Riv Ital Med LabDOI 10.1007/s13631-014-0054-2

A RT I C O L O O R I G I NA L E

Appropriatezza della ricerca di cloni EPN nel sangue periferico

Appropriateness of PNH clones search in peripheral blood

Vittorio Emanuele Muccio · Elona Saraci · Milena Gilestro · Daniela Oddolo ·Simona Angela Caltagirone · Mario Boccadoro · Paola Omedé

Ricevuto: 6 dicembre 2013 / Accettato: 17 gennaio 2014© Springer-Verlag Italia 2014

Riassunto Premesse. L’emoglobinuria parossistica nottur-na (EPN) è un disordine ematologico raro caratterizza-to da anemia emolitica, trombosi e difetti dell’ematopo-iesi. Tale patologia è dovuta a una mutazione somaticadel gene PIG-A che comporta la mancata produzione delglicosil-fosfatidil-inositolo (GPI), a cui si ancorano protei-ne di membrana quali CD55 e CD59 che inibiscono l’atti-vazione del complemento su diversi tipi cellulari. Dal 2010il nostro Laboratorio partecipa alla compilazione dell’archi-vio CLONEPnh. Integrando i dati in esso inseriti con quellicontenuti nell’archivio del nostro Laboratorio è stato valu-tato il cambiamento negli anni del numero di richieste diricerca del clone EPN e, in relazione a esso, come è variatoil numero dei nuovi cloni individuati.Metodi. È stata effettuata un’analisi citofluorimetrica a seicolori su sangue periferico, di pazienti afferenti alla Divi-sione Universitaria di Ematologia dell’Azienda OspedalieraCittà della Salute e della Scienza di Torino, utilizzando ilFLAER (tossina batterica inattivata) e i seguenti anticorpi:CD45, CD14, CD33, CD66, CD55, CD59, CD235a. I cam-pioni sono stati acquisiti con citofluorimetro FACSCantoII eanalizzati con il software FACS Diva. I dati sono stati inseritinell’archivio CLONEPnh (www.CLONEPnh.com).Risultati. Dai dati inseriti nell’archivio CLONEPnh si evin-ce che le richieste di ricerca di EPN sono state 13 nel 2010,16 nel 2011, 28 nel 2012 e 12 nei primi sei mesi del 2013e i cloni individuati sono stati, rispettivamente, 1, 0, 1 e 1.

V.E. Muccio · E. Saraci · M. Gilestro · D. Oddolo ·S.A. Caltagirone · M. Boccadoro · P. OmedéDivisione Universitaria di Ematologia, Città della Salute e dellaScienza di Torino, Torino, Italia

V.E. Muccio (B)Via XXV Aprile 24, 80017 Melito di Napoli (NA), Italiae-mail: vittorio.muccio@alice.it

Un andamento simile, anche se con un numero decisamen-te minore di analisi richieste, è stato riscontrato anche neglianni precedenti (dal 2000) analizzando l’archivio del nostroLaboratorio.Conclusioni. I nostri dati mostrano un aumento negli anni dianalisi effettuate, a cui, però, non è corrisposto un aumentodei cloni individuati.L’aumento delle richieste si può giustificare considerandoche la diagnosi di EPN è diventata prevalentemente citofluo-rimetrica e che le recenti linee guida consigliano, in pazienticon displasie midollari, di ricercare e monitorare cloni dimodesta entità mediante la metodica ad alta sensibilità.Tuttavia, per ridurre il costo in termini di tempo e risorse, sa-rebbero auspicabili l’elaborazione e la validazione di proto-colli citofluorimetrici più rapidi con l’utilizzo di un pannelloridotto di reagenti.

