Bioinformatica Allineamento di sequenze e ricerca di similarità Dr. Giuseppe Pigola –...

BioinformaticaAllineamento di sequenze e ricerca di similarità

Dr. Giuseppe Pigola – [email protected]

Allineamento di Sequenze L’allineamento tra due o più sequenza può aiutare a trovare

regioni simili per le quali si può supporre svolgano la stessa funzione;

La similarità tra due o più sequenza può essere definita in base a una funzione distanza: Tanto più simili sono le sequenze, tanto meno distanti sono;

Esistono diversi algoritmi di allineamento ciascuno dei quali definisce una funzione distanza;

Dato un allineamento possiamo assegnare uno Score che indica il grado di similarità delle due sequenze.

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Allineamento di Sequenze GLOBALE: Si cerca la corrispondenza ottimale tra tutti gli

amminoacidi (nucleotidi) di entrambe le sequenze.

LOCALE: Si cerca di individuare regioni locali di similarità.

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Globale

LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK ||. | | | .| .| || || | || TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG

Locale

LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK ||||||||.|||| TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG

Globale

LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK ||. | | | .| .| || || | || TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG

Locale

LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK ||||||||.|||| TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG

Allineamento Pairwise – Matrici Dot Plot Si crea una matrice in cui vengono confrontati tutti i possibili appaiamenti di

ogni carattere delle due sequenze da allineare.

Si riempie la matrice, annerendo le caselle che hanno nella corrispondente riga e colonna la stessa lettera.

Il programma DOTLET (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/dotlet) , date due sequenze in input permette di disegnare facilmente la relativa matrice Dot Plot.

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Allineamento Pairwise – Matrici Dot Plot

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margaretd

yhqff

a

m a r g a r e t d a y h q f fq elk ra** * ** **

*

* * * *

* * *

* ** ** *

*****

*

Duplicazione

Inversione

Similarità

Allineamento Pairwise – Matrici Dot Plot

FILTRAGGIO –Window Size E’ chiaro che il numero di punti della matrice è influenzato dalla natura

della sequenza; Se confrontiamo due sequenze di nucleotidi (o proteine) costituite da

100 residui, assumendo che ciascun nucleotide (o aminoacido) occorra con la stessa probabilità, il numero totale di punti della matrice sarà mediamente pari a 2500 (500 nel caso di aminoacidi) su 10000 celle totali;

Quando confrontiamo sequenze nucleotidiche il rumore di fondo sara più elevato;

Possiamo confrontare finestre costituite da w residui contigui;

In tal caso metteremo un “dot” nella cella (i,j) solo nel caso in cui le stringhe

risultino identiche per s residui su w.

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),...,,( ),...,,( 11 wjjwii bbbaaa

DotLet - http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/dotlet

Preleviamo la sequenza proteica della calmodulina umana con accession Number CAA36839;

Confrontate la sequenza con se stessa per mezzo di DotLet;

Lasciare come parametri iniziali la matrice Blosum62 ed una finestra di 15 residui per il confronto

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Il grafico riporta la distribuzione degli score ottenuti da tutte le coppie di finestre di sequenza confrontate (usando le matrici di score).

Si noti che la maggior parte dei punteggi ricade nella distribuzione a sinistra a basso punteggio, mentre una piccola popolazione a punteggio elevato si trova a destra.

Spostando i cursori si variano i punteggi limite al di sotto dei quali la cella assume il colore nero e al di sopra il colore bianco. Tra i due limiti le celle assumono un tono di grigio proporzionale al punteggio che contengono.Bioinformatica8

Num di score conquel punteggio

Punteggio ottenuto


Cliccando sulla matrice si attiva un reticolo che può essere spostato sulla superficie della matrice stessa con il puntatore del mouse;

In basso viene riportato l’allineamento tra i due segmenti della proteina corrispondenti alla posizione del centro del reticolo sulla matrice;

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Spostando i cursori in modo da posizionarci sulla piccola distribuzione a destra a punteggio elevato verranno visualizzati solo i punteggi elevati che ovviamente corrispondono alla diagonale principale;

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Esempio: Domini Ripetuti.

Matrice Dot Plot calcolata sulla stessa sequenza di Drosophila Melanogaster (proteina SLIT).

Parametri: Blosum 62, Zoom 1:5, grayscale: 53%,30%

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SLIT_DROME (P24014):MAAPSRTTLMPPPFRLQLRLLILPILLLLRHDAVHAEPYSGGFGSSAVSSGGLGSVGIHIPGGGVGVITEARCPRVCSCT GLNVDCSHRGLTSVPRKISADVERLELQGNNLTVIYETDFQRLTKLRMLQLTDNQIHTIERNSFQDLVSLERLDISNNVI TTVGRRVFKGAQSLRSLQLDNNQITCLDEHAFKGLVELEILTLNNNNLTSLPHNIFGGLGRLRALRLSDNPFACDCHLSW LSRFLRSATRLAPYTRCQSPSQLKGQNVADLHDQEFKCSGLTEHAPMECGAENSCPHPCRCADGIVDCREKSLTSVPVTL PDDTTDVRLEQNFITELPPKSFSSFRRLRRIDLSNNNISRIAHDALSGLKQLTTLVLYGNKIKDLPSGVFKGLGSLRLLL LNANEISCIRKDAFRDLHSLSLLSLYDNNIQSLANGTFDAMKSMKTVHLAKNPFICDCNLRWLADYLHKNPIETSGARCE SPKRMHRRRIESLREEKFKCSWGELRMKLSGECRMDSDCPAMCHCEGTTVDCTGRRLKEIPRDIPLHTTELLLNDNELGR ISSDGLFGRLPHLVKLELKRNQLTGIEPNAFEGASHIQELQLGENKIKEISNKMFLGLHQLKTLNLYDNQISCVMPGSFE HLNSLTSLNLASNPFNCNCHLAWFAECVRKKSLNGGAARCGAPSKVRDVQIKDLPHSEFKCSSENSEGCLGDGYCPPSCT CTGTVVACSRNQLKEIPRGIPAETSELYLESNEIEQIHYERIRHLRSLTRLDLSNNQITILSNYTFANLTKLSTLIISYN KLQCLQRHALSGLNNLRVVSLHGNRISMLPEGSFEDLKSLTHIALGSNPLYCDCGLKWFSDWIKLDYVEPGIARCAEPEQ MKDKLILSTPSSSFVCRGRVRNDILAKCNACFEQPCQNQAQCVALPQREYQCLCQPGYHGKHCEFMIDACYGNPCRNNAT CTVLEEGRFSCQCAPGYTGARCETNIDDCLGEIKCQNNATCIDGVESYKCECQPGFSGEFCDTKIQFCSPEFNPCANGAK CMDHFTHYSCDCQAGFHGTNCTDNIDDCQNHMCQNGGTCVDGINDYQCRCPDDYTGKYCEGHNMISMMYPQTSPCQNHEC KHGVCFQPNAQGSDYLCRCHPGYTGKWCEYLTSISFVHNNSFVELEPLRTRPEANVTIVFSSAEQNGILMYDGQDAHLAV ELFNGRIRVSYDVGNHPVSTMYSFEMVADGKYHAVELLAIKKNFTLRVDRGLARSIINEGSNDYLKLTTPMFLGGLPVDP AQQAYKNWQIRNLTSFKGCMKEVWINHKLVDFGNAQRQQKITPGCALLEGEQQEEEDDEQDFMDETPHIKEEPVDPCLEN KCRRGSRCVPNSNARDGYQCKCKHGQRGRYCDQGEGSTEPPTVTAASTCRKEQVREYYTENDCRSRQPLKYAKCVGGCGN QCCAAKIVRRRKVRMVCSNNRKYIKNLDIVRKCGCTKKCY


