Biofisica: la Biofisica: la complessità della complessità della

vita e la vita e la semplicità della semplicità della

fisicafisica

Velia MinicozziVelia Minicozzi

Struttura e funzione della proteina

THR

PHE

ARG

ASN

amino acidi

Dal genoma:… ACU UUC CGU AAC…

Alla sequenza proteica:… THR PHE ARG ASN…

DNA

aminoacidi

statounfolded

foldingintermedio

statonativo

Studio di biosistemi con metodologie…

...sperimentali

Risonanza Paramagnetica Elettronica

Risonanza Magnetica Nucleare

Anello di sincrotrone

Spettroscopia LASER

Studio di biosistemi con metodologie…

Struttura e funzione della proteina

THR

PHE

ARG

ASN

amino acidi

Dal genoma:… ACU UUC CGU AAC…

Alla sequenza proteica:… THR PHE ARG ASN…

DNA

aminoacidi

statounfolded

foldingintermedio

statonativo

...numerico/teoriche

Applicazione di tecniche biofisiche a

problemi…

…di fisica medica

Struttura e funzione della proteina

THR

PHE

ARG

ASN

amino acidi

Dal genoma:… ACU UUC CGU AAC…

Alla sequenza proteica:… THR PHE ARG ASN…

DNA

aminoacidi

statounfolded

foldingintermedio

statonativo

TERA – Fondazione per Adroterapia Oncologica

La Fondazione TERA ha come scopo lo sviluppo, in Italia e all'estero, delle tecniche di radioterapia basate sull'uso di particelle adroniche e, più in generale, delle applicazioni della fisica e dell'informatica alla medicina e alla biologia.

Laurea Magistrale in Fisicaindirizzo

Fisica dei Biosistemitre sotto-indirizzi

Teorico-Numerico, Sperimentale, Medico

Corso di Laurea in FisicaCorso di Laurea in Fisica

Laurea Triennale (180 cfu)

Laurea Magistrale (120 cfu)

Per informazioni riguardanti i curricula in Fisica dei Sistemi Biologici e le modalità di accesso alla Laurea Magistrale provenendo da altri curricola di Scienze, potete telefonare o spedire una email alla Prof.ssa Silvia Morante: Tel. 06 72594554, email: silvia.morante@roma2.infn.it

Problema biologico

Problema medico

“Strumento” matematico

“Strumento” fisico

Azione terapeutica

Conoscenza

Modello di funzionamento

ProteineProteine

• Proteina = polimero lineare composto di aminoacidi legati tramite un legame peptidico

1. Sequenza aminoacidica

2. struttura locale della catena aminoacidica

3. Struttura 3D della molecola

4. Distribuzione spaziale di subunità differenti non legate da legami covalenti

Folding & MisfoldingFolding & Misfolding

•Il folding delle proteine dipende dalla loro struttura primaria ma anche da altre caratteristiche (pH, membranes, metal ions)

• Errori nel folding delle proteine sono alla base di malattie dette Protein Conformational Disorders (PCD)

• In molte PCD le proteine misfolded sono ricche in struttura β e formano aggregati

β-sheet ⊥ fibril axis

Clinical Syndrome Fibril SubunitAlzheimer’s DiseaseAlzheimer’s Disease AAββ -peptide-peptide

Spongiform encephalopathiesSpongiform encephalopathies Prion proteinPrion protein

Parkinson’s diseaseParkinson’s diseaseαα -synuclein-synuclein

Type II diabetes Amylin

Thyroid carcinoma Procalcitonin

Atrial amyloidosis Atrial natriuretic factor

Amyotrophic lateral sclerosisAmyotrophic lateral sclerosis Superoxide dismutaseSuperoxide dismutase

Huntington diseaseHuntington disease GlutamineGlutamine

Primary systemic amyloidosis Ig light chains

Secondary systemic amyloidosis Serum amyloid A

Senile systemic amyloidosis Transthyretin (wild tipe)

