Ann. I.st Suprr. So>i,ià

Vol. 20, N. 4 (1984). pp. 297-306

BRUCELLA CANIS, CAMPYLOBACTER JEJUNZ, DF-2 (DISGONIC FERMENTER TYPE2): PROFILI TECNICO-DIAGNOSTICI DI ENTITÀ MORBOSE EMERGENTI, A CARATTERE ZOONOSICO, DEL CANE

F. CIUCHINI, G . PICCININNO, R. FISCHETTI e C. PISTOIA

Laboratorio di Medicina Veterinaria, Istituto Superiore di Sanità, Roma

Riassunto - Gli autori descrivono i profili diagno- stici di laboratorio di agenti microbici a carattere zoonosico del cane. B. canis. C. jejuni r DF-2 sono tra i più recenti microrganismi isolati da popolazioni canine urbane di cui è stato dimostrato il contagio diretto per I'uomo.

Summary (Brucella canis, Campylobacter jejuni, DF-2 (disgonic fermenter type-2): diagnosis of some new zoonoses of dog). - Laboratory diagnostic tec- niques of some canine zoonotic agents have been described. B. canis. C. jejuni and DF-2 are rhe most recent organism isolated fram dogs in a town in which the direct injection lo human has heen demonstrated.

Il cane, animale tradizionalmente presente in am- biente urbano, gioca senza dubbio un ruolo di con- giunzione fondamentale nella trasmissione diretta di agenti patogeni all'uomo.

In questi ultimi anni si sono segnalate nuove entità morbose e nuovi agenti microbici a carattere zoono- sico che avrebbero proprio nel cane la loro primaria localizzazione fino a trovare in esso l'ospite naturale per instaurarsi e perpetuarsi in aree metropolitane, costituendo una fonte potenziale di rischio d'infezio- ni trasmissibili all'uomo [I].

La Brucella canis [2]. il Campylobacter jejuni [3], il DF-2 (disgonic fermenter type-2) [4], sono appunto tra i più recenti microrganismi isolati da popolazioni canine urbane, di cui è stato dimostrato il contagio diretto per I'uomo. Queste specie batteriche hanno acquistato nuove capacità biologiche nell'ambito di un'ecologia microbica che si modifica, emergendo dal loro ordinario stato saprofitico (C. jejuni, DF-2) oppure diventando entità microbiche più specifiche (B. cani.^). determinando comunque in generale un aumento della patologia infettiva.

L'interesse attuale per tali microrganismi. anche nel nostro paese, è lo stimolo chiave per esemplificar- ne i profili tecnico-diagnostici secondo schemi adot-

tati nel laboratorio di Medicina Veterinaria durante indagini di sorveglianza epidemiologica effettuate su cani d'affezione o randagi della città di Roma [5-71.

La Brucellosi da Brucella cunis

Descritta per la prima volta negli USA nel 1966 da Carmichael [8], la Brucellosi da Brucella canis è un'infezione fino ad oggi segnalata esclusivamente nei cani e non legata alla razza, al sesso e alla età. Responsabile di aborti a carattere enzootico nelle cagne e di epididimiti, atrofie testicolari, ipertrofie prostatiche ed infertilità nei maschi progredisce in assenza di sindrome febbrile contrariamente alle altre brucellosi conosciute.

Il suo carattere zoonosico, dimostrato nel 1968 con il contagio accidentale di un laboratorista, è stato successivamente confermato dall'isolamento contemporaneo dell'agente etiologico nel cane e nel suo proprietario [9].

L'infezione è stata segnalata in Europa da Kmen- dener nel 1974 [IO] in cani della Germania. In Italia non è stata ancora identificata né clinicamente osser- vata anche se alcune indagini siero-epidemiologiche su popolazioni canine riportano casi sierologicamen- te positivi a diversi livelli di significatività che stanno ad indicare una presunta presenza della brucellosi canina anche nel nostro paese [5].

La B. canis è un germe che possiede le caratteristi- che morfologiche e biochimiche della B. suis e le caratteristiche antigeniche della B. ovis.

Le ricerche siero-epidemiologiche di Hoff et al. [I I] fanno sospettare l'esistenza di questo germe in animali selvatici (conigli, procioni. coyotes. oche canadesi): attualmente sono stati segnalati come sensibili alla B. canis anche il lupo, la volpe. i l coyote, la lince, la scimmia.

