Bioluminescenza...dell’organismo stesso (lucciole, batteri o protozoi ecc.) attraverso un...

1

Bioluminescenza

Prof. Giorgio Sartor

Copyright © 2001-2009 by Giorgio Sartor.

All rights reserved.

Versione 0.2 – may 2009

gs © 2001-2009 ver 0.2 Bioluminescenza - 2 -

Luminescenza

• Emissione della luce in seguito al passaggio dallo stato eccitato allo stato fondamentale di un elettrone;

• Lo stato eccitato viene raggiunto a seguito di una somministrazione di energia.

2


Bioluminescenza• Il fenomeno della bioluminescenza èproprio di alcuni organismi marini:

Microrganismi

Celenterati Teleostei


Bioluminescenza• … e terrestri:

InsettiAnellidi

Funghi

3



Bioluminescenza

• Gli scopi della bioluminescenza sono molteplici:–Comunicazione–Difesa–Attacco– Illuminazione –Mimetismo–…

4


Bioluminescenza

• L’emissione della luce da parte di un organismo può essere dovuta alla bioluminescenza propria dell’organismo stesso (lucciole, batteri o protozoi ecc.) attraverso un meccanismo molecolare che coinvolge delle reazioni redox o a causa della presenza di batteri simbionti.


Batteri e protozoi

DINOFLAGELLATI

BATTERI

Luciferina (un pigmento biliare) Luciferasi O2

Luciferina (aldeide) Luciferasi FMNH2 e O2

FATTORI ESSENZIALI

470

478-505

λ (nm)

Vibrio fischeri e V.harveyi; P. phophoreum

Gonyaulux e

Pyrocystis fusiformis

Organismo

5


Batteri e protozoi

DINOFLAGELLATI

BATTERI

Luciferina (un pigmento biliare) Luciferasi O2

Luciferina (aldeide) Luciferasi FMNH2 e O2

FATTORI ESSENZIALI

470

478-505

λ (nm)

Vibrio fischeri e V.harveyi; P. phophoreum

Gonyaulux e

Pyrocystis fusiformis

Organismo


Celenterati

Antozoi

509Luciferina (celenterazina) e O2

Renilla, Ptilosarcus

485Fotoproteina e Ca2+Mnemiopsis e Beroe

Ctenofori

Idrozoi Meduse, Idroidi

Fotoproteine Ca2+proteina fluorescente verde

FATTORI ESSENZIALI

508

λ (nm)

Aequorea, Obelia

Organismo

6


Celenterati

Antozoi




Ctenofori



FATTORI ESSENZIALI

508

λ (nm)

Aequorea, Obelia

Organismo


Celenterati

Antozoi




Ctenofori



FATTORI ESSENZIALI

508

λ (nm)

Aequorea, Obelia

Organismo

7


Celenterati

Antozoi




Ctenofori



FATTORI ESSENZIALI

508

λ (nm)

Aequorea, Obelia

Organismo


Molluschi

Cefalopodi

Bivalvi

Gasteropodi

Luciferina (celenterina) Luciferasi e O2

Encleoteuthis, Chiroteuthis e Sepiolina

490Luciferina (una proteina) luciferasi(o Fe2+ e O2)

Pholas

Luciferina Luciferasi proteina porpora e O2

FATTORI ESSENZIALI

535

λ (nm)

Latia

Organismo

8



Molluschi

Cefalopodi

Bivalvi

Gasteropodi




Pholas


FATTORI ESSENZIALI

535

l (nm)

Latia

Organismo

9


Molluschi

Cefalopodi

Bivalvi

Gasteropodi




Pholas


FATTORI ESSENZIALI

535

l (nm)

Latia

Organismo


Molluschi

Cefalopodi

Bivalvi

Gasteropodi




Pholas


FATTORI ESSENZIALI

535

λ (nm)

Latia

Organismo

10


Crostacei

Gamberetti eufausidi

Gamberetti decapodi

Ostracodi

476Fotoproteinasostanza fluorescente

Eufhausiae Meganyctiphanis

462Luciferina (celenterazina) Luciferasi e O2

OplophorusSergestes

Luciferina (cipridinaluciferina) e O2

FATTORI ESSENZIALI

465

λ (nm)

Cypridina

Organismo


Crostacei

Gamberetti Eufausidi

Gamberetti decapodi

Ostracodi




OplophorusSergestes


FATTORI ESSENZIALI

465

λ (nm)