Familial amyloidotic polyneuropathy I Transthyretin (mutant)

Familial amyloidotic polyneuropathy II Apolipoprotein A1

Familial Mediterranean fever Serum amyloid A

Hemodialysis-related amyloidosisβ2-microglobulin

Finnish hereditary systemic amyloidosis Gelsolin (mutant)

Lysozyme systemic amyloidosis Lisozime

Insulin-related amyloidosis Insulin

Fibrinogen systemic amyloidosis Fibrinogen α chain

Sono state osservate circa 20 PCD

•Molte di loro colpiscono il Sistema Nervoso Sistema Nervoso CentraleCentrale

PCDs

Malattie da Prioni: Malattie da Prioni: Encefalopatia spongiforme trasmissibile (TSE)Encefalopatia spongiforme trasmissibile (TSE)

BSE (mucca pazza) ScrapieMalattia di Creutzfeldt-Jacob (CJD)

Un gruppo di malattie trasmesse (?) da una proteina (il prione)

Prove istologiche (Prove istologiche (post post mortemmortem) ) nel cervello: vacuoli nel cervello: vacuoli circondaticircondatida depositi di placcheda depositi di placche

AlzheimerAlzheimer

Prove istologiche (post mortem) nel cervello: depositi di placche amiloidi (in vivo con PET)

Malattia neurologica progressivadebilitante che porta a perdita irreversibile di memoria ed altre

capacità, fino alla completa dipendenza da assistenza. Tempo di sviluppo: circa 8 anni dopo la

diagnosi.

Diagnosi per mezzo di testDiagnosi per mezzo di testneuropsicologicineuropsicologici

• Malattia di Alzheimer

• Encefalopatie spongiforme Trasmissibile (TSEs):

nell’uomo: malattia di Creutzfeldt-Jakob sporadica familiare iatrogenica variante

nella pecora: Scrapie nei bovini: Encefalopatia Bovina Spongiforme

• Malattia di Parkinson; Demenza con corpi Lewy

• Sclerosi amiotrofica laterale

• Malattia di Huntington

Diagnosi in vivo con Tomografia da emissione di positroni (PET)

post m

orte

m fo

tom

icrogra

fia d

i una se

zione isto

logica

del te

ssuto

del ce

rvello

100 nm

Cosa hanno in comune?Cosa hanno in comune?Formazione di fibrille amiloidi che costituiscono il centro del deposito

Le fibrille si formano per aggregazione di peptidi o proteine che vivono spesso un’esistenza da Dr. Jekyll - Mr.

Hyde (PrP, APP, α-sinucleina) nel processo folding - misfolding.

Un ruolo importante, come “Un ruolo importante, come “pozione magica”pozione magica” o o come “come “antidoto”,antidoto”, è forse giocato da metalli come è forse giocato da metalli come

Cu, Zn e Fe.Cu, Zn e Fe.

morfologia

proteine diverse che formano fibrilleproteine diverse che formano fibrillenon hanno omologie né strutturali né chimichenon hanno omologie né strutturali né chimiche

proprietà istologiche

tutte le fibrille da amiloidi presentano notevoli somiglianzetutte le fibrille da amiloidi presentano notevoli somiglianze

Scale bar: 100 nm

mama

β-foglietti: ⊥ asse della fibrilla

fibrille che legano congo-dye strutture cross-beta

Human body: ~7 x 1027 atoms99% : C, H, O and N;

87%: are either H or O;but 41 different elements

Estimated Atomic Composition of a lean 70-kg Male Human Body

Element Sym # Atoms Element Sym # Atoms Element Sym # AtomsHydrogen H 1 4.22 x 1027 Rubidium Rb 37 2.2 x 1021 Zirconium Zr 40 2 x 1019