Gli animali infetti eliminano la B. canis con le secrezioni utero-vaginali, latte, urina. sperma. È

stato chiaramente dimostrar0 che i feti e gli annessi embrionali che provengono da aborti di cagne infette sono i materiali da cui è possibile isolare più facil- mente la brucella altamente virulenta.

La trasmissione di questa infezione avviene per contatto con materiale fetale e con scolo vaginale. per contatto venereo e per infezione congenita che permettono la penetrazione del germe per via cuta- nea a livello di soluzioni di continuo, per via vaginale e per via digestiva in casi di ingestione di materiale infetto.

Diugnosi clinica

La brucellosi canina, come abbiamo detto. non presenta reazioni febbrili: possono farla sospettare qualunque aborto spontaneo a carattere contagioso intorno al 50' giorno di gravidanza e distocia, anomalie genitali quali I'epididimite, I'atrofia testi- colare, la prostatite, l'edema dello scroto, la derma- tite scrotale e la sterilità nei maschi e spondilite. Altri segni clinici generali sono legati al sistema reticolo endoteliale. e si manifestano con una iper- trofia dei linfonodi più o meno estesa, uni o bilate- rale. e splenomegalia.

Spesso, comunque, la brucellosi canina procede in forma inapparente, asintomatica. Sintomi e lesioni non sono patognominici: questi non possono che costituire un sospetto clinico di laboratorio che deve assolutamente trovare conferma negli accertamenti di laboratorio.

Anche le lesioni osservate sui feti abortiti non sono più di tanto specifiche cosi come lo scolo vaginale mucoemorragico o mucopurolento altamente infetto che residua dagli aborti e che perdura da una a sei settimane.

Diagnosi horteriologicu

L'isolamento di B. cani.? si effettua principalmente a partire dal sangue, da essudato vaginale di cagne dopo l'aborto e da tessuti abortiti di origine materna (placenta, liquido allantoideo) o fetale (polmoni. fegato. milza. gangli mesenterici. reni).

L'emocoltura è la tecnica più comune in quanto la batteriemia è molto lunga. La fase batteriemica dell'ordine di 10 mesi fino ad un massimo di 2 anni sembra che sia una delle caratteristiche peculiari della brucellosi nel cane naturalmente infetto.

La tecnica può essere cosi schematizzata. Seminare direttamente 0.1 rnl di sangue eparinato

(I'EDTA è un inibitore di crescita) in ciascuna pia- stra di agar tryptose o agar brucella (Oxoid).

Oppure seminare sangue in roto in brodo comune in rapporto 115 (v/v).

Oppure seminare coaguli ematici (115). dopo allon- tanamento del siero, in infuso di cuore-cervello (Brain Heart Infusion Oxoid CM 225). Al brodo può essere aggiunto 1.4 m1 di cristal violetto, in soluzione acquosa allo 0.1% su 1000 ml di brodo. L'aggiunta

di cristal violetto inibisce l'eventuale presenza di germi contaminanti, che sono prevalentemente specie diverse di cocchi gram-positivi. raramente in associa- zione con flora mista gram-negativa.

Un altro metodo consigliato dall'OMS [l31 per i'isolamento delle brucellc in generale è quello di Castaiieda che consiste nel seminare 10 ml di sangue con anticoagulante in bottiglie di Roux allestite con agar brucella solidificato lungo una parete e ricoper- to di brodo.

Incubare i terreni seminati a 37 "C per almeno 6 giorni. Per le colture in brodo. l'incubazione puO protrarsi fino a 20 giorni, praticando al 10" e 20" giorno trapianti in agar-tryptose da porre in incuba- zione per 3 o 4 giorni.

Tutte le piastre dopo incubazione vengono esami- nate a luce riflessa obliqua per scegliere le colonie morfologicamente sospette (piccole. rotonde, aderenti al terreno) e sottoporle ad una identificazione pre- suntiva con la prova di agglutinazione rapida su vetrino in presenza di siero monospecifico anti-canis in parallelo con sieri monospecifici per le forme lisce (ohortus, melitcvtsis). Le colonie di B. canis sono infatti in fase mucoide (M) cioè in una fase interme- dia tra la R (Rough) e la S (Smooth). La B. cani.? è priva degli antigeni A e M tipici delle forme lisce.

Immunosieri anti-cani.? si possono preparare facil- mente immunizzando conigli per via endovenosa con 2 ml di sospensione batterica allestita con il ceppo di referenza RM 6/66. inattivato. Dopo 2 richiami di cui uno, a 4 settimane di distanza. con una sospen- sione batterica viva. i conigli. dopo 7-10 giorni. vengono salassati ed il siero di ciascun soggetto saggiato con colture omologhe ed eterologhe. I sieri con un buon titolo anti-cunis vengono mescolati. addizionati con mertiolato 1: 10.000. distribuiti in fiale e conservati a - 4 "C.