Parole chiave Emoglobinuria parossistica notturna · EPN ·Appropriatezza · Citofluorimetria

Summary Background. Paroxysmal nocturnal haemoglobin-uria (PNH) is a rare haematological disease characterizedby haemolytic anaemia, thrombosis and bone marrow fail-ure. This malignancy arises by somatic mutations of PIG-A gene resulting in a partial or absolute deficiency of cellmembrane proteins linked to glycosylphosphatidylinositol(GPI), as CD55 and CD59, involved in the control of com-plement activation. Since 2010 our laboratory has been par-ticipating to the update of the CLONEPnh archive. The dataof internal and CLONEPnh archives were merged in orderto compare the number of patients positive for PNH cloneto the number of samples analyzed.Methods. All peripheral blood samples, of patients admit-ted to the University Division of Haematology of AziendaOspedaliera Città della Salute e della Scienza di Torino,

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were stained using FLAER (inactivated bacterial toxin) anda combinations of six monoclonal antibodies: CD45, CD14,CD33, CD66, CD55, CD59, CD235a. The samples were ac-quired on FACSCanto II flow cytometer and analyzed withFACS Diva software. The data were reported in CLONEPnharchive (www.CLONEPnh.com).Results. The data of CLONEPnh archive show that the anal-ysis carried out were: 13 in 2010, 16 in 2011, 28 in 2012 and12 in first six months of 2013 and new PNH clones detectedwere 1, 0, 1 and 1 respectively. The data of our internalarchive show a similar trend, with fewer analysis performed,also in previous years (since 2000).Conclusions. Our data show a stable number of PNH clonesdetected despite an increased number of analysis performed.The essential role of flow cytometry in diagnosis of PNHand the guidelines indication, about search and monitor-ing of small PNH clones with high sensitivity flow cytometrymethod, could explain this trend.However, for a better use of economical resources, fasterand less expensive flow cytometric protocols must be devel-oped and validated.

Keywords Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria · PNH ·Appropriateness · Flow cytometry

Introduzione

L’emoglobinuria parossistica notturna (EPN o PNH) è un di-sordine raro dell’emopoiesi che colpisce in ugual misura siauomini sia donne di età compresa prevalentemente tra i 20 ei 40 anni. Tale patologia è causata da una mutazione soma-tica del gene PIG-A, che comporta un’alterata produzionedel glicosil fosfatidil inositolo (GPI), a cui consegue un de-ficit parziale (PNH II) o totale (PNH III) delle proteine dimembrana GPI-linked su eritrociti, leucociti e piastrine [1].

Le proteine GPI-linked importanti nella diagnosi nonchénella patogenesi dell’EPN sono riportate nella Tabella 1.

In particolare, il deficit di CD55 e CD59 sugli eritroci-ti è responsabile della loro emolisi e quindi del segno cli-nico distintivo. Tali proteine, infatti, inibiscono l’attivazio-ne del sistema del complemento in due fasi diverse comesemplificato nella Fig. 1 [2].

L’EPN è una malattia cronica, progressiva e debilitanteche, se non trattata, porta a morte il 35% dei pazienti in5 anni [3]. Dal punto di vista clinico l’EPN si caratterizzaper anemia, trombosi in siti inusuali, malfunzionamento delmidollo osseo, ematuria intermittente e altri segni che so-no conseguenza più o meno diretta dell’emolisi massiva [1].Dal punto di vista epidemiologico mancano dati certi, ma èstata stimata un’incidenza di 4-5/1.000.000 casi l’anno e unaprevalenza in 15 anni di 15,9 casi su 1.000.000 [4–7]. Que-sti dati cambiano, però, in particolari popolazioni di pazienti

Tabella 1 Proteine GPI-linked presenti sulle diverse popolazionicellulari valutate nell’ambito della ricerca di un clone EPN