ESERCIZIO

Recuperare le sequenze proteiche in formato FASTA di:

subunità alfa 2 di Rattus norvegicus del recettore neuronale dell’acetilcolina (Neuronal acetylcholine receptor protein, alpha-2 chain precursor P12389);

subunità alfa 4 di chicken del recettore neuronale dell’acetilcolina (Neuronal acetylcholine receptor protein, alpha-4 chain precursor P09482);

Confrontare le due sequenze con DotLet per verificare la presenza di zone di somiglianza ed eventuali dissimilarità nella diagonale principale(Far variare i parametri di input);

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Allineamento PairwiseSiano S e T due sequenze. Un allineamento A associa ad S e T le sequenze S’ e T’, che

possono contenere simboli di spazio “-”, in modo che |S’|=|T’| Rimuovendo gli spazi da S’ e T’ otteniamo S e T.

Se l = |S’|=|T’|, lo score di un allineamento pairwise è definito da:

L’allineamento ottimale sarà quello che massimizza la similarità (lo score);

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l

i

iTiS1

]['],['

Allineamento Pairwise ESEMPIO: NEEDLEMAN-WUNSCH

Lo score ottimale V(i,j) di due sequenze S1….i T1…j ha le seguenti proprietà:

Algoritmo di programmazione dinamica per calcolare l’allineamento

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),()1,(

),(),1(

),()1,1(

max),(

),(),0(

),()0,(

0

0

j

i

ji

j

kk

i

kk

TjiV

SjiV

TSjiV

jiV

TjV

SiV

match/mismatchdeletion

insertion

Allineamento Pairwise ESEMPIO: NEEDLEMAN-WUNSCH

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j

230-3-3-6B6

301-2-2-5D5

11-1-1-1-4C4

12-100-3B3

-2-1001-2C2

-2-101-1-1A1

-5-4-3-2-10-

DBDACi

54321-

S1 = ACBCDBS2 = CADBD

Allineamento ottimale V(6,5) = 2

Otteniamo tre allineamenti ottimali:

ACBCDB- ACBCDB- -ACBCDB | || | || | | | -C-ADBD -CA-DBD CADB-D-

S2

S1

),()1,(

),(),1(

),()1,1(

max),(

j

i

ji

TjiV

SjiV

TSjiV

jiV

otherwise

baba

1

2),(

Allineamento Pairwise – Matrici di Score

Un modo per definire la funzione σ è ad esempio quello di assegnare 1 in caso di caratteri uguali e 0 altrimenti.

Nel caso di Nucleotidi questa definizione può andare bene;

Nel caso di aminoacidi non è del tutto corretto assegnare ai mismatch lo stesso peso;

Per questo motivo si introducono le matrici di score che assegnano ad ogni coppia di amino acidi un punteggio: Matrici PAM (Percent Accepted Mutations): si basano su calcoli statistici; Matrici BLOSUM: sono invece basate su una banca dati (BLOCKS) di allineamenti

multipli di segmenti proteici;

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Allineamento Pairwise – Matrici di Score

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Seq1 V D S - C YSeq2 V E S L C YScore 4 2 4 -11 9 7

Score allineamento: 15

blosum62

Penalità del gap.

Allineamento Pairwise - EMBOSShttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/

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Allineamento Pairwise - EMBOSShttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/

Bioinformatica19

Utilizziamo EMBOSS per allineare due sequenze con gli algoritmi di

Needleman-Wunsch (globale);

Smith-Waterman (locale);

Allineamento Pairwise - EMBOSS http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/

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Selezioniamo il tipo di sequenza:

Protein; DNA;


Bioinformatica21

Scelta della scoring matrix:

Protein: Blosum62; Blosum50; Blosum40;

DNA: DNAFull: (Assegna

score diversi nel caso di mismatch di caratteri IUB-IUPAC);

DNAMat: (usata da BLAST assegna uno score al match e un altro al mismatch);


Bioinformatica22

GOP e GEP;


Bioinformatica23

Inserimento delle due sequenza anche da file;


Bioinformatica24

Identity: percentuale di match identici;Similarity: percentuale di match per cui la matrice di scoring ha un valore >= 0 (si tratta di aminoacidi diversi che hanno caratteristiche chimico-fisiche simili);

Similarità nei DB - BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST

Bioinformatica25

BLASTBasic Local Alignment Search Tool


Bioinformatica26

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

Permette di ricercare regioni di

similarità locale tra una

sequenza data e una collezione

di sequenze in banca dati.