Oxygen O 8 1.61 x 1027 Strontium Sr 38 2.2 x 1021 Cobalt Co 27 2 x 1019

Carbon C 6 8.03 x 1026 Bromine Br 35 2 x 1021 Cesium Cs 55 7 x 1018

Nitrogen N 7 3.9 x 1025 Aluminum Al 13 1 x 1021 Mercury Hg 80 6 x 1018

Calcium Ca 20 1.6 x 1025 Copper Cu 29 7 x 1020 Arsenic As 33 6 x 1018

Phosphorus P 15 9.6 x 1024 Lead Pb 82 3 x 1020 Chromium Cr 24 6 x 1018

Sulfur S 16 2.6 x 1024 Cadmium Cd 48 3 x 1020 Molybdenum Mo 42 3 x 1018

Sodium Na 11 2.5 x 1024 Boron B 5 2 x 1020 Selenium Se 34 3 x 1018

Potassium K 19 2.2 x 1024 Manganese Mn 25 1 x 1020 Beryllium Be 4 3 x 1018

Chlorine Cl 17 1.6 x 1024 Nickel Ni 28 1 x 1020 Vanadium V 23 8 x 1017

Magnesium Mg 12 4.7 x 1023 Lithium Li 3 1 x 1020 Uranium U 92 2 x 1017

Silicium Si 14 3.9 x 1023 Barium Ba 56 8 x 1019 Radium Ra 88 8 x 1010

Fluorine F 9 8.3 x 1022 Iodine I 53 5 x 1019 Iron Fe 26 4.5 x 1022 Tin Sn 50 4 x 1019 Zinc Zn 30 2.1 x 1022 Gold Au 79 2 x 1019 TOTAL 6.71x1027

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 181 H He

1 2

2 Li Be B C N O F Ne

3 4 5 6 7 8 9 10

3 Na Mg Al Si P S Cl Ar

11 12 13 14 15 16 17 18

4 K Ca Sc Ti V Cr Mn Fe Co Ni Cu Zn Ga Ge As Se Br Kr

19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

5 Rb Sr Y Zr Nb Mo Tc Ru Rh Pd Ag Cd In Sn Sb Te I Xe

37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

6 Cs Ba * Hf Ta W Re Os Ir Pt Au Hg Tl Pb Bi Po At Rn

55 56 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86

7 Fr Ra ** Rf Db Sg Bh Hs Mt Uun Uuu Uub

87 88 104 105 106 107 108 109 110 111 112

* La Ce Pr Nd Pm Sm Eu Gd Tb Dy Ho Er Tm Yb Lu57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71

** Ac Th Pa U Np Pu Am Cm Bk Cf Es Fm Md No Lr89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103

Element Groups (Families)Alkali Earth Alkaline Earth Transition MetalsRare Earth Other Metals MetalloidsNon-Metals Halogens Noble Gases

Dove vanno i metalli

I reni

0.5% del totale del peso ricevono il 25% del flusso di sangue⇓

Concentrano le sostanze di scarto inclusi i metalli

FegatoFunzione primaria: rimuovere gli agenti tossici

⇓è carico di enzimi che distruggono composti

chimici estranei⇓

è il primo organo ad essere esposto a metalli tossici

Fe: livello medio accumulato nel corpo: 3÷4 grZn: livello medio accumulato nel corpo: 1.5 ÷2.5 grCu: livello medio accumulato nel corpo : 50÷120 mg

(la maggior parte nel fegato)

Sistema Nervoso Centrale

Molti metalli tossici possono attraversare la barriera emato-encefalica

⇓Le cellule nervose non possono rigenerarsi

una volta danneggiate

Gli ioni metallici possono danneggiare le cellule cerebrali direttamente disturbando l’equilibrio elettrochimico promuovendo il mis-folding

I metalli entrano per inalazione⇓

Tutto il sangue passa per i polmoni molte volte al giorno⇓

Le sostanze tossiche hanno molte opportunità di entrare nel flusso sanguigno

Polmoni

Come può essere d’aiuto la Come può essere d’aiuto la Fisica nella soluzione di tali Fisica nella soluzione di tali

problemi?problemi?

