazione al quale è stato sottoposto il vino Bonarda

in purezza. L’assenza del processo di macerazione nel vino Bonarda da

microvinificazione sarà interessante nei futuri studi riguardanti i composti ad attività

nutraceutica presenti o meno nei due vini, in quanto saranno valutati i contributi che la

buccia dà alla composizione finale del vino per quanto riguarda la presenza di

polifenoli, antocianine e tannini.

0

2

4

6

8

10

12

14

B. in Purezza

B. da Micro

Glucosio/Fruttosio (g/l)

TAV

0,976

0,978

0,98

0,982

0,984

0,986

0,988

0,99

0,992

0,994

B. in Purezza

B. da Micro

Densità Distillato

Densità Vino D°20

65

Grafico 5.3 Valori di assorbanza A420nm, A520nm, A620nm e di R, G e B nei due vini

Un’ultima differenza rilevata riguarda l’acidità volatile, valutata come contenuto di

acido acetico espresso in g/l, e la solforosa libera e totale, espresse in mg/l, rilevate nei

due vini. In questo caso, la principale causa è da ritrovare nei trattamenti di cantina a

cui i vini sono stati sottoposti e alle differenti quantità di mosto sottoposte a

vinificazione. La presenza di una concentrazione maggiore di acido acetico nel vino

Bonarda da microvinificazione può essere anche una conseguenza della fermentazione

malolattica. Infatti, alcuni batteri acido lattici possono metabolizzare gli zuccheri esosi,

se presenti in quantità ancora elevate nel mosto, a produrre, oltre che etanolo e CO2,

acido acetico. Il seguente grafico permette di visualizzare queste differenze:

0

20

40

60

80

100

120

140

A420nm A520nm A620nm B R G

Bonarda in purezza

Bonarda da microvinificazione

66

Grafico 5.4 Valori di solforosa libera e totale e acidità volatile

5.2 Prospettive future

I vini oggetto di studio, Bonarda in purezza e Bonarda da microvinificazione, saranno

sottoposti in futuro a ulteriori analisi. Questi vini sono stati, infatti, prodotti per lavori

futuri volti a valutare la presenza dei composti ad attività nutraceutica, analizzando il

contributo effettivo della macerazione sui metaboliti con una valenza salutistica

presenti nel vino. In particolare, saranno analizzati in LC-MS, per valutare gli aromi

non volatili, e in GC-MS, per valutare gli aromi volatili presenti.

Inoltre, sarà effettuata un’analisi organolettica per valutarne la gradevolezza.

0

20

40

60

80

100

120

Solforosa libera (mg/l)

Solforosa totale (mg/l)

Bonarda in purezza

Bonarda da microvinificazione

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Bonarda in purezza Bonarda da microvinificazione

Acido Acetico (g/l)

67

6. BIBLIOGRAFIA E SITOGRAFIA

1) Distretto agroalimentare di qualità del vino dell’Oltrepò Pavese – Bonarda e Pinot

dell’Oltrepò.

http://www.google.it/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=4&ved=0CDEQFj

AD&url=http%3A%2F%2Fwww.pavia.coldiretti.it%2FRenderImg.aspx%3FCI%3D43

069167&ei=jNm7VIuIG4G9ULqpgZAG&usg=AFQjCNHQGt38a8sbkVWcJNIQFtI5

8yj0RA

2) Luciamo M., Storia di un territorio rurale – Vigne e vini nell’Oltrepò Pavese –

Ambiente, società, economia. FrancoAngeli. 2010

3) http://oltrepòpavese.com/op-in-cifre

4) Pecile M., Zavaglia C., Ciardi A., Croatina. catalogoviti.politicheagricole.it.

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6) Martins G., Miot-Sertier C., Lauga B., Claisse O., Lonvaud-Funel A., Soulas G.,

Masneuf-Pomarède I., Grape berry bacterial microbiota: Impact of the ripening

process and the farming system. International Journal of Food Microbiology. 2012,

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microbial consortia. Appl Microbiol Biotechnol. 2007, 75: 149–164

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– Microbiologia del vino Vinificazioni. Edagricole. 2005

10) Xufre A., Albergaria H., Gìrio F., Spencer-Martins I., Use of interdelta

polymorphisms of Saccharomyces cerevisiae strains to monitor population evolution

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12) http://www.workwithcolor.com/color-converter-01.htm

