La gestione tecnica

della biopsia renale

Valentina Bartolucci

U.O.C. Anatomia Patologica – Università Campus Biomedico

Tecniche di allestimento

di routine

TRASPORTO E CONSEGNA

Una volta eseguito il prelievo, la biopsia renale

viene adagiata su un foglio di carta bibula

imbibito di soluzione fisiologica e trasportata in

una capsula di petri.

E’ necessario mantenere il campione umido,

preferibilmente a una temperatura di +4°C per

ritardare i fenomeni autolitici e impedire

l’eccessiva disidratazione del campione.

VALUTAZIONE E PRELIEVO

Si osserva il frustolo al microscopio

per valutarne l’idoneità.

GLOMERULO

Corticale

Midollare

Il frustolo viene diviso in tre porzioni

ognuna destinata a una lavorazione

diversa:

CONGELAMENTO

MICROSCOPIA OTTICA

MICROSCOPIA ELETTRONICA

CONGELAMENTO

Il prelievo viene inserito in una cryomold e ricoperto di OCT

L’OCT è una soluzione acquosa a base di alcol polivinilico. Tale sostanza non

penetra negli interstizi del tessuto, ma circonda il frammento, proteggendolo dal

"trauma" del congelamento e costituendo inoltre un supporto solido necessario

per il successivo taglio delle sezioni al criostato.

CONGELAMENTO

Esistono diversi metodi per congelare i campioni di tessuto «a fresco»

ISOPENTANO RAFFREDDATO CON AZOTO LIQUIDO: L’azoto allo stato

liquido si trova alla temperatura di -197°C, e l’isopentano solidifica

a -80°C. L’immersione del frustolo in quest’ultimo subito prima

della solidificazione permette il congelamento rapido e uniforme

del tessuto, senza sbalzi di temperatura. E’ una metodica

indaginosa.

SPRAY CONGELANTE: Si spruzza direttamente sulla mold finchè il

tessuto non è uniformemente congelato. Buon rapporto

performance/costo ma è necessaria una buona manualità.

CONGELAMENTO

CRITICITA’

Un congelamento troppo lento o un frustolo

troppo «bagnato» provoca la formazione di

cristalli di ghiaccio.

Non bisogna dare il tempo all’acqua,

intrappolata nel frustolo, di espandersi

durante il congelamento perché questo va

compromettere l’integrità delle strutture del

tessuto.

Al contrario, un frustolo essiccato, una volta

congelato avrà un aspetto friabile e si

taglierà con difficoltà

Un congelamento ottenuto utilizzando lo spray troppo vicino

al campione provoca la formazione di bolle e deformazione

dell’OCT rendendo complessa la fase successiva del taglio.

CONGELAMENTO

ERRORI

TAGLIO AL CRIOSTATO

Il campione viene montato su un supporto metallico e rifilato con una lametta

per poter posizionare le sezioni sul vetrino il più vicine le une alle altre

TAGLIO AL CRIOSTATO

Il campione viene

sgrossato a 10 µm

Viene tagliata una sezione

spessa 5 µm

A questo punto bisogna osservare il vetrino al microscopio

per valutare la presenza di glomeruli.

TAGLIO AL CRIOSTATOOsservazione al microscopio

Vetrino non coloratoVetrino colorato con ematossilina

eosina (metodo rapido)

GLOMERULO

TAGLIO AL CRIOSTATOOsservazione al microscopio

TAGLIO AL CRIOSTATOOsservazione al microscopio

Se il glomerulo non è presente sulla prima sezione viene raccolta un’altra sezione

scendendo di circa 20 µm.

Questa operazione viene ripetuta finché il glomerulo non viene scoperto.

TAGLIO AL CRIOSTATO

Vengono allestiti 8 vetrini per immunofluorescenza mettendo una sezione su ciascun

vetrino e poi ricominciando il giro finché non si ottengono vetrini con 3 sezioni ciascuno.

TAGLIO AL CRIOSTATO

1

2

3

IMMUNOFLUORESCENZA

Si può procedere subito con l’allestimento dell’immunofluorescenza

oppure conservare i vetrini a -20°C.

L’immunofluorescenza può essere di due tipi

DIRETTA

Il fluorocromo è legato direttamente

all’anticorpo primario

INDIRETTA

Il fluorocromo è legato

all’anticorpo secondario

Anticorpi utilizzati:

IgA – IgG – IgM – C1q – C3c – Fibrinogeno – K - λ

IMMUNOFLUORESCENZA

I vetrini vengono reidratati in PBS 1X

Si preparano gli anticorpi con diluizione 1:40, tranne fibrinogeno che si diluisce 1:80.

Si dispensa l’anticorpo e si lascia incubare 40 minuti in camera umida.

Si eseguono 3 lavaggi in PBS da 15 minuti ciascuno, al buio.

Si monta il coprioggetto con montante acquoso.