Fisica SperimentaleFisica Sperimentale

Radiazione ElettroMagnetica (EM) (luce visibile, radiazione UltraVioletta e Infrarossa, MicroOnde,

RadioFrequenza, raggi X, ...) Composizione, struttura e proprietà della

materia

assorbimento ⇒ atomi e molecole “eccitati” ⇒l’energia EM è trasferita al moto (rotazionale, vibrazionale, elettronico, …) di atomi e molecole atomi e molecole “eccitate” tornano nello stato

fondamentale ⇒ emissione energia EM

Spettroscopiaspectrum (apparenza, immagine) + σκοπεω (osservo)

EM ⇔ materia ⇓

scambio di energia

TIPI di SPETTROSCOPIATIPI di SPETTROSCOPIATipo diTipo di

ProcessoProcesso

I raggi XI raggi X

Conrad Wilhelm Röntgen 1845 -1923Fisico

8 Novembre 1895 - Scoperta dei raggi X

1901 - Premio Nobel per la Fisica

“in riconoscimento dello straordinario servizio reso per la scoperta delle importanti radiazioni che in seguito presero il suo nome”

La prima radiografia medica eseguita da Röntgen il 22 dicembre 1895 alla mano sinistra della moglie Anna Berthe. È visibile anche l'anello (Hand mit Ringen)

Sorgenti di luceSorgenti di luce

Le sorgenti di luce (www.lightsources.org) sono sorgenti di radiazione eccezionalmente intensa, fortemente focalizzata di raggi X e radiazione ultravioletta, e infrarossa, basate sugli acceleratori di particelle che rendono possibile sia la ricerca di base in campi quali la fisica e la biologia sia la ricerca applicata.

Guardare l’invisibileGuardare l’invisibile

(Credit: Argonne National Laboratory)

Il successo dei tentativi di rendere visibile l’invisibile dipende, tra le altre cose, da come la luce di determinata lunghezza d’onda e di sufficiente intensità possa essere concentrata su un campione.

E’ come guidare di notte è necessaria un’illuminazione intensa davanti all’auto

Luce di SincrotroneLuce di SincrotroneNelle sorgenti di luce si sfrutta il fatto che quando particelle cariche vengono accelerate, emettono luce (irradiano).Se gli elettroni vengono accelerati avanti e indietro in un antenna a frequenze di kHz o MHz, essi irradiano nella parte dello spettro elettromagnetico delle onde radio o TV.Se gli elettroni sono costretti a muoversi su percorsi circolari e vengono accelerati verso l’interno della curva, essi irradiano e noi chiamiamo quella radiazione: luce, o radiazione, di sincrotrone.

La luce deve anche essere collimata con specchi parabolici, che accrescono ciò che si chiama brillanza. Questo è precisamente ciò che fa una sorgente di luce di sincrotrone: produce un alto flusso e lo concentra in un raggio molto sottile, come richiesto dalla maggior parte delle applicazioni di raggiX.

ELETTRAELETTRA

DAFNEDAFNE

ESRF - GrenobleESRF - Grenoble

Una sorgente di luce di sincrotrone comprende (1) pistola di elettroni, (2) un acceleratore lineare, (3) un sincrotrone supplementare, (4) un anello, (5) le linee e (6) le stazioni sperimentali. (Courtesy: Australian Synchrotron, Illustrator: Michael Payne)

Cos’è il Free Electron Laser?Cos’è il Free Electron Laser?

Il FEL è un nuovo tipo di sorgente di luce con brillanza che può arrivare ad essere fino ad un miliardo di volte maggiore di quella della luce di sincrotrone.

CristallografiaCristallografia

Ricostruzione 3D del cervello di un topo transgenico, Ricostruzione 3D del cervello di un topo transgenico, studio dell’Alzheimer, Krucker et al. (SCRIPPS, UZh, studio dell’Alzheimer, Krucker et al. (SCRIPPS, UZh, ETHZ, PSI). (Courtesy: Swiss Light Source/PSI) ETHZ, PSI). (Courtesy: Swiss Light Source/PSI)

L'emoglobina è stata soggetto di innumerevoli lavori. Il primo che riuscì a cristallizzarla ed a determinarne la struttura con la cristallografia a raggi X fu Max Perutz nel 1959.