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14) Querol A., Barrio E., Huerta T., Ramon D., Molecular Monitoring of Wine

Fermentations Conducted by Active Dry Yeast Strains. Applied and Environmental

Microbiology. 1992, 2948-2953

69

ALLEGATI

10.00

10.20

10.40

10.60

10.80

11.00

11.20

11.40

11.60

11.80

12.00

12.20

12.40

12.60

12.80

13.00

13.20

13.40

13.60

13.80

14.00

14.20

14.40

14.60

14.80

15.00

15.20

15.40

15.60

15.80

16.00

16.20

16.40

16.60

16.80

17.00

17.20

40.05

40.85

41.70

42.50

43.35

44.20

45.00

45.85

46.70

47.55

48.35

49.20

50.05

50.90

51.75

52.60

53.45

54.30

55.15

56.00

56.85

57.70

58.55

59.40

60.25

61.10

62.00

62.85

63.70

64.55

65.40

66.30

67.15

68.00

68.90

69.75

70.65

5.60

5.75

5.85

5.95

6.05

6.20

6.30

6.40

6.50

6.60

6.75

6.85

6.95

7.05

7.20

7.30

7.40

7.50

7.65

7.75

7.85

7.95

8.10

8.20

8.30

8.40

8.55

8.65

8.75

8.85

9.00

9.10

9.20

9.30

9.40

9.55

9.65

8.60

8.75

8.95

9.10

9.30

9.45

9.65

9.80

10.00

10.15

10.30

10.50

10.65

10.85

11.00

11.20

11.35

11.50

11.70

11.85

12.05

12.25

12.40

12.55

12.75

12.90

13.10

13.25

13.45

13.65

13.80

13.95

14.15

14.30

14.50

14.65

14.80

4,80

4.95

5.10

5.20

5.30

5.45

5.60

5.70

5.85

6.00

6.10

6.20

6.35

6.50

6.60

6.70

6.90

7.00

7.10

7.20

7.35

7.50

7.60

7.75

7.90

8.00

8.15

8.30

8.40

8.50

8.65

8.80

8.90

9.05

9.20

9.30

9.45

TABELLA DI COMPARAZIONE S.I.M. - JAULMES - ICUMSA

BRIX OECHSLEd 20/20

BAUME' BABO ALCOOLPROBABILE

enotre

ENOTRE s.r.l.via Gorizia 334070 Farra d'Isonzo GO

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TABELLE DI COMPARAZIONE

DEI VALORI RIFRATTOMETRICI, DENSIMETRICI

ED ALCOOL PROBABILE NEI MOSTI D'UVA

GRADO BRIXIl grado Brix corrisponde ai kg di saccarosio per 100 kg di soluzione.

OECHSLE' (Oe.)Corrisponde alle prime tre cifre decimali della densità relativa 15/15.Il grado Oechslè può essere riferito anche alla densità 20/20 con opportuna correzione.

Correzioni da apportare alla lettura al rifrattometro eseguita a temperature diverse da 20° C.

8° C

10° C

12° C

14° C

16° C

18° C

20° C

0,60

0,60

0,40

0,30

0,20

0,10

0,00

22° C

24° C

26° C

28° C

30° C

32° C

34° C

0,10

0,20

0,40

0,60

0,70

0,90

1,10

TOGLIERE AGGIUNGERE

temp. temp. correzionecorrezione

Correzioni da apportare al grado Oechslè dei mosti letto a temperature diverse da 15° C

6° C

8° C

10° C

12° C

14° C

15° C

2,20

1,80

1,40

0,80

0,30

0,00

16° C

18° C

20° C

22° C

24° C

26° C

28° C

30° C

32° C

34° C

0,30

0,80

1,40

2,10

2,80

3,50

4,20

4,90

5,70

6,50

TOGLIERE AGGIUNGERE

temp. temp. correzionecorrezione

La correzione viene applicata al valore del grado zuccherino.

