APPLICAZIONI DEIRADIONUCLIDI METALLICI

NELL’IMAGING DIAGNOSTICO ENELLA TERAPIA DEI TUMORI

Ulderico Mazzi-Dipartimento di Scienze Farmaceutiche,

- Università di Padova

Tecniche di Imaging DiagnosticoSPECT (Single Photon Emission Computed Tomography)Radiofarmaco: Tc-99m-HMPAO

Immagini transassiali del cervello: a sinistra flusso sanguigno normale;a destra area frontale sinistra priva di flusso per emorragia sub-aracnoidale

Tecniche di Imaging DiagnosticoPET (Positron Emission Tomography)

www.med.harward.edu/AANLIB/home.html

Combinazione PET/TAC

Effetto Crossfire

- La Radioterapia utilizza le proprietàionizzanti delle radiazioni perdistruggere le cellule ovvero perbloccare la riproduzione e/o la crescitacellulare (in dipendenza dall’energia)

- Le radiazioni interagiscono con il DNAcon più alta probabilità di dannocellulare al momento della mitosi.Perciò il danno è maggiore sulle cellulead alta proliferazione (cellule tumorali)rispetto a quelle sane.

RADIOTERAPIA

32P 14.3 d β(1.71) 8.7 mm

67Cu 2.58 d β(0.54), γ(0.185) 1.8 mm

89Sr 50.5 d β(1.49) 8.0 mm

90Y 2.67 d β(2.28) 12.0 mm

105Rh 1.48 d β(0.57), γ(0.320) 1.9 mm

109Pd 13.6 h β(1.0) 4.6 mm

111Ag 7.47 d β(1.05), γ(0.34) 4.8 mm

125I 60.0 d Auger, γ(0.027) 10 nm

131I 8.04 d β(0.6), γ(0.364) 2.0 mm

153Sm 1.95 d β(0.8), γ(0.103) 3.0 mm

169Er 9.5 d β(0.34) 1.0 mm

177Lu 6.7 d β(0.497), γ(0.208) 1.5 mm

186Re 3.77 d β(1.08), γ(0.131) 5.0 mm

188Re 16.95 h β(2.13), γ(0155) 11.0 mm

198Au 2,7 d β(0.97), γ(0.411) 4.4 mm

211At 7.2 h α(6.8) 65 µm

212Bi 1.0 h α(7.8), g(0.72) 70 µm

PROPRIETA’ FISICHE DI RADIONUCLIDI CON EFFICACIATERAPEUTICA (β− ed α emettitori)

Radionuclidi Emivita Fisico Decadimento(MeV) Massimo Rangein tessuto molle

Radionuclidi di elementi non-metallici: Elementi radioisotopiIodio 123, 124, 125, 131carbonio 11Azoto 13Ossigeno 15Fluoro 18ecc.

I radioisotopi di elementi non metallici, usualmente "marcano" la biomolecola attraversoun semplice legame covalente.

Radionuclidi di elementi metallici: Elementi radioisotopiTecnezio 99m, 94mRenio 186, 188Gallio 67, 68Indio 111, 114mecc.

I radioisotopi di elementi metallici, quando non sono utilizzati come ioni liberi, per"marcare" molecole, dette "leganti", formano i così detti "complessi di coordinazione”

Traccianti radioattivi

Complessi di coordinazione

La formazione di un complesso di coordinazione implica la reazione trauna specie di partenza contenente il radionuclide (precursore) e (il o) ileganti che stabilizzano il complesso in una definita struttura, con ilmetallo in un ben preciso stato di ossidazione.

E' da ricordare che ogni complesso può subire reazioni di sostituzionedei suoi leganti con altri con cui viene in contatto e che, in linea diprincipio, ogni gruppo funzionale a carattere nucleofilo presente nellemolecole biologiche può agire da "legante".

O12

C11C31

O32

C21O22 S41

S42

C43N44

C46

C45

C52

C53

C54

C55

C56

C51C61

C66

P

Re

C65

C62

C63

C64

C71

C72

O74

C73

N75C76

C77

O79

C78

O80

C81

Rh-Annexin V

- Il radiofarmaco marcato con un radionuclide metallico per poter essere utilizzato invivo deve essere sufficientemente stabile da non subire alterazioni nella sua struttura,almeno fino alla fine del suo impiego clinico: solo così si può avere la certezza dellarelazione struttura-biodistribuzione.

La stabilità può essere termodinamica o cinetica o, ancora meglio, entrambe.

- Il comportamento biologico del radiofarmaco marcato con un radionuclidedi tipo metallico è essenzialmente dipendente dalla struttura e dalleproprietà chimiche del “complesso” che sono del tutto diverse da quelle deisuoi componenti! (Radiofarmaci essenziali)

Alcuni radiofarmaci essenziali subiscono delle alterazioni una volta iniettati in vivo, maesse devono essere comunque funzionali all'uptake ( vedi agenti di perfusione cerebralemarcati con Tc-99m) e molto limitate (senza completa decomposizione del complesso)

-Bisogna tener conto anche del fatto che la maggior parte dei radionuclidiutilizzati in medicina nucleare sono "carrier free" o "non carrier added".Questo significa che la massa del radionuclide è trascurabile e che il numerodei suoi atomi utilizzati in una reazione di marcatura sono molto pochirispetto a tutte le specie (legante, riducente, etc.) presenti nella fiala diiniezione. Il risultato è che il numero di molecole marcate iniettate sonopercentualmente molto inferiori a quelle della specie non marcata.

RADIOFARMACI ESSENZIALI

-Se si considerano i radiofarmaci essenziali, la presenza di grandi quantitàdi molecole non marcate non porta alla saturazione dei siti specifici per ilradiofarmaco, perché il legante ha un comportamento del tutto diverso dalcomplesso contenente il radiometallo.

