BIOSENSORI NEI PRODOTTI DELL’APICOLTURA

Roberto Eggenhöffner

Professore di Fisica Applicata*

Università di Genova

* (a beni culturali, ambientali, biologia e medicina)

X Convegno del Centro Apistico Regionale – Asti – IZSTO – 18 Ottobre 2019

SENSORE: COSA INTENDIAMO ?

Un dispositivo che in apparecchiature o meccanismi rileva i valori

di una grandezza e ne trasmette le variazioni a un sistema di

misurazione o di controllo

Può essere basato su principi:

Meccanici

Elettronici

Chimici

Biologici

TRASDUTTORI

• In metrologia, la trasformazione della grandezza d'ingresso in un segnale di altra natura in uscita è definita trasduzione

• I dispositivi in commercio spesso integrano al loro interno anche alimentatori stabilizzati, amplificatori di segnale, dispositivi di comunicazione remota, ecc

• Un sistema completo comprende l’elemento sensibile (il sensore vero e proprio) e la

strumentazione. In uno schema a blocchi semplificato:

ESEMPI DI APPLICAZIONI: sensori di luce (o sensori ottici): fotocellule, fotomoltiplicatori, fotodiodi, fototransistor, CCD, CMOS, sensori a infrarossi, rilevano la presenza di persone in un ambiente sensori di suono: microfoni, idrofoni, altoparlanti sensori di accelerazione: accelerometri, sensori sismici sensori di temperatura: termometri, termocoppie, resistori, termistori, termometri bimetallici e termostati sensori di calore: bolometri, calorimetri sensori di radiazione: contatori Geiger, dosimetri sensori di particelle subatomiche: scintillometri, camere a nebbia, camere a bolle, camere di ionizzazione sensori di resistenza elettrica: ohmmetri, multimetri sensori di corrente elettrica: galvanometri, amperometri sensori di tensione elettrica: elettroscopio, voltmetri sensori di potenza elettrica: wattmetri sensori di magnetismo: magnetometri, effetto Hall sensori di pressione: barometri, barografi, misuratori di pressione, altimetri, variometri sensori di gas e flusso di liquidi, Sensori di gas, anemometri, flussimetri, pluviometri, velocità dell'aria sensori di movimento: radar, velocimetri, tachimetri, odometri, sensori PIR sensori di orientamento: giroscopi, orizzonte artificiale, giroscopi laser, sensori di posizione (GPS) sensori di forza: celle di carico, estensimetri sensori di prossimità: interruttori ottici (LED o laser) sensori di distanza a LED o laser

E I BIOSENSORI?

Un biosensore è un particolare dispositivo analitico costituito da un elemento sensibile biologicamente attivo (enzimi, cellule, anticorpi ecc)

Da cosa è composto un biosensore?

Ogni biosensore è caratterizzato da particolari elementi in grado di ottimizzare il dispositivo in base alla specifica molecola bersaglio da rilevare.

Possiamo distinguere il componente biologico e i metodi di immobilizzazione, il substrato, il trasduttore

• Il substrato

• Il substrato è una parte del biosensore in grado di reagire con il componente biologico

attraverso reazioni chimiche o fisiche che possono avvenire solo in presenza dello specifico target biologico da rilevare (vedremo esempi!)

• Tipicamente il campione (liquido) da analizzare viene messo in contatto con il substrato, in

modo da permettere la reazione di rilevazione dell’analita.

DETTAGLI SUI BIOSENSORI• Il componente biologico

• Il componente biologico è di fondamentale importanza in quanto costituisce l’elemento che

conferisce la selettività al sensore

• Esso infatti interagisce con un solo specifico elemento del substrato per mezzo di una reazione o rimanendovi attaccato.

• I quattro maggiori gruppi di elementi utili a questo scopo sono gli enzimi, gli anticorpi, gli acidi

nucleici e i recettori

Analita Trasduttore

Misurazione segnale

analogico

Bio-Recettore

Catena di trasduzione

METODI DI IMMOBILIZZAZIONE I metodi di immobilizzazione permettono di far aderire il componente biologico con alla superficie del

supporto inerte; sono importanti per allungare la vita della componente bio del sensore e renderlo ri-

utilizzabile

I più importanti per attaccare il biomateriale sono i seguenti

1. l’adsorbimento ad una superficie. L’adsorbimento di tipo fisico si basa sulla combinazione di interazioni di Van der Waals, ponti a idrogeno, forze ioniche, legami covalenti

2. l microincapsulamento, ovvero l’intrappolamento tra due membrane, permette uno stretto e stabile

contatto tra il biomateriale e il trasduttore

3. l’intrappolamento in un gel polimerico. Purtroppo, questo può causare delle barriere alla diffusione del substrato, rallentando così la reazione

D I F F E R E N Z E ! ! ! !