EmoglobinaEmoglobina

La radiazione di sincrotrone esce tangenzialmente dall’anello e raggiunge le postazioni di misura

Nelle postazioni di misura: • la radiazione è inviata da elementi ottici al monocromatore• il monocromatore seleziona la lunghezza d’onda opportuna• la radiazione è inviata sul campione

Spettroscopia di Assorbimento Spettroscopia di Assorbimento dei raggi X (XAS)dei raggi X (XAS)

Il coefficiente di assorbimento, µ , decresce monotonamente con l’energia del fotone incidente, hν . Quando hν = E0 = energia di foto-ionizzazione di un elettrone interno dell’atomo assorbitore

(energia di soglia*), µ cresce rapidamente. Quindi decresce monotonamente dopo soglia.

*soglia K: ionizzazione degli elettroni più interni.

Spettro XAS da un atomo isolato (gas mono-atomico rarefatto)

E0

funzione d’onda elettronica

In un sistema multi-atomico µ non decresce monotonamente dopo la soglia, ma ha un andamento oscillante.

•L’assorbitore (punto rosso) emette un’onda sferica uscente (l’elettrone ionizzato, foto-elettrone). •Il diffusore (punto verde) agisce come un centro di diffusione, e l’onda retro-diffusa interferisce (in fase o fuori-fase) con quella uscente.

Spettro XAS di una molecola diatomica

interferenza

Spettro XAS di un atomo isolato (e.g. gas monoatomico) Spettro XAS di una molecola biatomica

µ(E)

E

µ(E)

E

Spettroscopia di Assorbimento Spettroscopia di Assorbimento dei raggi X (XAS)dei raggi X (XAS)

Alzheimer, metalli e luce di Alzheimer, metalli e luce di sincrotronesincrotrone

APP

APP

P3

17 40-

42

Aβ

1 40-42

α-secretase

β-secretase

γ-secretase

PlaccheAmiloidiNeurone

GrovigliNeurofibrillari

Peptide AbetaPeptide Abeta

Peptide APeptide Aββ – Esperimenti XAS – Esperimenti XAS

- Peptidi Aβ sintetici comprati da AnaSpec

- Vari frammenti di peptidi Aβ sospesi nel buffer NEMO, pH=7

- Cu2+ e Zn2+ da CuSO4 e ZnCl2

- 2 campioni di controllo: Cu-buffer, Zn-buffer

Aβ1-16H3N

+-DAEFRHDSGYEVHHQK-COO-

Aβ1-28H3N

+-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-COO-

Aβ5-23H3N

+-RHDSGYEVHHQKLVFFAED-COOH3N+

Aβ17-40H3N

+-LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV-COO-

Aβ1-40 H3N

+-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV-COO-

Cu2+/Zn2+-Aβ17-40 = Cu2+/ Zn2+ in solutionCu2+-(Aβ1-16, Aβ1-28) = Cu2+-Aβ1-40

Cu2+-Aβ5-23 ≠ Cu2+-Aβ1-40

Zn2+-(Aβ1-16, Aβ1-28, Aβ5-23) = Zn2+-Aβ1-40

-8

-4

0

4

4 6 8 10

Zn-Aβ1−16

Zn-Aβ1−28

Zn-Aβ1−40

Zn-Aβ5−23

Zn-Aβ17−40

k(Å) -1

-8

-4

0

4

4 6 8 10

Cu-Aβ1−16

Cu-Aβ1−28

Cu-Aβ1−40

Cu-Aβ5−23

Cu-Aβ17−40

k(Å) -1

EXAFS Analysis

0 1 2 3 4 5

DataFit

|FT|

r(Å)

-8

-4

0

4

4 6 8 10

DataFit

Cu-Aβ1-16

k(Å-1)