Eritrociti Granulociti neutrofili Monociti

CD55 CD55 CD55

CD59 CD59 CD59

CD16 CD14

CD157 CD157

CD66b

CD24

Fig. 1 Attività inibitoria del CD55 e del CD59 nella cascata delcomplemento

ematologici. Infatti, è stato osservato che cloni di esigua en-tità, evidenziabili con la metodica citofluorimetrica ad altasensibilità, sono presenti nel 60% dei pazienti con anemiaaplastica e nel 20% dei pazienti con sindromi mielodispla-stiche [8]. La diagnosi di EPN è prevalentemente citofluori-metrica, poiché con questa metodica si riesce a dimostrare ildeficit parziale o totale delle proteine GPI-linked sulle diver-se popolazioni cellulari, come indicato dalle linee guida perla ricerca di cloni EPN in routine [9] o con la metodica adalta sensibilità [10]. La diagnosi di EPN si basa sull’eviden-te emolisi non altrimenti giustificata (elevati livelli di LDH,elevato numero di reticolociti, anemia) e sulla dimostrazionecitofluorimetrica del deficit parziale o totale di almeno dueproteine GPI-linked in almeno due popolazioni cellulari tramonociti, granulociti ed eritrociti. La terapia è sintomaticae prevede: trasfusioni, eritropoietina, anticoagulanti ed ecu-lizumab (anticorpo monoclonale che blocca la proteina C5del complemento). Attualmente, però, soltanto il trapiantodi midollo osseo permette di guarire da tale patologia. Laprognosi dipende dalla severità e dalla frequenza delle crisiemolitiche, dalle trombosi e dal deficit emopoietico [1].

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Fig. 2 Paziente con clone PNH florido caratterizzato da deficit parziale (PNH II) o totale (PNH III) di molecole GPI-linked su neutrofili (A),monociti (B) ed eritrociti (C)

Materiali e metodi

È stata effettuata un’analisi citofluorimetrica a sei colo-ri su sangue periferico, di pazienti afferenti alla DivisioneUniversitaria di Ematologia dell’Azienda Ospedaliera Cit-tà della Salute e della Scienza di Torino, utilizzando latossina batterica inattivata FLAER (IQ Products Gronin-gen, Netherlands) e i seguenti anticorpi monoclonali: CD45,CD14 (Becton Dickinson Biosciences, San Josè, Califor-nia), CD33 (Beckman Coulter Inc., Brea, California), CD66,CD55, CD59 (Invitrogen, Carlsbad, California), CD235a(Dako, Glosdrup, Denmark).

Il FLAER si lega al GPI e consente di identificare inmodo specifico la sua presenza o assenza.

Per studiare le molecole GPI-linked su monociti e neu-trofili, 100 µL di sangue periferico sono incubati al buio e atemperatura ambiente (TA) con un’opportuna quantità di an-ticorpi per 15 minuti. In seguito i globuli rossi sono lisati conl’aggiunta di 3 mL di NH4Cl 1M con cui sono stati incubatial buio per 10 minuti a TA. Infine, l’eccesso di anticorpi chenon ha reagito viene rimosso mediante aggiunta di soluzionesalina (Phosphate Buffered Saline, PBS) e centrifugazione.

Per studiare le molecole GPI-linked sugli eritrociti, un’a-liquota di sangue intero è diluita 1:100 in PBS, 20 µL dialiquota diluita sono stati incubati con un’opportuna quanti-

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Fig. 3 Paziente con esiguo clone PNH caratterizzato da deficit parziale (PNH II) o totale (PNH III) di molecole GPI-linked su neutrofili (A),monociti (B) ed eritrociti (C)

tà di anticorpi, mantenuti al buio per 15 minuti a TA, lavatidue volte in PBS e acquisiti.

I campioni sono stati acquisiti con citofluorimetroFACSCantoII e analizzati con il software FACS Diva (Bec-ton Dickinson).

Tutti gli studi umani sono stati condotti conformementealle linee guida del nostro comitato etico e quindi confor-memente alle norme etiche stabilite dalla Dichiarazione diHelsinki del 1864.

I dati sono stati inseriti nell’archivio CLONEPnh (www.CLONEPnh.com).