• In un biosensore il recettore utilizza un meccanismo biochimico:perciò una delle proprietà fondamentali è la selettività, cioè lacapacità di riconoscere e quindi rispondere ad una specifica

sostanza biochimica (è il grande vantaggio offerto dai biosensori)

• I biosensori descritti in letteratura presentano limitazioni e

inconvenienti tecnici: ridotta portabilità, risposte con cinetichemolto lente e deteriorabilità piuttosto rapida degli elementi

sensibili

Biosensori vs Sensori

STATUS DELLA BIOSENSORISTICA

Reale presenza di biosensori sul mercato

Progetti di ricerca sull’utilizzo di biosensori

Reale presenza di biosensori sul mercato

SONO ESSENZIALMENTE DI TIPO BIOMEDICALE! e-bay - Amazon

sensori di frequenza cardiaca ad impulso per Arduino

rileva l'attività elettrodermicaper determinare il rilassamento o lo stress

MicroprocessoreArduino

MONITORAGGIO DELLA GLICEMIA• Un gruppo di industrie come Universal Biosensors, LifeScan e Johnson

& Johnson hanno sviluppato i biosensori elettrochimici per il rilevamento

della glicemia che sono ora disponibili a livello globale• Abilita letture in pochi secondi dei livelli di glucosio nel sangue• utilizza un piccolo campione di sangue con puntura del dito (< 0,5 µL)

• Il risultato non è influenzato dalla presenza di zuccheri non correlati ..(maltosio e galattosio)

• Questi semplici dispositivi hanno permesso ai pazienti il controllo nell’assumere dei farmaci per l'insulina con notevoli progressi nella qualità della vita dei diabetici.

• Oggi si stima che ogni anno i diabetici utilizzino circa 17 miliardi di strisce di sensori usa e getta

che utilizzano celle elettrochimiche

• Questo rimane il più grande mercato nel segmento dei punti di assistenza ed è stato valutato a oltre 9,8 miliardi di dollari a livello globale e in crescita

SENSORE DELLA COAGULAZIONE• La Warfarina è un farmaco assunto per via

orale o per iniezione in una come

anticoagulante del sangue. Tratta la trombosi venosa profonda, l’embolia polmonare e previene l'ictus nelle persone

che hanno fibrillazione atriale, cardiopatia valvolare o valvole cardiache artificiali

• Il dosaggio accurato del farmaco è un

requisito fondamentale

• Se i pazienti assumono troppo warfarin sono a rischio di eventi emorragici gravi e

se troppo poco sono a rischio di trombosi

• Universal Biosensors con Siemens ha adattato la sua cella elettrochimica per misurare il tempo

di protrombina e monitorare l'effetto della terapia anticoagulante warfarin

• Si stima che oltre 10 milioni di persone

assumano warfarin e oltre 200 milioni di test col il sensore ogni anno in tutto il mondo

• Il mercato del monitoraggio della coagulazione

presso il punto di cura valga circa 1 miliardo di dollari a livello globale

Progetti di ricerca sull’utilizzo di biosensori

INAIL – SICUREZZA LAVORO

• Realizzazione ed ottimizzazione di biosensori elettrochimici ed ottici modificati mediante materiali polimerici e nanostrutturati per la determinazione di sostanze di interesse eco-tossicologico nel settore

agricolo

• Studi molecolari e bioinformatici di ceppi microbici di interesse applicativo in settori innovativi biotech (biorimedi dei siti contaminati, bioprocessi

industriali)

• Implementazione di approcci in biosicurezza nell’ambiente di lavoro

BUONE PRATICHE PER LA GESTIONE INTELLIGENTE DELLA RISORSA ACQUA

FONDAZIONE GIANGIACOMO FELTRINELLI E CNR

• Sono stati realizzati prototipi di misuratori automatici di torbidità, conducibilità elettrica, pH, analisi automatica di caratteristiche chimiche con cartine test, biosensori, precipitazioni e micromovimenti del terreno