Bioinformatica27

L’idea di base dell’algoritmo consiste nel procedere ad allineare passo dopo passo piccole sequenze (WORD e KTUPLE) e tentando di estendere poi l’allineamento.


Bioinformatica28

MEGABLASTE’ utilizzato per trovare efficientemente lunghi allineamenti tra sequenze molto simili tra loro o per identificare una sequenza di input sconosciuta.

BLAST NUCLEOTIDICO

Discontiguous MEGABLASTE’ utilizzato per trovare efficientemente lunghi allineamenti tra sequenze che hanno alcune differenze tra loro.

BLASTNUtilizzato in tutti gli altri casi.


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BLASTPE’ utilizzato per identificare una sequenza proteica di input nel DB o per ricercare sequenze proteiche simili;

BLAST PROTEICO

PSI-BLASTPosition-Specific Iterata BLAST è il programma BLAST più sensibile, il che lo rende molto utile per trovare proteine poco correlate (molto distanti).PHI-BLASTPattern-Hit Initiated BLAST è progettato per la ricerca di proteine che contengono un pattern specificato dall'utente e sono simili alla sequenza query in prossimità del pattern.


Bioinformatica30

BLASTX (Translated query vs protein database)E’ utilizzato per trovare proteine simili a quelle codificate da una query di nucleotidi;

ALTRI TOOL

TBLASTN (Protein query vs translated database)E’ utilizzato per trovare proteine omologhe a quella data in input. Le sequenze nucleotidiche del DB vengono tradotte in sequenze aminoacidiche utilizzando tutti e sei i frame di lettura e poi contfrontate con la query.TBLASTX (Translated query vs translated database)Prende in input una sequenza nucleotidica, la traduce in tutti e sei i frame di lettura e confronta queste sequenze tradotte con il DB di nucleotidi a sua volta tradotto in Aminoacidi. Utile per trovare nuovi geni.BLAST2SEQUtilizza BLAST per allineare due o più sequenze.


Bioinformatica31

Scelta dei vari BLAST

Inserire la sequenza in formato FASTA (anche da file) oppure specificare l’Accession Number o il Gene ID.Specificare eventualmente l’intervallo di interesse.


Bioinformatica32

Scegliere un nome descrittivo per la ricerca che apparirà nei risultati.

Selezionare se si vuole utilizzare BLAST per allineare due o più sequenze.

Campo di ricerca: DB, Organismo.

E’ possibile usare la sintassi di entrez per filtrare i DB selezionati.


Bioinformatica33

Ottimizza la ricerca per:

Similarità; Dissimilarità; Ricerca

generica;


Bioinformatica34

E’ possibile cambiare la soglia di significatività statistica. Ogni match trovato ha un valore di significatività statistica, che indica quanto è statisticamente probabile che quel match sia casuale.

Minore è il numero, maggiore sarà il tempo di esecuzione.L’accuratezza però cresce.

Filtrare regioni il cui match avrebbe scarso significato biologico.


Bioinformatica35

Dimensione delle Word:Maggiore è il numero, minore sarà il numero di word generate per cui minore sarà il tempo di esecuzione.

L’accuratezza però decresce.


Bioinformatica36

Esempio ricerchiamo il gene DIABLO in Drosophila Melanogaster

La prima voce che troviamo è il gene cercato. Selezioniamo la sequenza corrispondente di mRNA in formato FASTA e diamola in pasto a BLAST scegliendo come DB nt e tool Megablast.


Bioinformatica37

Dati generali

Taxonomy Report ci da informazioni sulle specie coinvolte nei risultati;

Può essere utile per verificare la presenza di sequenze ortologhi in altre specie;


Bioinformatica38

Dati generali

Allineamento grafico: I colori indicano la qualità dell’allineamento.

Le prime due sequenze sono identiche.


Bioinformatica39

Le prime due sequenze sono identiche alla query (per questo motivo BLAST può essere usato per ricercare sequenze sconosciute).

Le altre sono sequenze parziali.


Bioinformatica40

Scorrendo i risultati troviamo altre sequenze (anche parziali) in altri tipi di Drosophile.


Bioinformatica41

Infine troviamo i dettagli dei vari allineamenti.I trattini indicano un match, la loro assenza indica un mismatch.


Bioinformatica42

MAX SCOREPunteggio dell’allineamento locale più significativo. (punteggio alto → elevata similarità);

TOTAL SCORELa somma dei punteggi di tutti gli allineamenti locali trovati tra la sequenza query e le sequenze del database.QUERY COVERAGEPercentuale della sequenza allineata

E-VALUEEsprime la probabilità che l’allineamento trovato sia casuale. Più basso è, maggiore è la probabilità che NON sia casuale. (dipende, oltre che dalla similarità, anche dalla numerosità delle sequenze in database e dalla lunghezza delle sequenze).MAX INDENTPercentuale di identità dell’allineamento locale più significativo.


Bioinformatica43

VALIDAZIONE STATISTICA e BIT SCORE

La probabilità di trovare un allineamento con score maggiore o uguale di S segue la distribuzione di Poisson

M,N: lunghezze delle due sequenze; λ,K: parametri che dipendono tra le altre cose dalla banca dati, dalla sua dimensione etc.

Il numero atteso di sequenze che hanno per caso lo score S è

Il bit-score non è altro che lo score normalizzato in modo da poter confrontare bit-score di banche dati diverse

SKmneeP1

SKmne

2ln

)log('

KSS

Allineamento Pairwise – BLAST2SEQhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST

Bioinformatica44

E’ possibile usare BLAST per fare un allineamento di due sequenze.

In questo caso verranno evidenziate le similarità locali.

Si sceglie il programma adatto, si inseriscono le sequenze e si ottiene il risultato.

I parametri dell’interfaccia cambiano leggermente quanto si sceglie di allineare proteine piuttosto che nucleotidi (ad esempio le matrici di score).