Coordinated Residue N r ± ∆r (Å)σ2

DW ± ∆σ2DW (Å2)

(Cu-Aβ)1-16

His 3 1.95 ± 0.01 0.002 ± 0.001

Tyr 1 2.06 ± 0.01 0.002 ± 0.001

O 1 1.95 ± 0.01 0.002 ± 0.001

∆Ef = -10.6 ± 0.7 eV; R= 28 %

(Cu-Aβ)1-16

-8

-4

0

4

4 6 8 10

DataFit

k(Å-1) 0 1 2 3 4 5

DataFit

|FT|

r(Å)

Coordinated Residue N r ± ∆r (Å)σ2

DW ± ∆σ2DW (Å2)

(Cu-Aβ)5-23

His 2 1.99 ± 0.01 0.003 ± 0.001

Tyr 1 2.06 ± 0.01 0.003 ± 0.001

N-terminus 1 1.99 ± 0.01 0.003 ± 0.001

O 1 2.27 ± 0.01 0.003± 0.001

∆Ef = -13.8 ± 0.4 eV; R= 40 %

(Cu-Aβ)5-23

-8

-4

0

4

4 6 8 10

DataFit

Zn-Aβ1-16

k(Å-1) 0 1 2 3 4 5

DataFit

r(Å)

|FT|

Coordinated Residue N r ± ∆r (Å)σ2

DW ± ∆σ2DW (Å2)

(Zn-Aβ)1-16

His 2 1.96 ± 0.01 0.003 ± 0.001

His 2 2.00 ± 0.01 0.003 ± 0.001

O 1 2.00 ± 0.01 0.003± 0.001

∆Ef = -6.5 ± 0.2 eV; R= 23 %

(Zn-Aβ)1-16

• Cu e Zn mostrano differenti siti di legame• Il sito di legame per I metalli è in entrambi i casi entro i primi 16 residui aminoacidici• Cu mostra una coordinazione intra-peptide• Zn mostra una coordinazione inter-peptide

Risultati

Quali altre tecniche fisico-Quali altre tecniche fisico-matematiche possono essere matematiche possono essere d’aiuto nella soluzione di tali d’aiuto nella soluzione di tali

problemi?problemi?

Fisica Teorica e ComputazionaleFisica Teorica e Computazionale

F = maF = ma

Biofisica ComputazionaleBiofisica Computazionale

Meccanica ClassicaMeccanica Classica

Meccanica QuantisticaMeccanica Quantistica

SupercomputerSupercomputer

JUGENE - Hardware Characteristics

72 racks (9x8) - 73728 nodes (294912 cores)

Overall peak performance: 1 Petaflops

Main memory: 144 TB

Compute Card/Processor:

Power PC 450, 32-bit, 850 MHz, 4-way SMP

Peak performance: 13.6 GFlops

Networks:

Three-dimensonal torus (compute nodes),

bandwidth per link: 425 MB/s (total: 5.1 GB/s), hardware latency: 100ns - 800ns

ProcessoriProcessori

Cell è il nome di una tipologia di processori sviluppati da IBM in cooperazione con Sony e Toshiba.La famiglia di processori Cell è sviluppata per permetterne un utilizzo quasi universale. Si tratta di CPU progettate per utilizzare la computazione parallela e Sony li utilizza anche per la console PlayStation 3.

Modello per dinamica Modello per dinamica molecolaremolecolare

FilminoFilmino

FilminoFilmino

Simulazione del processo di legame di un inibitore ad Simulazione del processo di legame di un inibitore ad un enzimaun enzima

Legame del repressore Lac al DNALegame del repressore Lac al DNA

http://biophys.roma2.infn.it/BiophysicsGroup.htmlhttp://biophys.roma2.infn.it/BiophysicsGroup.html

Silvia Morante

Giancarlo RossiStefania

Alleva Velia Minicozz

i

Francesco

Stellato

Alessandro

Maiorana

GRAZIE!GRAZIE!