• Tutti i prototipi sono costruiti per funzionare da soli per lunghi periodi e trasmettere i dati a distanza anche in ambienti privi di rete Internet e GSM/GPRS Sono state usate tecnologie open source quali Arduino, ricetrasmittenti LoRa, e

macchine a controllo numerico

II TARTUFO DI ALBA – SONDE E PROTEOMICA Sono state individuate sequenze di DNA specifiche del tartufo di Alba.

e a realizzare delle sonde geniche in grado di identificare consicurezza le varie specie di fungo smascherando quelli fasulli

Queste sonde molecolari permettono anche di studiare le simbiosi tra ilfungo e le radici di alcune piante - querce, tigli, pioppi - possono trarrefacilmente in inganno i non-esperti

Il tartufo bianco è studiato anche in nuovi progetti di proteomica, che impiegano elettroforesi bidimensionale su gel, spettrometria di massa (o cromatografia liquida ad alta pressione ) e la bioinformatica.

Si individuano così le proteine del tartufo oggetto delle analisi con le misure e ricerche in banche dati;

La metodologia è in fase di studio (Univ Pisa) e si prevede debba subire ancora vari aggiustamenti prima di poter divenire universalmente applicata.

LE PECORE DI RAZZA ROASCHINA MONITORATE CON SENSORI

• E’ sviluppato a Roaschia (CN), utilizzando le pecore di unpastore locale, il progetto “Utilizzo di nuovi biosensori nelcontrollo della salute degli animali e degli spostamenti di

un gregge in alpeggio”

• Il progetto coinvolge i dipartimenti di scienze veterinarie edi scienze agrarie, forestali e alimentari con l’obiettivo di

studiare attraverso il posizionamento nelle orecchie dellapecora roaschina di piccoli sensori per monitorare da

remoto il suo comportamento, le sue abitudini e capirecome si può migliorare il benessere dell’animale efavorire, così, la sua attività riproduttiva

• Progetto dell’Università di Torino finanziato dallaFondazione CRT.

SICUREZZA DEGLI ALIMENTI GLUTEN-FREE: APPROCCI ANALITICI INNOVATIVI – UNIV PARMA

La determinazione è basata sulla biosensoristica(domestica) o sulla cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (produzione)

L’incidenza della malattia celiaca, causata da una reazione autoimmune al glutine, è in costante crescita soprattutto nei Paesi industrializzati, raggiungendo nei bambini una percentuale fino al 3%

La dieta senza glutine è l’unica cura, questo fa comprendere lo sviluppo nella produzione e commercializzazione di prodotti dichiarati “gluten-free”, reperibili non solo in negozi specializzati, ma anche nella grande distribuzione

Il Regolamento UE 828/14 prevede che il cibo sia:

“gluten-free” se glutine non superiore a 20 mg/kg

‘“a basso glutine” se non supera i 100 mg/kg

E’ irrisolto il problema della contaminazione accidentale di glutine oltre a latte ed uova

Perciò numerose attività di ricerca sono focalizzate sullo sviluppo di tecnologie per valutare la conformità dei prodotti

La determinazione del glutine è una vera sfida dal punto di vista analitico:

è una miscela di centinaia di proteine con un elevato grado di omologia di sequenza

con diverse caratteristiche chimico-fisiche ed un’elevata variabilità composizionale

ASPETTATIVE DALLA BIOSENSORISTICA• I biosensori sono proposti come un’opportunità per la sicurezza

della qualità del cibo che mangiamo: precisi come l’elettronica, sensibili come esseri viventi

• I biosensori si presentano come una sintesi tecnologica di biologia, fisica e chimica, combinando così i vantaggi dei sistemi biologici con la risposta quantitativa e veloce degli strumenti elettronici

• biosensori per batteri: e sostanze antibatteriche (come gli antibiotici usati negli allevamenti) nel latte o per metalli pesanti

• biosensori per la valutazione della contaminazione del suolo e della tossicità dei sedimenti prima del loro riutilizzo come suolo agricolo

• La tecnologia dei sensori è indicata come la punta avanzata dello sviluppo in quasi tutti i settori della produzione agricola e alimentare”