17.40

17.60

17.80

18.00

18.20

18.40

18.60

18.80

19.00

19.20

19.40

19.60

19.80

20.00

20.20

20.40

20.60

20.80

21.00

21.20

21.40

21.60

21.80

22.00

22.20

22.40

22.60

22.80

23.00

23.20

23.40

23.60

23.80

24.00

24.20

24.40

24.60

24.80

25.00

25.20

25.40

25.60

25.80

26.00

26.20

26.40

26.60

26.80

27.00

27.20

27.40

27.60

27.80

28.00

9.60

9.70

9.85

10.00

10.10

10.25

10.40

10,50

10.65

10.80

10.90

11.05

11.20

11.30

11.45

11.60

11.70

11.85

12.00

12.10

12.25

12.40

12.50

12.65

12.80

12.90

13.05

13.20

13.35

13.50

13.60

13.75

13.90

14.00

14.15

14.30

14.45

14.60

14.70

14.85

15.00

15.10

15.25

15.40

15.50

15.65

15.80

15.95

16.10

16.20

16.35

16.50

16.60

16.75

15.00

15.15

15.30

15.50

15.70

15.85

16.05

16.20

16,40

16.55

16.70

16.90

17.05

17.25

17.40

17.60

17.75

17.90

18.10

18.25

18.45

18.60

18.80

18.95

19.10

19.30

19.45

19.65

19.80

20.00

20.15

20.35

20.50

20.70

20.85

21.00

21.20

21.40

21.55

21.70

21.90

22.05

22.25

22.40

22.60

22.75

22.95

23.10

23.25

23.45

23.60

23.80

23.95

24.15

71.50

72.40

73.25

74.15

75.00

75.90

76.75

77,65

78.55

79.40

80.30

81.20

82.10

82.95

83.85

84.75

85.65

86.55

87.45

88.35

89.25

90.15

91.05

91.95

92.85

93.75

94.65

95.55

96.45

97.40

98.30

99.20

100.10

101.05

101.95

102.85

103.80

104.70

105.65

106.55

107.50

108.40

109.35

110.25

111.20

112.15

113.05

114.00

114.95

115.85

116.80

117.75

118.70

119.65

9.75

9.90

10.00

10.10

10.20

10.35

10.45

10,55

10.65

10.75

10.90

11.00

11.10

11.20

11.35

11.45

11.55

11.65

11.80

11.90

12.00

12.10

12.20

12.35

12.45

12.55

12.65

12.80

12.90

13.00

13.15

13.25

13.35

13.45

13.55

13.70

13.80

13.90

14.00

14.10

14.25

14.35

14.45

14.60

14.70

14.80

14.90

15.00

15.15

15.25

15.35

15.45

15.60

15.70

TABELLA DI COMPARAZIONE S.I.M. - JAULMES - ICUMSA

BRIX OECHSLEd 20/20

BAUME' BABO ALCOOLPROBABILE

AEROMETRO BAUME'La scala comprende valori da 0 a 66. Lo zero corrisponde a d15/15 = 1 e il 66 a d15/15 = 1,8427 quella del acido solforico puro.

Correzioni da apportare al grado Baumè dei mosti letto a temperature diverse da 15° C

6° C

8° C

10° C

12° C

14° C

15° C

0,30

0,30

0,20

0,10

0,00

0,00

16° C

18° C

20° C

22° C

24° C

26° C

28° C

30° C

32° C

34° C

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,50

0,60

0,70

0,80

TOGLIERE AGGIUNGERE

temp. temp. correzionecorrezione

MOSTIMETRO BABO DI KLOSTERNEUBURGRicavato dal saccarometro Brix o Balling, dopo aver tenuto in conto le sostanze estrattive del mosto, esprime la percentuale in peso (% p/p) di zucchero, praticamente i kg di zucchero contenuti in 100 kg di mosto.

Correzioni da apportare al grado Babo dei mosti letto a temperature diverse da 15° C

6° C

8° C

10° C

12° C

14° C

15° C

0,40

0,30

0,20

0,10

0,00

0,00

16° C

18° C

20° C

22° C

24° C

26° C

28° C

30° C

32° C

34° C

0,00

0,10

0,20

0,40

0,50

0,60

0,70

0,90

1,00

1,10

TOGLIERE AGGIUNGERE

temp. temp. correzionecorrezione

Correzioni da apportare al grado Babo dei mosti letto a temperature diverse da 17,5° C

6° C

8° C

10° C

12° C

14° C

15° C

16° C

17° C

0,70

0,60

0,50

0,40

0,30

0,20

0,10

0,00

18° C

20° C

22° C

24° C

26° C

28° C

30° C

32° C

34° C

0,00

0,10

0,20

0,40

0,50

0,60

0,70

0,90

1,00

TOGLIERE AGGIUNGERE

temp. temp. correzionecorrezione