B. ronis, nella prova rapida di agglutinazione su vetrino per l'identificazione può presentare un certo grado di agglutinabilità in presenza di siero anti-for- me lisce e di siero normale. Pertanto devono essere saggiate in parallelo delle colture di referenza per apprezzare la vitalità ed il grado di agglutinazione dei ceppi isolati.

Gli isolamenti da essudato vaginale e da tessuti abortiti di origine materna o fetale (placenta, liquido allantoideo, polmoni. fegato, milza. gangli mesenteri- ci. reni) si eseguono seminando frammenti o conte- nuti d'organo. prelevati asetticamente, nei terre- ni liquidi citati oppure per impronta su piastre di agar-brucella o agar tryptose.

Le colture vengono incubate a 37 "C dopodiché si procede come per I'emocultura. Dopo I'identificazio- ne delle colonie con la prova rapida di agglutinazio- ne, i ceppi isolati verranno sottoposti all'esame mor- fologico e biochimico.

B. cunis è un germe gram-negativo. coccobacillare. piccolo (0.5 x 2 ~ ) . atrico, immobile. acapsulato.

Da un punto di vista biochimico presenta le se- guenti caratteristiche: non cresce su terreno Mac-

Conkey, è ossidasi e catalasi positivo. idrolizza l'u- rea. non fermenta i carboidrati, produce H2S, riduce i nitrati, cresce in presenza di tionina ed è inibita dalla fucsina, non viene lisata dal fago Tb. [12-141.

Diagnosi sierologica

I cani infetti con B. canis producono anticorpi agglutinati che è possibile rilevare con tecniche di siero-agglutinazione classica. La prova sierologica deve essere allestita con un antigene B. cunis in quanto è un germe che, come abbiamo detto. presen- ta particolari caratteri che lo distinguono nettamente da B. ahortus, B. melitensis e B. suis: è privo infatti di antigeni A e M ed è in fase mucoide. Per eliminare le reazioni falsamente positive dovute al carattere mucoide della B. canir si allestiscono prove di agglu- tinazione al mercaptoetanolo. avvalendosi di due metodiche: test di agglutinazione lenta in tubi [l31 e test di agglutinazione rapida su vetrino con antigene colorato [15].

I l primo test si allestisce con un antigene B. canis ceppo RM 6/66, coltivato in fiasche di Roux conte- nenti agar-tryptose al 2% ed incubare per 24-48 ore. Le patine colturali vengono rimosse con l'aggiunta di 20 ml di soluzione fisiologica tamponata (pH 7.24.15M) e di palline di vetro. Si filtra attraverso più strati di garza la sospensione madre cosi ottenu- ta, si inattiva a 70 "C per I ora, si raffredda, si centrifuga a 10.000g per 30'. si allontana il surnatan- te, si risospende il sedimento con soluzione tampone contenente lo 0,5% di formolo.

Si aggiusta la concentrazione dell'antigene al 4.5% di cellule con i l metodo dei tubi di Hopkins. si ripartisce I'antigene concentrato in flaconi che si conserveranno a 4 O C fino al momento dell'uso in cui la sospensione antigenica madre si diluirà ad una concentrazione di cellule batteriche dello 0.2% (v/v).

Il diluente per la prova di agglutinazione è costi- tuito da una soluzione di cloruro di sodio 3,5%, formolo 0,06%, 2-mercaptoetanolo a O.IM.

La prova prevede la diluizione decimale per rad- doppio dei sieri da saggiare a partire dalla diluizione iniziale di 1 : 50 (a diluizioni inferiori le reazioni possono essere falsamente positive). Si pongono in ogni provetta 0.5 ml di ciascuna diluizione e 0.5 di antigene, si agita e si pone in incubazione a 37 "C per 48 f 3 ore.

La lettura della prova di agglutinazione considera i l grado di chiarificazione del miscuglio antigene-sie- ro. I'aspetto ed il volume del sedimento agglutinato ed il grado di disgregazione del sedimento dopo dolce agitazione della provetta.

Sono considerati negativi i sieri con titoli aggluti- nanti <1/100, dubbi o sospetti i sieri con titoli = 11200 e positivi sieri con titoli 2 1/400.