• Ad oggi, i biosensori sono notevolmente utilizzati nella filiera alimentare ma solo nei primi stadi, ma potrebbero essere realtà quotidiana

RICERCHE SUL MIELE E PRODOTTI APIARI

• Ricerca di contaminazioni da pesticidi

• Infestazione da Aethina Tumida

• Biomarkers per la salute delle api

Collaborazioni di UNIGE con

• IZSLT – Dr Giovanni Formato

• IZSTO – Dr.ssa Paola Mogliotti

PROGETTO ERANET 2017-2019:

NEW INDICATORS AND ON-FARM PRACTICES TO IMPROVE HONEYBEE HEALTH IN THE AETHINA TUMIDA ERA IN EUROPE

• SITO PROGETTO:

• http://www.izslt.it/bpractices/

Obiettivi nel progetto dell’Università di Genova:

1) Realizzare un biosensore per il rilevamento di pesticidi (organofosfati)2) Realizzare un sensore basato sulla tecnica nanogravimetrica per rilevare segnali di

contaminazione da Aethina Tumida.

Impegni da progetto:

BPRACTICES and Biosensors

• Il progetto BPRACTICES mira a sviluppare nuove pratiche di gestione (buone pratiche di apicoltura - GBP) adottando nuovi metodi clinici, tecniche biomolecolari e biomeccaniche nel rispetto del comportamento

naturale delle api (SITO IZSLT)

• Le attività di ricerca si sono concentrate sullo sviluppo di nuovi biosensori dal miele per monitorare la presenza di SHB e tecniche di

PCR per la diagnosi precoce di malattie delle api (peste americana ed europea AFB, EFB, Nozema, Varroa, Aethina Tumida ecc.).

Obiettivi e impegni del progetto BPRACTICES:

INFESTAZIONE DA AETHINA TUMIDA (AT) E IL MIELE D'API

AT non danneggia le api africane poiché nell’evoluzione hannosviluppato metodi efficaci per mitigare l'infestazione.

Le api da miele europee che affrontano malattie e stress daparassiti diversi da quelli sperimentati dalle api africane, nonsono in grado di inibire efficacemente l'infestazione da questocoleottero.

Pertanto, l'ambiente in cui vivono le colonie europee di api damiele offre le condizioni ottimali per promuovere l'interazionemultitrofica tra ape-scarabeo-lievito-polline che facilital’infestazione di alveari a spese dell'ape europea

L'uso diffuso di pesticidi in agricoltura ha ulteriormente ridottola capacità di resistenza delle api

BIOSENSORI PER APICOLTORI

rilevazione del lievito di Kodamaea Ohmeri (6000-12000 Dalton) come segnale di infestazione da AT

rilevazione di contaminazione da organofosfati (circa 200-400

peso molecolare)

Nanogravimetria

Volt / Amperometria

UN BIOSENSORE MICRO-NANOBILANCIAA CRISTALLI DI QUARZO (QCM)

• Per determinare la presenza del lievito Kodamaea Ohmeri nel miele

ELEMENTI DI NANOGRAVIMETRIA

La tecnica QCM è stata lo strumento base per misurare l'adsorbimento molecolare SOTTO VUOTO, cioè per rilevare lo spessore della pellicola di un film sottile di atomi/molecole. OGGI si usa anche immerso IN LIQUIDI.

Il sensore QCM

E’ un sottile cristallo di quarzo (generalmente AT-cut) inserito tra due elettrodi metallici evaporati.

Il cristallo di quarzo è fatto oscillare alla sua frequenza di risonanza da una differenza di potenziale oscillante.

Thickness-shear mode resonator (AT-cut)

LA RELAZIONE DI SAUERBREY

Vi è una relazione lineare tra la massa adsorbita e lo spostamento della frequenza di risonanza misurata:

La relazione di Sauerbrey ha validità nelle seguenti condizioni:

- La massa adsorbita sia fortemente legata alla superficie dell'elettrodo e non scivoli sulla superficie