Bioinformatica45

Ritorniamo alla pagina principale di BLAST

C’è una sezione dedicata

ai genomi completi

(o in fase di completamento);

In questo modo è possibile fare

un BLAST su sequenze di una

data specie;


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Ritorniamo alla pagina principale di BLAST

C’è una sezione dedicata

ai genomi completi

(o in fase di completamento);

In questo modo è possibile fare

un BLAST su sequenze di una

data specie;


Bioinformatica47

ESERCIZIOData la seguente sequenza sconosciuta. Determinare l’identità più probabile.

>SCONOSCIUTAATCACTGTAGTAGTAGCTGGAAAGAGAAATCTGTGACTCCAATTAGCCAGTTCCTGCAGACCTTGTGAGGACTAGAGGAAGAATGCTCCTGGCTGTTTTGTACTGCCTGCTGTGGAGTTTCCAGACCTCCGCTGGCCATTTCCCTAGAGCCTGTGTCTCCTCTAAGAACCTGATGGAGAAGGAATGCTGTCCACCGTGGAGCGGGGACAGGAGTCCCTGTGGCCAGCTTTCAGGCAGAGGTTCCTGTCAGAATATCCTTCTGTCCAATGCACCACTTGGGCCTCAATTTCCCTTCACAGGGGTGGATGACCGGGAGTCGTGGCCTTCCGTCTTTTATAATAGGACCTGCCAGTGCTCTGGCAACTTCATGGGATTCAACTGTGGAAACTGCAAGTTTGGCTTTTGGGGACCAAACTGCACAGAGAGACGACTCTTGGTGAGAAGAAACATCTTCGATTTGAGTGCCCCAGAGAAGGACAAATTTTTTGCCTACCTCACTTTAGCAAAGCATACCATCAGCTCAGACTATGTCATCCCCATAGGGACCATTGGCCAAATGAAAAATGGATCAACACCCATGTTTAACGACATCAATATTTATGACCTCTTTGTCTGGATGCATTATTATGTGTCAATGGATGCACTGCTTGGGGGATCTGAAATCTGGAGAGACATTGATTTTGCCCATGAAGCACCAGCTTTTCTGCCTTGGCATAGACTCTTCTTGTTGCGGTGGGAACAAGAAATCCAGAAGCTGACAGGAGATGAAAACTTCACTATTCCATATTGGGACTGGCGGGATGCAGAAAAGTGTGACATTTGCACAGATGAGTA


Bioinformatica48

ESERCIZIO IRicercare le sequenze proteiche simili alla subunità IV della citocromo c ossidasi umana (Accession Number: P13073).

Ci sono sequenze predette?

Ci sono sequenze appartenenti a organismi non facenti parte dei mammiferi?


Bioinformatica49

ESERCIZIO IIConsiderare la seguente sequenza proteica del lievito:

>gi|2498220|sp|Q06703.1|CDA2_YEAST Chitin deacetylase 2 precursor MRIQLNTIDLQCIIALSCLGQFVHAEANREDLKQIDFQFPVLERAATKTPFPDWLSAFTGLKEWPGLDPP YIPLDFIDFSQIPDYKEYDQNHCDSVPRDSCSFDCHHCTEHDDVYTCSKLSQTFDDGPSASTTKLLDRLK HNSTFFNLGVNIVQHPDIYQRMQKEGHLIGSHTWSHVYLPNVSNEKIIAQIEWSIWAMNATGNHTPKWFRPPYGGIDNRVRAITRQFGLQAVLWDHDTFDWSLLLNDSVITEQEILQNVINWNKSGTGLILEHDSTEKTV DLAIKINKLIGDDQSTVSHCVGGIDYIKEFLS

Fare una ricerca di omologia nei soli funghi.Riportare accession number e E-value della proteina più simile di Neuorspora Crassa.Riportare accession number e E-value ddella proteina più simile di Aspergillus Nidulans.

Similarità nei DB - FASTA http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/

Bioinformatica50

FASTASequence Similarity Search using the FASTA


Bioinformatica51

STEP 1- Scelta del DB


Bioinformatica52

STEP 1I - Inserimento della sequenza


Bioinformatica53

STEP 1II - Scelta del programma:

FASTA Simile a BLAST

SSEARCH (Smith-Waterman);

GGSEARCH (Needleman-Wunsch);

TFASTX, TFASTY Confronta una proteina con un DB di DNA calcolando tutti i frame di lettura;

FASTX, FASTY Confronta una sequenza nucleotidica con un DB di proteina traducendo la sequenza di input;


Bioinformatica54

STEP 1V - Opzioni:

Match/mismatch scores;

GOP e GEP;


Bioinformatica55

STEP 1V - Opzioni:

KTUP: E’ alla base dell’algoritmo FASTA. Più basso è il valore più accurata e la ricerca (ma più lento sarà il programma); Esso rappresenta il minimo numero di residui contigui identici affinchè una coppia di sequenze sia considerata simile (… e quindi presa in considerazione);

Expectation Upper value: Rappresenta il numero MAX di volte che il match è atteso per caso.

Expectation Lower Value: Rappresenta il numero MIN di volte che il match è atteso per caso.


Bioinformatica56

STEP 1V - Opzioni:

Strand: Per le sequenze nucleotidiche specifica quale strand usare per la ricerca (NONE,BOTH, TOP,BOTTOM);

Histogram: Visualizza o meno l’istogramma nei risultati. L’istogramma da un vista qualitativa dei risultati.

Filter: Filtrare regioni il cui match avrebbe scarso significato biologico.


Bioinformatica57

STEP 1V - Opzioni:

Opzioni di visualizzazione dei risutati.