Cypridina

Organismo

11


Crostacei


Gamberetti decapodi

Ostracodi




OplophorusSergestes


FATTORI ESSENZIALI

465

λ (nm)

Cypridina

Organismo


Crostacei


Gamberetti decapodi

Ostracodi




OplophorusSergestes


FATTORI ESSENZIALI

465

λ (nm)

Cypridina

Organismo

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Teleostei

459ApogonApogonidi

459Luciferina (cypridinaluciferina) Luciferasi e O2

PorichthysBatracoidi

Pemperidi

Mictofidi

Stomiatoidei

459Parapriacanthus

Diaphus


FATTORI ESSENZIALI

459

λ (nm)

Argyropelecus e Yarrella

Organismo


Teleostei

459ApogonApogonidi



Pemperidi

Mictofidi

Stomiatoidei

459Parapriacanthus

Diaphus


FATTORI ESSENZIALI

459

λ (nm)


Organismo

13


Teleostei

459ApogonApogonidi



Pemperidi

Mictofidi

Stomiatoidei

459Parapriacanthus

Diaphus


FATTORI ESSENZIALI

459

λ (nm)


Organismo


Teleostei

459ApogonApogonidi



Pemperidi

Mictofidi

Stomiatoidei

459Parapriacanthus

Diaphus


FATTORI ESSENZIALI

459

λ (nm)


Organismo

14


Teleostei

459ApogonApogonidi



Pemperidi

Mictofidi

Stomiatoidei

459Parapriacanthus

Diaphus


FATTORI ESSENZIALI

459

λ (nm)


Organismo


Teleostei

459ApogonApogonidi



Pemperidi

Mictofidi

Stomiatoidei

459Parapriacanthus

Diaphus


FATTORI ESSENZIALI

459

λ (nm)


Organismo

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Batteri simbionti• Il batterio marino Vibrio fischeri in

natura esiste allo stato plantonico o come simbionte di pesci e seppie luminescenti

• Colonizza organi specializzati nell’animale ospite (Euprymna scolopes, Anomalops katoptron, Photoblepharon) che usa la luminescenza di V. fischericome esca per le prese o come camuffamento dalla luce lunare,

• La sorgente di luce sono i batteri che allo stato libero non emettono luce.

• Il meccanismo con il quale V. fischeriregola la propria bioluminescenza èlegato alla presenza di un segnale chimico di consenso via N-acil-L-omoserina lattone (AHL).







Euprymna scolopes

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Anomalops katoptron







Photoblepharon

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Photoblepharon

• Possiede un sistema per aprire e chiudere l’organo fotoforo.


N-acil-L-omoserina lattone (AHL)

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Batteri simbionti• Il segnale di consenso è legato alla sintesi e all’accumulo

del segnale chimico di consenso (3-osso-C6-HSL, AHL).• In V. fischeri, il segnale è sintetizzato dalla proteina LuxI e

raccolto dalla proteina LuxR. • Quando V. fischeri è a bassa densità il segnale chimico è

basso.• Quando la densità cresce (nei organi fotofori) il segnale si

accumula ed interagisce con LuxR.• Il complesso LuxR/AHL si lega alla regione del DNA

chiamata “lux box” causando l’attivazione del gene per la sintesi delle proteina che provocano la bioluminescenza,

• Inoltre il complesso LuxR/AHL provoca la biosintesi di AHL (via LuxI) la cui sintesi viene quindi autoindotta

• Allo stato plantonico i batteri sono “bui” mentre nei fotofori siano luminosi.


Diversi tipi di luminescenza

corrente elettrica in gas ionizzato o semiconduttoreElettroluminescenza

materiale radioattivo incorporato nel fosforo

Radioluminescenza

reazione chimicaChemiluminescenza

reazione enzimaticaBioluminescenza

temperatura e radioattivitàTermoluminescenza

rottura di cristalliTriboluminescenza

onde sonore in liquidiSonoluminescenza

assorbimento di luceFotoluminescenza

CAUSATIPO

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Le transizioni elettroniche(Diagramma di Jablonsky)