- La massa adsorbita non subisca deformazioni viscoelastiche

- Lo strato sia uniforme, idealmente un monostrato

UN ESEMPIO NUMERICO

• Densità del quarzo: 2,6480 g/cm3

• Modulo di taglio di quarzo per cristallo taglio AT: 2,947 1011 g·cm-1·s-2

• diametro dell'elettrodo: 0,7000 cm

• frequenza di risonanza: 10,000,000 Hz ovvero 10 MHz

• Se una deposizione fa variare la frequenza dai 10,000,000 Hz (10 MHz) del sensore a riposo fino a 9,999,900 Hz la massa rilevata che aderisce al sensore è variata di 850 10-9 grammi (ovvero 850 nano grammi)

• Per un Organofosfato il dato corrisponde a 3 nano moli circa

• Per un peptide di sequenza: GRHRGESRAARPPAPYKALSTSRVVWECSSWVVNSISIQARDRRTSTVMERKALK

il peso molecolare calcolato è pari a 15300,58 Dalton, quindi il nanogravimetrodetermina 56 10-12 moli ovvero 56 pico moli

QCM IN BIOLOGIA CELLULARE

La cinetica dei processi di fissaggio e diffusione delle cellule aderenti può essere studiata utilizzando il QCM in liquido.

Adesione cellulare e diffusione sull'elettrodo QCM

Il QCM, che misura le interazioni meccaniche sulla sua superficie, può studiare l'adsorbimento cellulare e i cambiamenti biofisici in modo non invasivo.

Pianificazione del biosensore basata sulla QCM

Approccio-1La strategia prevedeva l’immobilizzazione, sulla superficie d’oro del quarzo, di

anticorpi specifici per proteine di membrana delle cellule di lievito Kodamae Ohmeri

E’ stato scoperto dal gruppo di Biologia Molecolare dell’IZSLT (Dott.ssa Cersini) l’esistenza di un peptide nel miele in concomitanza con la presenza del lievito Kodamae Ohmeri.

Successivamente sono stati prodotti gli anticorpi specifici per il peptide e questi sono stati immobilizzati sulla superficie d’oro dei quarzi

Approccio-2

SEQUENZA DEL PEPTIDE DI KODAMEA OHMERI

La scoperta del peptide nel miele infestato da Kodamaea ohmeri è stata ottenuta dall’analisi di mieli provenienti dalla zona rossa di Reggio Calabria

RIVESTIMENTO DELLA SUPERFICIE D’ORO DI UN QUARZO PER QCM• La tecnica da noi utilizzata sfrutta un metodo (ref. Ghisellini et al. Sci. Rep.)

che si avvantaggia di una proteina ricombinante His-tagged (Proteina A)

La coda della Proteina A (His-tag) ha elevata affinità per la superficie dell’oro.

Dopo aver formato un sub-monostrato di proteina A sulla superficie d’oro del quarzo, un'ulteriore esposizione all’anticorpo specifico del peptide dà origine a un sub-monostrato di anticorpi.

Infine, l'anticorpo dovrà catturare il peptide nei campioni contaminati da Kodamaea ohmeri

IL SEGNALE DEL PEPTIDE DI KODAMAE OHMERIDALLA NOSTRA QCM

20 40 60 80 100 120 140 160

5,00211e+6

5,00212e+6

5,00213e+6

5,00214e+6

5,00215e+6

5,00216e+6

5,00217e+6

5 MHz

I PESTICIDI ORGANOFOSFATI OP• Nei campi sanitari e agricoli, gli organofosfati costituiscono un gruppo di

insetticidi che operano come agenti sul sistema nervoso e in particolare sul funzionamento dell'enzima acetilcolinesterasi animali (insetti)

• Gli OP inibiscono irreversibilmente la sua azione nella funzione nervosa tra le cellule nervose e muscolari degli esseri umani e di molte altre specie animali (insetti)

Acetilcolinesterasi

ACETILCOLINESTERASIDopo che il segnale viene trasmesso, l’enzima separa l'acetilcolina nei suoi due componenti, la colina e l'acido acetico.

L’azione interrompe efficacemente il segnale.

Acetilcolina Colina Acido Acetico

I due frammenti vengono riciclati per sintetizzare nuovi neurotrasmettitori per le successive contrazioni.

L'acetilcolinesterasi è uno degli enzimi più veloci, dal momento che degrada una molecola di acetilcolina in circa 80 microsecondi.

DEGRADAZIONE DEGLI INSETTICIDI OP

• Gli insetticidi OP si degradano rapidamente per idrolisi sotto la luce solare, l'aria e il suolo, ma piccole quantità possono essere rilevate negli alimenti e nell'acqua potabile.