Bioinformatica58

Eseguiamo FASTA sulla proteina DIABLO di Drosophila Melanogaster

Allineamento Multiplo - Clustalw http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/

Bioinformatica59

CLUSTALWMultiple sequence alignment program for DNA or proteins


Bioinformatica60

ALGORITMO PROGRESSIVO: Si ottengono prima tutti i possibili allineamenti di coppia e si registra il

punteggio di ciascuno (Si mantiene una matrice di tutte le distanze);

Con questi punteggi si costruisce un albero filogenetico in modo da visualizzare le relazioni evolutive (neighbour joining);

Ad ogni passo si allineerà la coppia (seq-seq o seq-profilo o profilo-profilo) con distanza minima;

La radice dell’albero conterrà l’allineamento multiplo;

AGTTGGACTTGG

CCTTGGAGTTGG

AG__GGCCTTGGAGTTGG

AGTTGGACTTGGAG__GGCCTTGGAGTTGG

AGTTGG

AGGGCCTTGGAGTTGC

ACTTGG


Bioinformatica61

PROFILI: Dato un allineamento multiplo M di N sequenze di lunghezza L , un profilo P

è una matrice | ∑{-}| L le cui colonne denotano le freaquenze di ogni simbolo nella corrispondente colonna dell’allineamento;

1 2 3 4 5 6 7 8

A ¾ 0 0 0 ½ ½ 0 ¼

T 0 0 0 1 ½ 0 ¼ 0

G 0 0 ½ 0 0 0 ¼ 0

C 0 ¾ 0 0 0 0 0 0

- ¼ ¼ ½ 0 0 ½ ½ ¾

A-GTT—TAAC-TTA--ACGTAAG--C-TA---


Bioinformatica62

ALLINEARE UNA SEQUENZA CON UN PROFILO: Sia P =(pij) per i=1… |∑|+1 e j=1… L un profilo, e sia S=s1…sn una

sequenza.

Possiamo definire la seguente funzione di score:

σsp: (∑ {-}) {1,2,…,L} R

),(),( bapiba

aisp


Bioinformatica63

ALLINEARE DUE PROFILI: Siano P1 =(pij) e P2 =(pik) per i=1… |∑|+1, j=1… L’ k=1…L’’, due profili.

Possiamo definire la funzione di score:

σpp: {1,2,…,L’}{1,2,…,L’’} R

Rimpiazzando la funzione di score σ con σpp l’allineamento di due allineamenti multipli si riduce al confronto di due profili;

}{ }{

),(),(a b

bjaipp bappji


Bioinformatica64

Utilizziamo SRS;

Selezioniamo “Library Page”;

Scegliamo il DB “Uniprotkb-SwissProt”;

Clicchiamo su “Standard Query

Form”;

ESEMPIO PRATICO: Vogliamo allineare le sequenze aminoacidiche della proteina NAD6 dei

metazoi ma non dei mammiferi;


Bioinformatica65

Impostiamo la Query


Bioinformatica66

Salviamo i risultati in un file di testo nel formato “fasta2seqs”;


Bioinformatica67

Sul sito di ClustalW facciamo un upload delle sequenze e lanciamo il tool


Bioinformatica68

Risultato dell’allineamento: Formato testuale e colori.


Bioinformatica69

Sommario: Tabella delle distanze


Bioinformatica70

JALVIEW: Permette di visualizzare/editare l’allineamento (modificando / cancellando / inserendo amino acidi)Colori: Ad ogni aminoacido (o simili) è assegnato un colore;

Conservation: misura il numero di proprietà fisico-chimiche conservate per ogni colonna dell'allineamento.

Quality: Qualità dell’allineamento in base alla matrice di score utilizzata.

Consensus: Aminoacido più conservato in ogni posizione (compreso il simbolo di gap). Se ci sono più consensi viene indicato il simbolo +;


Bioinformatica71

Albero filogenetico ricavato dall’allineamento progressivo (i rami hanno lunghezza proporzionale alla distanza tra le sequenze) .


Bioinformatica72

OPZIONI.

Si seleziona il tipo di sequenza;

Si incollano le sequenze o si fa un upload di un file;


Bioinformatica73

OPZIONI.

Pairwise Alignment Type:

Slow (lento ma accurato);

Fast (veloce ma approssimato);


Bioinformatica74

OPZIONI.

SLOW OPTIONS

Matrici di score;

GOP;

GEP;


Bioinformatica75

OPZIONI.

FAST OPTIONS

KTUP: Più basso è il valore più accurata e la ricerca (ma più lento sarà il programma); Esso rappresenta il minimo numero di residui contigui identici affinchè una coppia di sequenze sia considerata simile;

WINDOW LENGTH: Dimensione della finestra in cui vengono ricercati i residui contigui. Decrementare per velocizzare la ricerca; Incrementare per aumentare l’accuratezza.

SCORE TYPE: Percentuale o valore assoluto;

TOPDIAG: Decrementare per velocizzare; Incrementare per aumentare l’accuratezza.

PAIRGAP: Gap penalty;


Bioinformatica76

OPZIONI.

Multiple Alignment Type:

Matrici di score;

GOP e GEP;

GAP Distances: Penalità assegnata a gap troppo vicini;

NO ENDS GAPS: Riferito alla voce precedente per i gap alla fine delle sequenze;

Iteration: Migliora la qualità dell’allineamento (NO, Ad ogni step, solo all’ultimo allineamento).

CLUSTERING: Tipo di clustering: Neighbour Joining etc.;

Output Format;


Bioinformatica77

ESERCIZIO I: Identificare le sequenze corrispondenti della proteina (avente 214aa)

umana shp-2 in topo, ratto e drosophila con E-value migliore. Costruirne l'allineamento multiplo; Quale è la parte più conservata? Visualizzare l’albero filogenetico e trarne le dovute considerazioni.


Bioinformatica78

ESERCIZIO II: Utilizzando Entrez o SRS, estrai le sequenze in formato Fasta delle

proteine aventi i seguenti accession number: P96551, P47700, P48525, O33120 e O25360 e prendi nota degli organismi a cui appartengono;

Conservare le sequenze fasta in un file; Lanciare ClustalW; A quale organismo appartiene la sequenza più lunga e di quanti

aminoacidi è composta? Quali sono gli AC della coppia con score più alto?


Bioinformatica79

ESERCIZIO III: Recuperare le sequenze proteiche in formato fasta YP_521353.1,

YP_864391.1, YP_286398.1, NP_249218.1, YP_316351.1, YP_284886.1, ZP_00942609.1

Lanciare ClustalW; Visualizzare e commentare l’albero filogenetico.