Risultati

Il CD45, il CD33 e il CD235a sono stati utilizzati come trac-cianti per selezionare, rispettivamente, neutrofili, monocitied eritrociti su cui è stata valutata l’espressione delle rispet-tive molecole GPI-linked al fine di rilevare la presenza diun clone EPN. Nella Fig. 2 è riportato un campione con unclone EPN florido. Mediante il CD45 sono stati selezionatii granulociti neutrofili e su questi sono state evidenziate lepopolazioni PNH II e PNH III caratterizzate dal deficit delCD66, CD59 e FLAER (Fig. 2A). I monociti sono stati sele-

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Fig. 4 Andamento delle analisidi ricerca di cloni EPN dal 2010ai primi sei mesi del 2013

Fig. 5 Andamento delle analisidi ricerca di cloni EPN dal 2000ai primi 6 mesi del 2013

Tabella 2 Analisi effettuate dal 2000 ai primi sei mesi del 2013 e loroesito

Esami eseguiti Positivi Nuovi cloni individuati

2000 7 1 1

2001 3 0 0

2002 9 1 1

2003 3 0 0

2004 5 0 0

2005 10 1 1

2006 3 1 1

2007 16 1 1

2008 16 3 3

2009 21 2 1

2010 13 1 1

2011 16 0 0

2012 28 1 1

06/2013 12 2 1

zionati mediante CD33 ed è stata evidenziata una popolazio-ne PNH III caratterizzata dal deficit totale di CD14, CD59 eFLAER (Fig. 2B). Con il CD235a sono stati selezionati glieritrociti e tra questi sono state evidenziate una popolazionePNH II e PNH III una popolazione in base all’espressionedel CD59 e del CD55 (Fig. 2C).

Nella Fig. 3, invece, è riportato un campione con un cloneEPN di esigua entità analizzato con la medesima strategiadescritta in precedenza. La popolazione PNH III rappresentameno dello 0,3% dei neutrofili, lo 0,6% dei monociti e lo0,05% degli eritrociti (Fig. 3A, B, C).

I dati raccolti nel registro CLONEPnh dal 2010 fino aiprimi sei mesi del 2013 mostrano un graduale incrementodel numero di esami eseguiti senza un aumento dei nuovicloni individuati (Fig. 4).

Analizzando i dati del database del nostro Laboratorioe CLONEPnh è stato possibile valutare l’andamento delleanalisi di ricerca di clone EPN dal 2000 e appare eviden-te un graduale aumento delle analisi effettuate a cui non ècorrisposto un aumento dei nuovi cloni individuati (Tab. 2 eFig. 5).

Per meglio valutare l’andamento nel tempo delle analisieffettuate e dei nuovi cloni individuati, i dati ottenuti sonostati raggruppati in trienni. Dal grafico ottenuto, appare evi-dente un notevole incremento delle analisi effettuate dopo il2005 (Fig. 6).

Discussione

Uno degli obiettivi che la Medicina di Laboratorio si pone èincrementare l’appropriatezza della richiesta di esami al finedi ridurre la spesa e aumentare l’efficacia di un test. La defi-nizione di appropriatezza è notevolmente variata negli anni.Infatti, si è passati dalle prime definizioni degli anni ’70,secondo cui era appropriato utilizzare le conoscenze acqui-site disponibili purché mirate al raggiungimento della salutedel paziente, alle più recenti definizioni secondo cui l’appro-priatezza deve essere valutata misurando gli effetti che i testeseguiti hanno sugli esiti rilevanti per i pazienti [11].

Interventi di riorganizzazione e razionalizzazione dellerisorse operati sulle strutture impegnate in campo diagno-stico sviluppano una crescente pressione mirata all’esecu-

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Fig. 6 Analisi di ricerca dicloni EPN e loro esitiraggruppati in trienni dal 2000ai primi sei mesi del 2013

zione di analisi che abbiano un’utilità reale nella gestionedel paziente. Per raggiungere tali obiettivi, un grosso aiutoderiva dall’Evidence-Based Laboratory Medicine (EBLM)che, partendo da valutazioni critiche di dati raccolti anche incontesti di ricerca, definisce criteri per eseguire in modo ap-propriato determinate indagini nella diagnosi o nel monito-raggio di diverse patologie. Il fine ultimo dell’applicazionedell’EBLM è l’elaborazione di linee guida condivise con iclinici che permettano di eseguire esami che diano una realerisposta al quesito specifico.