• La loro capacità di degradazione li rende un'importante alternativa agli insetticidi organocloruridi comuni, come il DDT.

• Sebbene gli organofosfati si degradino più rapidamente degli

organocloruri, gli OP hanno una maggiore tossicità acuta, mettendo a rischio le persone

• Per gli esseri umani si ritiene che possa essere OK (argomento

dibattuto), ma certamente le api vengono comunque uccise prima che la degradazione OP possa avvenire

• Questa è un risultato provato!!!

STORIA DEL GAS NERVINO• Nel 1854 i pionieri in questo campo furono Jean Louis Lassaigne e

Philip de Clermount

• Nel 1932, i chimici tedeschi Lange e von Krueger descrissero per la prima volta gli effetti sul sistema nervoso dell'OP, notando una sensazione di soffocamento e oscurando la visione dopo l'esposizione.

• Gli scopi militari divennero ben presto evidenti: il governo nazista affidò a Schrader il compito di sviluppare gas nervini fosporganici. Il laboratorio di Schrader scoprì Sarin, Tabun e Soman.

• Dopo la seconda guerra mondiale, le aziende americane avevano accesso ad alcune informazioni dal laboratorio di Schrader e cominciarono a sintetizzare insetticidi fosforganici su larga scala. Paratione fu tra i primi commercializzati, seguito daL malatione

• La popolarità di questi insetticidi è cresciuta dopo che molti insetticidi organocloruri come il DDT sono stati vietati negli anni '70 data la loro persistenza nell'ambiente.

DOVE SI RINTRACCIANO GLI OP NELL’APIARIO?

RISULTATI DI LETTERATURA:

I residui degli insetticidi usati in agricoltura possono essere ritrovati nel miele?

Il contenuto di pesticidi può raggiungere valori fino a 0,1 ÷ 30 mg/kg nel miele

La concentrazione di OP nel miele è fino a mille volte inferiore a quella rilevato nelle api! Questa enorme differenza è dovuta a una sorta di effetto filtro delle api: NON E’ SORPRENDENTE!

Un'ape è in grado di effettuare fino a 1000 micro-prelievi al giorno

Considerando un alveare con una media di 20.000 bottinatrici si traduce che in un alveare circa 20 milioni di micro-prelievi al giorno

Poiché la maggior parte dei pesticidi sono solubili in grassi, tendono a depositarsi nella cera piuttosto che nel miele.

In definitiva il grado di concentrazione da pesticidi nei diversi prodotti apiari segue questo ordine:

api > propoli > cera > polline > miele

DISPONIBILITÀ DI CAMPIONI

Tre biosensori per il rilevamento degli organofosfati OP:

A) Metodi ottici

B) Saggio qualitativo amperometrico

C) Amperometria quantitativa

Alcuni test di controllo per i sensori con analisi MS-GC

A) SENSORE OTTICO (PIÙ SEMPLICE POSSIBILE)• Le rapid cards per rilevare pesticidi in prodotti alimentari sono costituite da due

dischi: uno contiene l’enzima colinesterasi e un reagente cromogenico per rilevare l’organofosfato (meglio: la mancanza di OP). Nell’altro disco c’è il

substrato. I due dischi premuti insieme fanno partire la reazione.

• Una goccia di campione da analizzare viene posta al centro dei dischi dopo un trattamento adeguato. Se l’OP è assente il disco con l’enzima e cromoforo

diventa azzurro, se è presente resta bianco.

PASSAGGI PER L'UTILIZZO DELLA SCHEDA DI BIORILEVAMENTO OTTICO

• Si prelevano circa 5g di campione, si aggiungono 10mL di acqua pura, quindi si agita per circa 50 volte e per almeno 2 minuti. Quindi si scuotono i campioni bagnati per estrarre i pesticidi

• Si immerge il disco bianco della rapid card nella soluzione campione (dall'ultimo passaggio) per circa 2 secondi (o posizionare una goccia sul disco).