Allineamento Multiplo – TCoffee http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/

Bioinformatica80


Bioinformatica81

T-Coffee (Tree-based Consistency Objective Function for alignment Evaluation)

Dato un insieme di sequenze un allineamento è ottimale se esso è il più possibile consistente con tutti i possibili allineamenti pairwise ottimali;

STEP 1: Viene generata una “Primary Library” contenente un insieme di allineamenti pair-wise tra tutte le sequenze di input. Allineamenti globali: tra tutte le coppie di sequenze (ClustalW); Allineamenti locali: I primi 10 migliori allineamenti locali per ogni

coppia di sequenze (lalign);

Ogni coppia di residui ha inizialmente un peso pari a quello dato dalla identità percentuale;

Le due librerie vengono combinate in una sola con un semplice processo additivo: se una coppia di residui è presente in entrambe, viene fusa in una sola entry il cui peso è dato dalla somma dei pesi;


Bioinformatica82

Libreria primaria di allineamenti pairwise globali Tutte le coppie di sequenze in input vengono allineate mediante

ClustalW. Per ogni allineamento pairwise viene calcolata l’identità

percentuale:

Dove sim(S1,S2) è il numero dei match nell’allineamento e pos il numero delle coppie allineate di residui escluse quelle in cui compare un gap.

pos

SSsimSSI

100),(),( 21

21%

S1) A C A - G – T C AS2) A G - T G C T – T

605

1003),( 21%

SSI


Bioinformatica83

Nella libreria ogni allineamento pairwise è rappresentato come una lista di coppie di residui pesati (constraint list);

Inizialmente ogni coppia di residui riceve un peso equivalente alla sequence identity dell’allineamento da cui proviene:

Seq1 Seq2 Res1 Res2 WeightS1 S2 1 1 60S1 S2 2 2 60S1 S2 4 4 60S1 S2 5 6 60S1 S2 7 7 60

S1) A C A - G – T C AS2) A G - T G C T – T


Bioinformatica84

• Viene creata una seconda libreria a partire dagli allineamenti locali creati con LAlign, un tool del pacchetto FASTA;

• L’allineamento locale di una coppia di sequenze S1, S2 consiste nell’allineamento di sottosequenze di S1 ed S2, al fine di mettere in evidenza eventuali regioni ad alta similarità:

• LAlign restituisce i 10 migliori allineamenti locali (in termini di similarità) della coppia di sequenze in input;

• Una volta individuato l’allineamento locale con il massimo score, LAlign cerca il successivo escludendo dalla ricerca le due regioni appena trovate: in questo modo gli allineamenti prodotti non si intersecheranno.

S1

S2


Bioinformatica85

A partire dalle due librerie globale e locale viene creata un’unica libreria primaria mediante una semplice operazione di addizione;

Le coppie di residui comuni vengono sostituite da un’unica entry il cui peso è la

somma dei due pesi, mentre tutte le altre coppie vengono trascritte così come sono:

Global Alignments by ClustalWSeq1 Seq2 Res1 Res2 Weight

S1 S2 1 1 60S1 S2 2 2 60S1 S2 3 3 60S1 S2 5 6 60S1 S2 7 7 60

Local Alignments by LAlignSeq1 Seq2 Res1 Res2 Weight

S1 S2 1 1 30S1 S2 2 2 30S1 S2 3 3 30S1 S2 15 22 10S1 S2 16 23 10

Primary LibrarySeq1 Seq2 Res1 Res2 Weight

S1 S2 1 1 90S1 S2 2 2 90S1 S2 3 3 90S1 S2 5 6 60S1 S2 7 7 60S1 S2 15 22 10S1 S2 16 23 10


Bioinformatica86

STEP II: Calcolo dei pesi nella “Extended Library”. Ad ogni coppia di residui allineati nella libreria viene assegnato un peso in base agli altri allineamenti pairwise; Date due sequenze S1 e S2. Allineamo prima S1 e poi S2 con le

rimanenti; Fatto l’allineamento tra S1 e Zi e S2 e Zi:

se i residui x di S1 e y di S2 sono allineati con lo stesso residuo z di Zi allora il peso della coppia di residui w(x,y) viene incrementato ponendolo uguale a:

w(x,y) + min(w(x,z),w(z,y)) Altrimenti nella libreria vengono inserite altre due coppie (x,z) e (z,y) con i

relativi pesi;

STEP III: Esegue l’allineamento progressivo utilizzando la libreria al posto delle matrici di score;


Bioinformatica87

Quattro sequenze e il relativo allineamento progressivo con ClustalW

SeqA GARFIELD THE LAST FAT CAT

SeqB GARFIELD THE FAST CAT

SeqC GARFIELD THE VERY FAST CAT

SeqD THE FAT CAT

SeqA GARFIELD THE LAST FA-T CATSeqB GARFIELD THE FAST CA-T ---SeqC GARFIELD THE VERY FAST CATSeqD THE FA-T CAT

SeqA GARFIELD THE LAST FA-T CATSeqB GARFIELD THE ---- FAST CATSeqC GARFIELD THE VERY FAST CATSeqD THE FA-T CATfrom Notredam et al. 2000


Bioinformatica88

SeqA GARFIELD THE LAST FAT CAT SeqB GARFIELD THE FAST CAT ---

SeqA GARFIELD THE LAST FA-T CATSeqC GARFIELD THE VERY FAST CAT

SeqA GARFIELD THE LAST FAT CATSeqD -------- THE ---- FAT CAT

SeqB GARFIELD THE ---- FAST CATSeqC GARFIELD THE VERY FAST CAT

SeqB GARFIELD THE FAST CATSeqD -------- THE FA-T CAT

SeqC GARFIELD THE VERY FAST CATSeqD -------- THE ---- FA-T CAT

Consistency

SeqA GARFIELD THE LAST FAT CAT |||||||| ||| |||| |||SeqB GARFIELD THE FAST CAT ---

SeqA GARFIELD THE LAST FAT CAT |||||||| ||| |||| || \ \\\SeqC GARFIELD THE VERY FAST CAT |||||||| ||| |||| |||| |||SeqB GARFIELD THE FAST CAT