I l test di agglutinazione rapida su vetrino con antigene inattivato e colorato si può avvalere di reagenti preparati in «kit» commerciali. Esso preve- de l'esecuzione associata di due prove: il Rapid Slide

Agglutination Test (RSAT) ed il 2-Mercaptoethanol Rapid Slide Agglutination Test (2M-RSAT) che permettono una specifica siero-diagnosi per la bru- cellosi canina rimuovendo con il 2-mercaptoetanolo le agglutine aspecifiche che alcune volte si rinvengo- no nei sieri di cani normali, non infetti.

Queste due prove eseguite in successione hanno dimostrato. secondo ricerche effettuate in USA [l61 una eccellente correlazione con il test di agglutinazio- ne lenta in provetta con 2-mercaptoetanolo. in sieri di cani infettati sperimentalmente.

Il test di agglutinazione rapida su vetrino consiste essenzialmente nel miscelare su vetrino volumi uguali di antigene e di siero in esame (gocce di 0,03 ml) e nell'esaminare in buone condizioni di illuminazione l'eventuale presenza di agglutinati entro due minuti.

Quando un siero positivo al RSAT risulta positivo anche al 2M-RSAT, l'animale è presuntivamente infetto da B. canis.

Prima di procedere alla esecuzione di queste prove rapide è opportuno stabilizzare a temperatura am- biente i sieri e gli antigeni necessari.

La diagnosi sierologica della brucellosi nel cane si può avvalere anche della fissazione del complemento e della prova di diffusione in agar che tuttavia non crediamo opportuno descrivere in quanto nella prati- ca le prove di agglutinazione descritte sono sufficien- temente attendibili.

La Campylobactenosi da C. jejuni

I campylobacter sono germi noti da molto tempo nel campo della patologia infettiva animale, ma solo in questi ultimi anni i l Campylohac!er jejuni è stato sempre più Irequentemente associato a sindromi diarroiche acute nei cani. in particolare nei cuccioli: i lavori [ l 7-27] lo dimostrano chiaramente.

Questi stessi autori ed altri hanno comunque isola- to tale microrganismo, in alta percentuale. anche da soggetti clinicamente asintomatici, e ciò sottolinea i l suo «opportunismo» nell'ambito della patologia gastroentenca del cane.

Le possibili correlazioni ed associazioni epidemio- logiche tra enterite canina ed enterite umana (sovente dei bambini) più volte sostenute da questo microrga- nismo [28-321, fanno della campylobacteriosi canina una nuova zoonosi ubiquitaria a ciclo urbano [33-341, sebbene non si sia avuto ancora un solo caso epidemiologico che possa chiaramente indicare un rapporto di causa-effetto con i cani stessi.

L'azione patogena del C. jejuni non è stata ancora ben chiarita nei cani: sembra che il meccanismo patogeno con cui questo germe determina la malattia sia quello della invasività.

L'infezione sperimentale con stipiti isolati dall'uomo in cuccioli ha causato soltanto una leggera enterocolite e linfc+adenomatosi mesenterale in alcuni casi.

Nell'ambito della patologia gastroenterica canina la campylobacteriosi è spesso un'infezione batterica

di sovrapposizione o di irruzione secondaria come è stata segnalato in relazione alla parvovirosi [35]. alle salmonellosi [21] e ad altre infezioni o infestazioni intestinali [36].

C. jeiuni è un germe ubiquitario e può comportarsi come saprofita o patogeno che causa enteriti soprat- tutto nel periodo primavera-estate, in soggetti giova- ni o defedati.

Diagnosi eli~iica

I l principale sintomo clinico della campylobacte- riosi è la diarrea profusa in cuccioli o giovani cani stressati. che può essere abbondante, maleodorante. accompagnata talvolta dalla presenza di sangue schietto o di sangue occulto.

Non esistono segni prodromici. la malattia si ma- nifesta in forma enterica o gastroenterica.

Le manifestazioni cliniche sono molto variabili e vanno da casi asintomatici o molto leggeri ad una sintomatologia diarroica acuta o cronica. tipica delle enterocoliti.

Nel cane non è stata ancora dimostrata una pato- genicità primaria di questo germe che invece si so- vrappone a infezioni o infestazioni di compromissio- ne intestinale. È pertanto necessaria una stretta collaborazione del laboratorio di microbiologia clini- ca per una corretta diagnosi che solo l'isolamento del germe può stabilire.