Per quanto riguarda la ricerca di cloni EPN, le linee guidadel 2010 indicano che è opportuno ricercare un clone EPN incaso di: emolisi intravascolare evidenziata da emoglobinu-ria o da elevata emoglobina plasmatica; evidenza di emolisinon altrimenti giustificata accompagnata a carenza di fer-ro o dolore addominale o spasmi esofagei o granulocitope-nia e/o trombocitopenia; altre anemie emolitiche Coombs-negative, con assenza di schistociti, non infettive; trom-bosi con caratteristiche inusuali; o evidente insufficienzamidollare [9].

Seguendo le linee guida, quindi, i casi in cui è ritenutoappropriato ricercare un clone EPN sono numerosi, soprat-tutto se si considera il numero di pazienti che afferiscono aun reparto di ematologia per citopenie o sospette displasiemidollari.

Dai dati raccolti nel nostro Laboratorio e riportati nellaFig. 5 appare chiaro che negli anni c’è stato un graduale au-mento degli esami effettuati, a cui non è corrisposto, però,un aumento dei cloni EPN individuati. Le richieste di anali-si, tuttavia, erano da considerarsi tutte appropriate. Infatti, lecondizioni cliniche, riportate dai medici sulla richiesta, rien-travano tra quelle che le linee guida indicano come opportu-ne per la ricerca di un clone EPN. Inoltre, dai dati ottenutinel nostro studio, si evince una notevole attenzione da partedei clinici verso l’EPN e le linee guida che ne indicano lagestione. Infatti, la Fig. 6 mostra un aumento notevole dellerichieste dopo il 2005, anno in cui sono state pubblicate leprime indicazioni sulla diagnosi e sulla gestione dell’EPNin cui si poneva l’accento sull’utilità diagnostica della cito-fluorimetria [12]. L’importanza sempre crescente che questametodica riveste nell’EPN può motivare il costante incre-mento delle richieste di analisi negli anni. Inoltre, le poten-zialità mostrate dalla metodica citofluorimetrica ad alta sen-

sibilità nell’individuare anche cloni di esigua entità dannonuovo risalto a dati pubblicati alcuni anni addietro. Infatti,alcuni gruppi avevano riscontrato la presenza di cloni di esi-gua entità nel 60% dei pazienti con anemia aplastica e nel20% dei pazienti con sindromi mielodisplastiche [8, 13] eche tali cloni predicono una risposta efficace al trattamentocon immunosoppressori [14]. Alla luce di queste considera-zioni e delle indicazioni delle linee guida circa la necessitàdi monitorare semestralmente anche cloni di ridotta entità,si può prevedere un ulteriore incremento delle richieste diricerca di cloni EPN negli anni a seguire. Pertanto, sarà ne-cessario confrontarsi con i clinici per valutare la reale utilitàdel riscontro di cloni di esigua entità in particolari gruppi dipazienti. Inoltre, al fine di ottimizzare le risorse e concentra-re la propria attenzione su pazienti realmente a rischio, sarànecessario elaborare e validare pannelli citofluorimetrici piùrapidi e con un numero ridotto di reagenti. Una prima fasedi screening potrebbe prevedere l’allestimento di una singo-la provetta a quattro colori contenente il CD45 o il CD15, ilCD33, il FLAER e il CD157. Quest’ultima è una molecolaGPI-linked, che recentemente è apparsa molto efficace nellaricerca di un clone EPN sui monociti e sui granulociti neu-trofili [15]. Qualora fosse evidenziato un clone, sarà neces-sario valutare la sua presenza nella popolazione eritrocitariae verificare la carenza di altre molecole GPI-linked sui leu-cociti. La ricerca di un clone EPN tra gli eritrociti può essereeseguita in un secondo momento perché, generalmente, ta-le clone è di dimensioni più ridotte di quello evidenziabilesui leucociti sia per la costante emolisi, sia per la presenzadi eritrociti trasfusi che possono nascondere la popolazionepatologica [12].

Conflitto di interessi Nessuno.

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