SeqA GARFIELD THE LAST FAT CAT ||| ||| |||SeqD THE FAT CAT ||| ||\ \\\ SeqB GARFIELD THE FAST CAT

STEP II: Per ogni coppia di sequenze controlla l’allineamento di ogni coppia di residui usando gli altri allineamenti;

Extended library

SeqA GARFIELD THE LAST FAT CAT

SeqB GARFIELD THE FAST CAT

Programmazione dinamica

SeqA GARFIELD THE LAST FA-T CAT

SeqB GARFIELD THE ---- FAST CAT

w(A(G),B(G)) + min(w(A(G),C(G)) w(C(G),B(G)))

I pesi sono utilizzati nell’allineamento finale progressivo al posto delle matrici di score

Per esempio la coppia A(G),B(G) avrà un peso dato da:

STEP I: Library of pairwise alignments


Bioinformatica89

L’algoritmo:(1) Calcolo degli allineamenti pairwise

con ClustalW;

(2) Calcolo degli allineamenti locali con LAlign (10 migliori allineamenti per ogni coppia di sequenza)

(3) Calcolo della primary library con i relativi pesi;

(4) Estensione della libreria con il calcolo dei pesi in base a tutti gli allineamenti pariwise;

(5) Allineamento progressivo usando i pesi per ogni coppia di residui al posto delle matrici di score;

Weighting

Primary library

Extension

Extended library

Progressive alignment

ClustalW globalPairwise alignments

LAlign local pairwise alignments

ABC


Bioinformatica90

Tool Online sul sito di EMBL


Bioinformatica91

Esempio di Output del tutto simile a quello di ClustalW;

Allineamento Multiplo – Anticlustal http://alfredo.dmi.unict.it/ac2/

Bioinformatica92


Bioinformatica93

Antipole Clustering Algorithm sostituisce l’albero guida di ClustalW per la costruzione dell’allineamento multiplo;

Permette di velocizzare il processo di allineamento con risultati paragonabili o migliori a quelli ottenuti con ClustalW;

Il metodo di allineamento può essere riassunto in: Costruire l’albero di clustering (rappresenta l’albero filogenetico); Allinea progressivamente le sequenze partendo dalle foglie fino alla radice

che conterrà l’allineamento finale;


Bioinformatica94

CLUSTERING: Presupposto: Sequenze lontane saranno sicuramente in cluster

diversi.

1-Mediana approssimata per il calcolo del diametro; Splittare il dataset in due cluster; Applicare ricorsivamente il metodo fin quando la dimensione dei

cluster supera un certo parametro σ;


Bioinformatica95

1-Mediana Sia S un database di oggetti in uno spazio metrico, dato il

numero intero k, il problema della k-mediana per S consiste nel trovare k oggetti c1, c2, …, ck in S che minimizzano:

Per k = 1 il problema è chiamato 1-mediana e consiste nel ricercare un elemento tale che la seguente funzione è minimizzata:

Ssi

kik csdcccw ),(min),...,,(

,...,121

Ss

csdcw ),()(


Bioinformatica96

1-Mediana approssimata


Bioinformatica97



Bioinformatica98



Bioinformatica99



Bioinformatica100



Bioinformatica101



Bioinformatica102



Bioinformatica103



Bioinformatica104


The final winner


Bioinformatica105

Pseudo Diametro: Se ad ogni step eliminiamo l’elemento centrale e manteniamo gli altri

due elementi, applicando lo stesso algoritmo possiamo calcolare un diametro approssimato (cioè la coppia di elementi più distanti);


Bioinformatica106

Costruzione dell’Antipole Tree


Bioinformatica107


AB>


Bioinformatica108


AB>

SASB


Bioinformatica109


>

SASB

A1

A2

BA


Bioinformatica110


>

SASB

A1

A2

BA

SA1

SA2


Bioinformatica111


SASB

A1

A2

B

CA1

CA2

A


Bioinformatica112


B>

SASB

A1

A2

B2

B1

CA1

CA2

A


Bioinformatica113


B

SASB

A1

A2

B2

B1

CA1

CA2

A

SB1

SB2


Bioinformatica114


B

SASB

A1

A2

B2

B1

CA1

CA2

A

CB1

CB2


Bioinformatica115


A1

A2

B2

B1

CA1

CA2

CB1

CB2


Bioinformatica116

How to align two clusters

How to align the sequences in a cluster

Multiple sequence alignment via the Antipole tree


Bioinformatica117

ANTICLUSTAL++ Costruisce una libreria di pesi per ogni coppia di residui allo stesso

modo di T-Coffee;

Le sequenze sono clusterizzate con l’algoritmo Antipole;

L’albero antipole è visitato in modo bottom-up producendo una “Level Matrix”: Ad ogni step se due sequenze si trovano assieme nello stesso cluster, la corrispondente entry nella matrice viene incrementato;

Alla fine la “Level Matrix” darà un indice di similarità tra le sequenze; Tale matrice verrà usata per raffinare la libreria che alla fine verrà usata per l’allineamento vero e proprio allo stesso modo di T-Coffee;


Bioinformatica118

Formato di Output: FASTA, GCG, etc;

Metodi per calcolare la libreria: ClustalW, FASTA etc.

Programmazione dinamica: Myers and Miller, FASTA, etc.

Usare un albero filogenetico precalcolato;


Bioinformatica119

Metric: CRISP o PAM;

Diameter: Distanza per cui due sequenze sono considerate diverse;

GOP e GEP;

Metodo di vista dell’albero antipole: Right Left o Left Right;

Web Logo: E’ una rappresentazione grafica dell’allineamento; Si possono fornire i residui di Start e End per la rappresentazione grafica;


Bioinformatica120

ESEMPIO: Risultati di un allineamento con tutti gli elementi scaricabili;


Bioinformatica121

ESERCIZIO: Utilizzando Entrez o SRS, estrai le sequenze in formato Fasta delle

proteine aventi i seguenti accession number: P96551, P47700, P48525, O33120 e O25360 e prendi nota degli organismi a cui appartengono;

Conservare le sequenze fasta in un file; Confrontare l’albero filogenetico costruito con ClustalW e quello

ottenuto dall’algoritmo antipole. Ci sono differenze?