La fluorescenza si può osservare subito al microscopio oppure

i vetrini vengono conservati a +4°C (brevi periodi)

Ross et al. BMC Nephrology 2012, 13:81

http://www.biomedcentral.com/1471-2369/13/81

MICROSCOPIA OTTICA

Fissazione

Il frammento destinato alla microscopia ottica viene fissato in formalina neutra

tamponata per almeno 2 ore e successivamente processato.

Inclusione

Dopo la processazione il frustolo bioptico viene incluso, poi sgrossato a 10 µm e

conservato a -20°C.

Taglio

Dopo alcune ore a -20°C la paraffina si può procedere con il taglio ad uno spessore di

1,5 µm. Il taglio deve essere effettuato velocemente per evitare il riscaldamento del

blocchetto, ma allo stesso tempo mantenendo una velocità costante per permettere

un taglio uniforme privo di artefatti.

MICROSCOPIA OTTICA

Si taglia un nastrino, tutto dello spessore 1,5 µm, da cui vengono allestiti 4 vetrini:

1 Verrà colorato in Ematossilina Eosina

3 Verranno colorati con il PAS

Il campione verrà considerato adeguato se contiene

almeno 10-15 glomeruli

MICROSCOPIA OTTICA

Artefatti

La biopsia renale è un campione delicato.

Gli artefatti sono frutto di errori che possono intercorrere in diverse fasi del processo:

TRASPORTO

Esposizione a temperature elevate durante il trasporto.

Essiccamento del campione

Ritardo nella fissazione

ALLESTIMENTO

Essiccamento del campione durante la processazione

Poca paraffina nel blocchetto

Lame usurate

Blocchetto caldo

Velocità di taglio

MICROSCOPIA OTTICA

Artefatti

MICROSCOPIA OTTICA

Ulteriori colorazioni

Dopo aver visionato i primi vetrini, il patologo può richiedere in un secondo momento

ulteriori vetrini:

• Sezioni a vari livelli colorati con PAS per visualizzare più glomeruli (spessore 1,5 µm)

• Rosso Congo -ricerca amiloide- (spessore 6 µm)

• Immunoistochimica (spessore 3 µm)

• Altre colorazioni istochimiche (PASM, Tricromica di masson, AFOG, etc…)

MICROSCOPIA ELETTRONICA

Fissazione

Il frammento destinato alla microscopia elettronica viene fissato nel liquido di Karnowsky

(paraformaldeide 4%, glutaraldeide 2% in tampone cacodilato).

Questo fissativo permette di conservare meglio i dettagli morfologici rispetto alla sola

formalina.

La fissazione deve durare almeno 2 ore a temperatura ambiente, successivamente si può

eseguire la processazione che viene eseguita manualmente.

MICROSCOPIA ELETTRONICA

Processazione

TAMPONE PBS 1X

2 X 30 min.

OSMIO

2X60 min. a +4°C

TAMPONE PBS 1X

2 X 30 min.

ALCOL 70°

1X15 min.

ALCOL 95°

3X30 min.ALCOL 100°

3X30 min.

OSSIDO DI

PROPILENE

2X30 min.

RESINA/OSS. 1:1

1X60 min.

RESINA

1X60 min.RESINA

24hINCLUSIONE

POLIMERIZZAZIONE

60°C

Tetrossido di osmio

Agente ossidante

Lega i lipidi

Aumenta il contrasto

Ossido di propilene

Solvente di transizione tra

alcol e resina

MICROSCOPIA ELETTRONICA

Resina

La resina utilizzata per includere i frammenti di tessuto per microscopia elettronica

è una miscela di diversi composti chimici:

EMBED 812: Resina

DDSA: Agente indurente

MNA: Agente indurente

DMP-30: Accelera la polimerizzazione

Sono composti molto viscosi, è

necessario prestare attenzione

nella preparazione della resina

per non creare bolle

MICROSCOPIA ELETTRONICA

Taglio

Il taglio delle sezioni per microscopia

elettronica viene eseguito con l’ausilio di un

ultramicrotomo in grado di tagliare sezioni

molto sottili.

MICROSCOPIA ELETTRONICA

Taglio

Ultrastruttura

• Le sezioni destinate al microscopio elettronico vengono tagliate ad uno spessore tra gli 60 e i 80 nm

• Vengono tagliate con una lama di diamante e poste su retini di rame.

• I retini vengono colorati con metalli pesanti (Acetato di uranile, Citrato di piombo)

• Alla fine si ottiene un’immagine «in negativo» delle strutture da analizzare.

Semifini

Le sezioni semifini vengono tagliate con l’ausilio di una lama di vetro ad uno spessore di 1 µm

e colorate con blu di toluidina.

Vengono allestite per valutare la presenza o meno del glomerulo prima di procedere con

l’allestimento dei retini.

Allestimento

lama di vetro

Si esegue

un segno

con una

punta di

diamante

Si dà un

colpo netto

Filo della

lama

Filo della

lama

Vaschetta

porta sezioni

Sezioni

Retino

Pinze

Blocchetto

Sezioni

galleggiano

sull’acqua

Grazie per l’attenzione