• Si mette la card per almeno 10 minuti per la pre-reazione (posizionandola nel dispositivo

termostatato a 37C se possibile)

• Si piega la card a metà e si tiene fra le dita per 3 minuti. Si lascia che il disco bianco reagisca con il disco rosso durante questo processo. La temperatura di reazione dovrebbe essere di circa 37C (la temperatura corporea è OK)

• Si può eseguire un test di controllo semplicemente immettendo la soluzione di lavaggio fra i dischi di una nuova card

• L'interpretazione visiva del segnale di colore è stata chiaramente osservata alla concentrazione

di 5 mg/kg.

La misura della corrente elettrica è ampiamente utilizzata in quanto:

- Le reazioni redox nel substrato del sensore ad un adeguato potenziale fisso

- Il ruolo dominante dell'AChE e le correnti redox che generano.

- La misura della corrente elettrica porta a stime qualitative/quantitative della concentrazione di specie redox.

B) and C ) Amperometria

- Bisogna depositare l'enzima sul substrato a contatto con gli elettrodi

- Oppure, in alternativa, si deve esporre l'analita all'azione enzimatica in una camera di reazione contenente gli elettrodi

- In entrambi i casi, è necessario un po’ di tempo (dieci minuti) per promuovere la reazione dell'enzima.

VOLTAMMETRIA CICLICALa CV è un metodo analitico che permette di ottenere informazioni su :

- il tipo di reazioni osservate nel sistema

- i potenziali a cui si verificano

E’ una metodologia molto potente per scopi di ricerca e applicativi. Il metodo utilizza :

- Un elettrodo di riferimento (RE)

- Un elettrodo di lavoro (WE)

- Un controelettrodo (CE) (chiamato anche elettrodo secondario o ausiliario).

Queste misurazioni sono necessarie per rivelare i parametri appropriati da adottare nella amperometria

TECHNICAL DETAILS: BASIC ARRANGEMENTS

Gli esperimenti sono eseguiti da un potenziostato che controlla

efficacemente la tensione tra il RE e WE, misurando la corrente

attraverso la CE (il WE è usualmente collegato a terra)

Il potenziale applicato viene misurato rispetto al RE, mentre la CE chiude il circuito elettrico per far fluire la corrente.

PRESTAZIONI TECNICHE DELLA CV

• Gli esperimenti standard del CV consistono nel misurare la corrente che scorre attraverso l'WE durante una perturbazione potenziale triangolare.

Voltammetria ciclica dell’acetilcolina sotto l'azione AChE che esaurisce i picchi ( dal rosso al giallo-rosa).

Nessuna presenza di OP in questo esempio

Our CV in a honey sample

•B) Strumentazione e analisi dell'amperometria qualitativa

•C) Strumentazione e analisi in amperomeria quantitativa

B and C ) : Amperometria

B) AMPEROMETRIA QUALITATIVA• Un rivelatore elettrochimico per la rapida determinazione dei pesticidi

organofosforici negli alimenti (ma non esclusivamente) può sfruttare l’azione dell’enzima AChE che esaurisce Ach a Ch aumentando le specie ioniche in goccia soluzione (e aumenta la conducibilità).

• I reagenti necessari per l'analisi sono una soluzione tampone per la diluizione del campione e il fissaggio pH e una soluzione enzimatica : è il substrato !

• I sensori per i pesticidi attraverso un rilevatore elettronico controllano la corrente nella cella elettrochimica in assenza ed in presenza del campione (eventualmente con OP): una fase di calibrazione indica la corrente di alto livello (senza OP) da confrontare con quella in presenza del campione

• Si riporta un LOD di 2.0×10−9M (alcune ppb) di OP

• In un approccio qualitativo, l'apparecchio fornisce TRE possibili risposte per il rilevamento di OP nei campioni dopo incubazione. Il responso può essere:

Elettrodi usa e getta

- Nessun OP rilevato

- Rilevamento non conclusivo

- OP al di sopra del limite

C) AMPEROMETRIA QUANTITATIVA• Un elettrodo funzionalizzato con la suddetta deposizione di enzimi e uno strato di protezione

polimerico può essere utilizzato per eseguire misurazioni di corrente.

• Nella camera di reazione (o in una goccia sui tre elettrodi planari) l'enzima può reagire per un certo tempo (10 minuti) con l'analita.

• Se op sono nel campione, inibiscono l'azione enzimatica, non viene prodotta colina e sono

misurate basse correnti

• Nel caso in cui la concentrazione di OP sia trascurabile, si ottiene in condizioni standard un’elevata corrente tipicamente 20-100 microAmpere

•� Il rilevamento amperometrico consente di rilevare la concentrazione

di pesticidi nel range 10−11 to 10−6 M.