S0

S1

T1

Assorbimento

Fluorescenza

Fosforescenza

Intersystem crossing

Conversione interna

Energia

Stato fondamentale

Stato di singoletto eccitato

Stato di tripletto


Disattivazione dello stato eccitato

S0

S1

Energia

Dissipazionetermica

Emissione(Fluorescenza)

Trasferimento di energia

Fotossidazione

Allo stato eccitatodi un’altra molecola

Reazioneredox

20


Chemiluminescenza• La luminescenza che viene emessa nel corso di una

reazione chimica ha a che fare in genere con un’ossidazione. L’ossidazione può avvenire a causa di acqua ossigenata e dell’ossigeno atmosferico come nel Luminolo

NH

NH

O

O

NH2

O

O

O

O

NH2

N

N

O

O

NH2

O

O

O

O

NH2

2O-O2

*

hν


Bioluminescenza

• Luminescenza prodotta da reazione catalizzate da enzimi.

• Fotoproteine.

21


Luciferasi• Le luciferasi appartengono ad una classe di enzimi redox

che hanno affinità diverse per le diverse luciferine:– EC 1.13.12.5

• Renilla-luciferina 2-monoossigenasi; Renilla-type luciferasi; Aequorina; Obelina; Luciferase (Renilla luciferina)

– EC 1.13.12.6• Cipridina-luciferina 2-monoossigenasi; Cipridina-typeluciferasi; Luciferasi (Cipridina luciferina); Cipridina luciferasi

– EC 1.13.12.7• Fotinus-luciferina 4-monoossigenasi (ATP-asi); Luciferasi delle lucciole; Photinus pyralis luciferasi

– EC 1.13.12.8• Watasenia-luciferina 2-monoossigenasi; Watasenia-typeluciferasi

– EC 1.13.12.13• Oploforus-luciferin 2-monoossigenasi; Oploforus luciferasi

– EC 1.14.99.21• Latia-luciferina monoossigenasi (demetilante); Luciferasi(Latia luciferina)


Gruppi prostetici di fotoproteine• Responsabili

dell'emissione di luce sono, generalmente, proteine che permettono l'ossidazione di un gruppo prostetico.

• I gruppi prostetici sono diversi tra i vari organismi, anche se vengono spesso chiamati con lo stesso nome di luciferina.

N

SS

N

OH

HCOOH

N

SS

N

OH

O

D(-) Luciferina

Ossiluciferina

22


Gruppi prostetici di fotoproteine• In mare

NN

NH

R'

RO

NH

NH

NHNH CH3

OH

CH3

OO

O

O

O O

CH3

CH2

CH3

NN

NH

O

CH3

NH

CH3

NH

NH2

NH

CH3 CH3

CH3

CH3

O O

H

Cipridina Luciferina

(Vargulina)

Celenterazine

-H-OH-SO4H

-

Luciferinadei dinoflagellati

-OH-SO4H

-

Luciferina

di Latia (Latiidae)


Gruppi prostetici di fotoproteine• In mare

NN

NH

R'

RO

NH

NH

NHNH CH3

OH

CH3

OO

O

O

O O

CH3

CH2

CH3

NN

NH

O

CH3

NH

CH3

NH

NH2

NH

CH3 CH3

CH3

CH3

O O

H

Cipridina Luciferina

(Vargulina)

Celenterazine

-H-OH-SO4H

-

Luciferinadei dinoflagellati

-OH-SO4H

-

Luciferina

di Latia (Latiidae)

23


Celenterazine

NN

NH

R'

RO

-OH

-OSO3H

-OH

R’

Oplophorus gracilorostris

Watasenia scintellans

Renilla kolikeri

Origine

-OH

-OSO3H

-H

R


Bioluminescenza • In alcune specie l’ossidazione èprovocata da una LUCIFERASI ATP dipendente con rilascio di AMP e ossiluciferina.