Diagnosi haitrriolo~iea

Prima dell'affermarsi dei terreni selettivi per Campy- lobacter, la diagnosi batteriologica comportava nume- rosi problemi. La coprocoltura. come tecnica d'elezione per l'esame batteriologico, non permetteva facili isola- menti per la preponderante flora microbica enterica che mascherava la crescita del Campylobacter.

Il primo metodo messo a punto per l'isolamento selettivo di questo germe consisteva nel filtrare una sospensione di feci in brodo nutritivo semplice attra- verso membrane con porosità 0.65 pm che trattene- vano il resto della flora microbica enterica [37].

Questo metodo è stato oggi completamente abban- donato in quanto sono stati messi a punto terreni con funzione elettiva-selettiva come quello di Butzler e / al. 1381 e di Skirrow [28] che sono i più comune- mente usati. Il terreno di Butzler è un agar tioglicol- lato con il 7% di sangue lisato di pecora, contenente bacitracina 25 Ul/ml, novobiocina 5mcg/ml, actidio- ne 50 mcg/ml, colistina 10 Ul/ml e cefalotina 15 mcg/ml.

Il terreno di Skirrow è invece un agar addizionato con 5-7% di sangue di cavallo lisato, contenente vancomicina I O mcg/ml, polimixina B solfato 2,s UI/ml e trimethoprim 5 mcg/ml.

11 campionamento delle feci può essere fatto con tampone oppure per raccolta diretta di materiale fecale fresco.

Se non fosse possibile seminare immediatamente. e consigliabile una semina preventiva dei campioni in terreno di trasporto o di mantenimento quali brodo al tioglicollato con l'aggiunta dello 0,6% di agar e antibiotici per la conservazione a 4 "C [39]. oppure agar-brucella con aggiunta del 10% di sangue di pecora per una conservazione del germe a 25 "C per circa 3 settimane [40] oppure acqua peptonata alcali- na come proposto da Tanner (411.

Prima della semina diretta è opportuno sospendere i campioni di feci in soluzione fisiologica nella pro- porzione di 1 a 3 (v/v).

Utilizzando la microscopia a contrasto di fase o in campo oscuro è possibile evidenziare a fresco la presenza del Campylobacter direttamente nelle feci.

Il microrganismo è tipico per i suoi rapidi movi- menti di oscillazione e di rotazione assiale: inoltre , con obiettivi a maggior risoluzione si può riconoscere anche la forma a spirale, sebbene una identificazione oggettiva non è possibile che attraverso l'isolamento in coltura pura.

L'isolamento del Campylobacter dalle feci si effet- tua allestendo coprocolture in piastre contenenti, come abbiamo detto, terreni selettivi.

Le piastre vanno incubate in tensione ridotta di ossigeno (circa 6%): allo scopo può essere utilizzata una giara anaerobica. senza catalizzatore. contenente reagenti generatori di H 2 e C 0 2 secondo il sistema GAS-PAK (Oxoid o BBL).

La temperatura di incubazione è di 37 "C; meglio porre le piastre a 43", considerata la temperatura massima di crescita del C. jejuni. ottenendo di conse- guenza una maggiore e rapida selettivita.

La crescita delle colonie avviene di solito dopo 2 4 4 8 ore di incubazione: sono colonie tipicamente piatte, piccole, puntiformi (meno di I mm di diame- tro),trasparenti. di colore camoscio-grigiastre. che tendono a diffondersi lungo la traccia di semina lasciata dall'ansa, e che possono sciamare in piastre particolarmente umide.

Le colonie tipiche vengono sottoposte all'esame microscopico allestendo vetrini su cui vengono emul- sionate, fissate e colorate secondo Gram, e vetrini a fresco per lo studio della motilita.

Il C. jejuni è un microrganismo sottile (0,2-0.5 pm). gram-negativo, di forma a spirale o ad S con estremità appuntite, anfitrico.

Accanto a forme brevi, si trovano anche forme lunghe con 3 o 4 ondulazioni soprattutto in primo isolamento. Nelle colture molto vecchie prevalgono le forme bacillari o coccoidi che perdono la motilità. È amfitrico e ciò lo fa differenziare dal C. fetus che è monotrico e con spire più aperte.

All'esame a fresco. al microscopio a contrasto di fase, le forme a spirale hanno un movimento di rotazione sull'asse longitudinale senza flessioni late- rali.

I Campylobacter sono microrganismi ossidasi e catalasi positivi, non ossidano né fermentano i car- boidrati. Per i l riconoscimento e l'identificazione dei