Allineamento Multiplo – MUSCLE http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/

Bioinformatica122

MUSCLE: MUltiple Sequence Comparison by Log- Expectation


Bioinformatica123

Stage 1

Stage 2

Stage 3


Bioinformatica124

Stage 1

Stage 2

Stage 3

MUSCLE - Stage 1

1. Calcola la kmer distance tra tutte le coppie di sequenze;

2. Similmente al neighbor- joining, con tali distanze viene calcolato il guide tree basato su UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean);

3. Calcola l’allineamento progressivo;

Bioinformatica125

MUSCLE - Stage 2: Improved progressive

1. Utilizzando l’allineamento del primo step, vengono estratti tutti gli allineamenti pairwise che ne derivano;

2. Viene calcolata la Kimura distance tra tutte le coppie di sequenze;

3. Viene calcolato un nuovo albero usando queste distanze;

4. Viene calcolato un nuovo allineamento multiplo con l’allineamento progressivo;

Bioinformatica127

MUSCLE - Stage 3:Refinement

1. Sceglie un arco random nell’albero;

2. Divide le sequenze in due set;

3. Estrae i due allineamenti multipli (profile) corrispondenti;

4. Rellainea i due profili;

5. Accetta il nuovo allineamento se gli score (Sum of Pair) sono migliori;

6. Itera;

Bioinformatica129


Bioinformatica130


Bioinformatica131

Allineamento Multiplo – PROBCONS http://probcons.stanford.edu/

Bioinformatica132


Bioinformatica133

L’algoritmo:

(1) Calcola le Pair HMM posterior probabilities per ogni coppia di sequenze;

(2) Calcola la maximum expected accuracy tra tutte le coppie di sequenze;

(3) Applica la probabilistic consistency transformation alle posterior probabilities;

(4)Calcola il guide tree dai valori maximum expected accuracy;

(5)Allinea le sequenze progressivamente usando il guide tree;

(6)Raffina iterativamente l’allineamento multiplo;

First order Hidden Markov Model (HMM)

X1X2 XL-1 XLXi

Hidden states

Observed symbols

H1 H2 HL-1 HLHi

Markov Property: The state of the system at time i+1 depends only on the state of the system at time i

)|Pr( 1 bXaX ii

transition probabilities (between hidden states)

emission probabilities (probability that a given observation symbol was generated by a hidden state)

Three problems

Evaluation (Computed with forward and backward probabilities)Given a model M and an observation x,Compute Pr[ x | M ]

Decoding (Viterbi Algorithm or Posterior Decoding)Given a model M and an observation x,Identify a hidden state sequencewhich maximizes Pr[ x, | M ]

Likelihood of evidenceGiven a model M with unspecified transition emission probabilities and an observation xPr[x| M] Durbin et al. (1998)

Bioinformatica134

Pair HMMs

START

MPs[i]t[j]

IS

qs[i]

IT

qt[j]

21

1

1

END

21

start M IS IT end

start -- 1-2δ-τ δ δ τ

M -- 1-2δ-τ δ δ τ

IS -- 1-ε-τ ε -- τ

IT -- 1-ε-τ -- ε τ

end -- -- -- -- 1

Emission probabilities:

M Pr[(a,b) | M] = pab

IS Pr[(a,-) | IS] = qa

IT Pr[(-,a) | IT] = qaBLOSUM estimation

Transition probabilities:

With pair HMMs

Viterbi algorithm can be used to compute the optimal pairwise alignment of two sequences;

computing if two sequences are related to the pair HMM using the forward algorithm;

finding the posterior probabilities of an alignment, an aligned pair of symbols;

computing the expected accuracy of a given alignment.

Durbin et al. (1998)Bioinformatica135

PHMM posterior probabilities for each pair of sequences. Reliability measure for each part of an alignment

Given two residues si, tj from sequence S and T of length n and m

Uses forward and backward algorithms for Pair HMM to compute posterior probabilities that si and tj are matched in the alignment (the true biological one)

MPs[i]t[j

]

IS

qs[i]

IT

qt[j]

21

1

),Pr(

),(),(}~1{),|Pr(),|~Pr(

TS

jibjifatsTSaTSts MM

Aajiji

1

Will be equal to 1 when si and tj are aligned in a, 0 otherwise

The probability of any single complete path being entirely correct is small. To analyze the local accuracy of an alignment could result very useful. Often part of an alignment is fairly clear and other regions are less certain. It can be useful to be able to give a reliability measure for each part of an alignment. Bioinformatica136

Compute the maximum expected accuracy

Compute an alignment a by align sequences with simple Needleman-Wunsch algorithm Using the posterior probabilities as the match and

mismatch scores Set Gap penalties to 0

The goal is to find an alignment a which maximizes the expected accuracy (try to identify a* -- the best alignment -- for all sequence pairs). This can be expressed in function of posterior match probabilities.

ats

jia

ji

TStsmn

TSaaaccuracyE~

* ),|~Pr(},min{

1),|*),((

Bioinformatica137

Probabilistic consistency Apply probabilistic consistency approximating

it using matrix multiplication.

The probability of residues si and tj being aligned given the set of all sequences

Sz z

jkki

k

yztzzxzsS

),|~Pr(),|~Pr(1

Bioinformatica138

Guide tree computation and progressive alignment Use UPGMA as guide tree built using

maximum expected accuracy distances

Perform profile alignment with sum-of-pairs with maximal expected accuracy scoring

No gap penalties

Bioinformatica139

Iterative refinement Randomly partition sequences into two

sets

Extract multiple alignments for both sets from current multiple alignment

Re-align two multiple alignments

No gap penalty, sum-of-pairs scoring guaranteed to increase or stay the same

Bioinformatica140

ProbCons is a PHMM model-based progressive alignment which

uses Maximum Expected Accuracy and integrates probabilistic consistency transformation.

Bioinformatica141


Bioinformatica142

Bioinformatica Allineamento di sequenze e ricerca di similarità Dr. Giuseppe Pigola –...

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