AMP

LH2

E

AMPL*

EEAMP

L

S

N

S

N

HH

H

COOH

OH

O

PO

P

O

OO

OO

S

N N

H

H

O

OH

O2

hνννν

E

ATP + LH2

Mg++

PP

CO2

AMP + L

D(-)luciferina

Ossiluciferina+ O2 + ATP

+ CO2 + AMP + + hν (562 nm)

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Sistema luciferina-luciferasi

N

SS

N

OH

HCOOH N

SS

N

OH

H O

O

P

O

ONO

N

N

OHOHN

NH2

O

N

SS

N

OH

H O

O

P

O

ONO

N

N

OHOHN

NH2

O

O

O

N

SS

N

OH

H

O

O

O

ATP PPi

O2

Mg2+

Luciferina

Luciferasi(EC 1.13.12.7)

Luciferasi

Luciferina-Adenilato

Perossiluciferina-Adenilato

AMP

Perossido cilclico

LuciferasiLuciferasie-



N

SS

N

OH

O

N

SS

N

OH

H

O

O

O

N

SS

N

OH

O

N

SS

N

OH

O

CO2

Ossiluciferina

Luciferasi

Stabilizzazione dello stato eccitato per risonanza

Perossido cilclico

Luciferasi

libera

*

Luciferasi

*

Luciferasi

Decarbossilazione

hν

25


Bioluminescenza • Il processo

ossidativo viene catalizzato da LUCIFERASI che hanno una LUCIFERINA come gruppo prostetico e che utilizzano come sorgenti di elettroni una deviazione della catena respiratoria



AMP

Ossiluciferina

26



AMP

Ossiluciferina



• È alimentato da elettroni provenienti dalla normale catena respiratoria batterica, per mezzo della quale una frazione di e- viene trasferita dal substrato all'ossigeno.

N

SS

N

OH

HCOOH N

SS

N

OH

O

D(-) Luciferina Ossiluciferina

O2ATP

AMP + PPi

e-

CO2 hν

FMNH2FMNH

FMN

NADH

NAD+

27


Celenterazina

• Un altro gruppo prostetico molto importante nel fenomeno della bioluminescenza di animali marini è la celenterazina che emette luce a seguito di un'ossidazione Ca2+dipendente.

• La reazione è catalizzata da un enzima come la obelina (Obelia geniculata) o acqueorina (Aequorea aequorea e A. victoria)


Celenterazina

NN

NH

OH

O

R

APO

NN

N

OH

O

R

OO CH3APO

NH

O

N

N

OH

R

APO

O2

CO2

hν486 nm

3Ca2+

28


Bioluminescenza da celenterazina

• In alcuni animali mari la bioluminescenza èdovuta ad una ossidazione Ca2+dipendente della celenterazina.

• La reazione ècatalizzata da enzimi come la obelina (da Obeliageniculata) o acqueorina (da Aequorea aequoreae A. victoria).





29









30


Colori diversi…

• Per Renilla kolikeri, Aequorea aequoreae A. victoria ed altri organismi, vi è una ulteriore complicazione al fenomeno della bioluminescenza.

• Possiedono, oltre ad un proprio sistema luciferina/luciferasi che genera luce blu, anche una proteina fluorescente che permettere loro di emettere luce nel verde

• La Green Fluorescent Protein (GFP).


GFP• La medusa A.

victoria presenta una curiosa luminescenza verde dovuta ad una proteina con un peculiare gruppo prostetico.

• Tale gruppo prostetico NON emette luce per fenomeni ossidativi ma “cambia” il colore della bioluminescenza.

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GFP• La Green

Fluorescent Proteinha una struttura “beta can” fatta di 11 β-strands

• Contiene al suo interno una cavitàidrofobica con una catena di tre AA (Ser-Tyr-Gly) modificati per formare un fluoroforocaratteristico


GFP

• Il fluoroforo vero e proprio è formato dall’anello fenolico della Tyr66 connesso con un ponte metilenicoall’imidazolo formato dalla Ser 65 e Gly67

NH OCH3

CH3

ON

N

O

NH

ONHOH

NH2

OOH

O NH2

O

32


GFP• Il fluoroforo deriva da una modificazione postraduzionale

della proteina.

NNH

O

NH

O

NH

OH

*

OH H

*

O

NN

O

*

*OH

NN

O

NH

O

NH

OH

*

OH

*

NN

O

NH

O

NH

OH

*

OH

*

Ser65

Tyr66 Gly67

Ciclizzazione

Ossidazione

O2


Fotofisica della GFP

• La capacita della GFP di emettere luce verde deriva dalla proprietà della tirosina di avere diversi pKa di dissociazione dell’OH fenolico se allo stato fondamenta o allo stato eccitato:

OH

*

O

*

OH

*

O

*

+ H+

+ H+

Statofondamentale

Statoeccitato

hν

* *

pKa = 10

pK*a = 5

33


Fotofisica della GFP• Inoltre, nella GFP la forma deprotonata della Tyr66 è

stabilizzata da interazioni con altri residui:– Legame idrogeno tra OH fenolico e His 148 e Thr203, – Legame idrogeno tra ossigeno carbonilico e Gln94 e Arg96– Legame idrogeno tra OH di Ser65 con Glu222

*

OCH3

N

NH

*

O O

*

*

NH

O

H

NN

O

*O

NH

NH2+

NH

*

H

NH O

H

*H

Gln94

Arg96

Glu222His148

Thr203

FORMA PROTONATA




*

OCH3 H

N

NH

*

O O

*

*

NH

O

H

NN

O

*O

NH

NH2+

NH

*

H

NH O

H

*H

*

OCH3 H

N

NH

*

O O

*

*

NH

O

H

NN

O

*O

NH

NH2+

NH

*

H

NH O

H

*H

-

Gln94

Arg96

Glu222His148

Thr203

Gln94

Arg96

Glu222His148

Thr203

Tyr66 Tyr66

34



*

O O

*

CH3

OH

O *

NH NH

NH2+

NH

*

NN

O

OO

*

NH

*

OHN

N

*

H

*

O O

N

N

*

*

CH3

OH

O *

NH NH

NH2+

NH

*

NN

O

OO

*

NH

*

O

H

H

*

O O

N

N

*

*

CH3

OH

O *

NH NH

NH2+

NH

*

NN

O

OO

*

NH

*

O

H

H

-

Tyr66

Arg96

Gln94

Glu222

His148

Thr203

Tyr66

Arg96

Gln94

Glu222

His148

Thr203Tyr66

Arg96

Gln94

Glu222

His148

Thr203

H+H+




Glu222

His148

Thr203

Gln94

Arg96

35



His148Glu222

Gln94

Thr203

Arg96



• La capacità di stabilizzare la forma TyrO-

rende il fluoroforo della GFP eccitabile a 470 nm (blu) dove emette il sistema luciferina luciferasi della A. victoria con emissione verde (509-540nm).

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“Il mare appariva come illuminato da sotto la superficie dell’acqua. La luminescenza disegnava sul mare un grande ovale al cui centro sembrava bruciare un falò che andava gradatamente attenuandosi verso le estremità. –Può essere un agglomerato di piccoli animali marini fosforescenti.- osservò un ufficiale…”

(Giulio Verne – 20000 leghe sotto i mari)


Referenze sul WEB• Siti interessanti per il fenomeno della bioluminescenza:

– The Bioluminescence Web PageLatz Laboratory of Scripps Institution ofOceanography

– Bioluminescence Studies Research and Resources, Department of Biochemistry & Molecular Biology. The University of Georgia

– Harbor Branch Oceanographic

• Interessanti immagini di organismi marini bioluminescenti sono reperibili a: – Zooplankton in the Open Ocean– Harbor Branch Oceanographic– www.biobay.com

• Le coordinate delle strutture proteiche sono reperibili presso la Protein Data Bank

• Dettagliate e più estensive trattazioni sulla struttura della GFP e sulla sua fotofisica sono rintracciabili a:– Structure and Function of Green Fluorescent Protein– Unraveling the mysteries of the Green Fluorescent Protein

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Referenze generali sul WEB• Vie metaboliche

– KEGG: http://www.genome.ad.jp/kegg/• Degradazione degli xenobiotici:

http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html• Struttura delle proteine:

– Protein data bank (Brookhaven): http://www.rcsb.org/pdb/– Hexpasy

• Expert Protein Analysis System: http://us.expasy.org/sprot/• Prosite (protein families and domains): http://www.expasy.org/prosite/• Enzyme (Enzyme nomenclature database):

http://www.expasy.org/enzyme/– Scop (famiglie strutturali): http://scop.berkeley.edu/

• Enzimi: – Nomenclatura - IUBMB: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/– Proprietà - Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/– Expasy (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/

• Database di biocatalisi e biodegradazione: http://umbbd.ahc.umn.edu/• Citocromo P450: http://www.icgeb.org/~p450srv/• Metallotioneine: http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html• Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry

http://www.atsdr.cdc.gov

Crediti e autorizzazioni all’utilizzo

• Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da:http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/

• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:

Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor

Università di Bologna a Ravenna

Giorgio Sartor - [email protected]

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