� Per una concentrazione superiore a quella 10−6 M saturazione dei limiti di corrente bassa e si hanno inibizioni al 100%.

� Il limite di rilevazione può essere abbassato a scapito di apparecchiature più sofisticate.

IMMOBILIZZAZIONE ACHE: TENTATIVI DI CONSENTIRE IL RIUTILIZZO DEGLI ELETTRODI• Gli enzimi possono essere immobilizzati su materiali polimerici adatti con ritenzione della loro

attività catalitica. Si può preparare l'elettrodo di lavoro per sfruttare questa proprietà.

• L'immobilizzazione si ottiene tipicamente attraverso una reazione site-specific tra i siti reattivi del materiale scelto e un residuo di amminoacidi sull'enzima.

•

Questi risultati devono essere testati per

verificare l'attività degli enzimi e per

effettuare calibrazioni prima di applicarle ai

campioni di miele

Questi enzimi e immobilizzati sono in grado di catalizzare le reazioni di degradazione o di neutralizzazione

THE ALT POLYMERIl polimero alterna unità di anidride maleica e stirene per produrre poli (styrene-alt-maleic anidride)

maleic anhydride styrene

poly(styrene-alt-maleic anhydride)

- Facile da preparare dalla polimerizzazione dei radicali liberi

- Solubile in comuni solventi organici

- Massa molecolare elevata: 350 000 D …… + IL CO-POLIMERO

PASSAGGI PER FUNZIONALIZZARE UN BIOSENSORE

1. Deposizioni su substrato inerte del polimero e studio morfologico della superficie

2. Deposizione dell'enzima per verificare la persistenza dell'attività enzimatica attraverso il test di analisi spettrofotometrica

3. Misurazioni delle concentrazioni di OP in campioni reali di miele

4. Misure con il prototipo del biosensore

5. La SLIDE seguente riassume questi passaggi

Determinazione

quantitativa di OP

QCM per verifica della deposizioni di polimeri ed enzimi

Densità ottica della risposta cinetica dell'enzima AchEimmobilizzato Voltammetria ciclica

Apparato sperimentale

• I campioni di miele non mostrano alcun segnale di contaminazione nelle misure ottiche e anche l’amperometria dà lo stesso risultato negativo

• Così, un controllo sembrava del tutto necessario !!!

• Una misurazione è stata effettuata anche da GC-MS il risultato è stato negativo. La tecnica GC-MS richiede procedure attente relative ai trattamenti campione e all'estrazione di analiti

• La metodologia QuEChERS si sta imponendo come standard.

RISULTATI DI MISURE OTTICHE E AMPEROMETRICHE

• QuEChERS: veloce, facile, economico, efficace, robusto e sicuro.

• Lineare nell'intervallo 0,01-1,00 g/mL.

• Il metodo prevede l'uso di acetonitrile e dei seguenti sali: solfato di magnesio, cloruro

di sodio e diversi citrati.

• L'estratto viene quindi centrifugato. La fase organica viene immagazzinata in

congelatore per una notte per precipitare i grassi residui e purificata

• Dopo la centrifugazione, l'estratto viene immediatamente acidificato.

• Il residuo viene ricostituito con 2 mL di isottano e sottoposto infine all'analisi GC-MS /

MS.

QuEChERS STANDARD

BIOFISICA MEDICAUNIVERSITÀ DI GENOVA

• Ph.D. Luca Mario Giacomelli

Dr. Federica Bisacchifedericabisacchi@hotmail.com

Ph.D.Rosanna Sperarosannaspera@libero.it

Prof. Roberto Eggenhöffner

roberto.eggenhoffner@unige.it

Mobile: +393471380878

Ph.D. Paola Ghisellini

paola.ghisellini@unige.it

P.Chim. Cristina Rando

cristina.rando@unige.it

Dr. Valerio Belgrano

valeriobelgrano@gmail.com

Dr. Michela Eggenhöffner

michela.eggenhoffner@mail.com

Dr. Eugenio Sorrentieugenio.sorrenti@hotmail.it

Dr. Patrizia Garbatip.r.garbati@gmail.com

lu.giacomelli6@gmail.com