-Se invece si considerano i radiofarmaci target specifici, labiomolecola non marcata può saturare il sito specifico equindi inibire la fissazione dell'attività sul target.

-Diventa pertanto importante ridurre al minimo la quantità di legante coniugato allabiomolecola per ottenere una alta attività specifica, perchè più alta è l'attivitàspecifica, più alta sarà la fissazione del radiotracciante sul target specifico.

-La quantità di legante necessaria per ottenere una alta resa di marcatura dipendedalla stabilità termodinamica del complesso. Maggiore è la costante (Kf) diformazione del complesso, minore sarà la quantità di legante(i) necessaria perottenere alta resa di marcatura e quindi alta attività specifica.

Quanto detto vale per tutti iQuanto detto vale per tutti i radionuclidiradionuclidi di tipo metallicodi tipo metallicosenzasenza carriercarrier aggiunto.aggiunto.

-La differenza tra i vari radiometalli sta nelle loro diverseproprietà chimiche di coordinazione.

RADIOFARMACI TARGET SPECIFICI

Radiofarmaci marcati con 99mTc

Il Tecnezio-99m è il radionuclide largamente più utilizzato in MedicinaNucleare per un notevole numero di indagini cliniche,oltre che per la sua facilità di approvvigionamento e per le sue idealiproprietà nucleari, soprattutto per la sua duttilità e flessibilità chimica.

Il tecnezio può avere ben nove stati di ossidazione possibili, dal +7 al –1,e varie geometrie, dalla pentacoordinazione alla eptacoordinazione, ediversi gruppi centrali, Tc=O3+, O=Tc=O+, Tc≡N2+, etc..Un notevole numero di gruppi funzionali di vario tipo, compresi i gruppichelanti, possono circondare i diversi gruppi centrali del tecnezio incomplessi stabili; molti di questi sono anche presenti nelle biomolecole(esempio peptidi, proteine). Altri, come i gruppi fosfinici, idrazinici, e, peri bassi stati di ossidazione, isonitrili o ossido di carbonio sono aggiuntialla biomolecola o agiscono da co-leganti.

A differenza degli altri radionuclidi di tipo metallico, per ottenere speciemarcate il tecnezio-99m, come pure i radioisotopi di renio, deve essereridotto dallo stato di ossidazione + 7 ad uno stato più basso, in genere+5 o +3 o +1.

PECULIARITA’ DEL TECNEZIO e del Renio

TcO4-

TcO2

1 2 3

4

Reazione

di riduzione

Coordination

reaction

Substitution

reaction

Reazione di

coniugazione

Reazione di sostituzione su

un sistema chelato già

conjugato alla biomolecola

99mTc

99mTc

-99m

Tc-complesso

in un precise stato

di ox e gruppo centr.

- comp. Pre ridotto.

Specie ridotta di

99mTc adatta

per la

complessazione

99m Tc-RADIOPHARMACEUTICAL 99m Tc-RADIOPHARMACEUTICAL

99m Tc-RADIOPHARMACEUTICAL

or Ligand

exchange

(Soluzione fisiologica da generatore)

Compostomarcato con

Molecolabioattivamarcata con

Analoghi dell’octreotide per la marcatura con 99mTc

Somatostatina

� Peptide Regolatore� Inibitore della secrezione di numerosi ormoni� Cinque sottotipi (sst1-sst5) sono espressi da

tumori umani

Breve emivitaPoca selettività per diversi sottotipi

Derivati dell’octreotide

� Migliori proprietà farmacocinetiche

� Selettività per sst2 e sst5

� Sono stati marcati con diversi radionuclididi tipo metallico come:111In, 68Ga, 64Cu, 178Lu etc.

VapreotideVapreotide®®

H2NOC

HO CH3

HN

ONH

SS

ONH

NH

NH2

HN

O

NHO

HN

O

H2N

OO

NHH

H

OH

OctreotideOctreotide®®

LanreotideLanreotide®®

HO

HO CH3

HN

ONH

SS

ONH

OH

NH

NH2

HN

O

NHO

HN

O

H2N

OO

NHH

H

HN

ONH

SS

ONH

NH

NH2

HN

O

NHO

HN

O

H2N

OO

NHH

HHOOC

NH

OH

VapreotideVapreotide®®

H2NOC

HO CH3

HN

ONH

SS

ONH

NH

NH2

HN

O

NHO

HN

O

H2N

OO

NHH

H

OH

OctreotideOctreotide®®

LanreotideLanreotide®®

HO

HO CH3

HN

ONH

SS

ONH

OH

NH

NH2

HN

O

NHO

HN

O

H2N

OO

NHH

H

HN

ONH

SS

ONH

NH

NH2

HN

O

NHO

HN

O

H2N

OO

NHH

HHOOC

NH

OH

SerieSerie didi DicarbaDicarba--Analoghi dellAnaloghi dell’’octreotideoctreotide

�� aumentata stabilitaumentata stabilitàà in vivoin vivo rispettorispetto agliagli agentiagenti redoxredox

�� aumentata stabilitaumentata stabilitàà nellenelle procedure diprocedure di marcaturamarcatura concon 99m99mTc eTc e 188188ReRe

�� RitenzioneRitenzione della regione farmacoforadella regione farmacofora ββ--turnturn tipotipo IIII’’,,

HO

HO CH3

HN

O

NH

O

R

NH

NH

NH2

HN

O

NH

R'

O

HN

O

H2N

O

O

NHH

H

E. Zangoni, D. D'addona, A. Di Cianni, L. Melendez Alafort, A. Carrer, P. Erba, M. Ginanneschi, G. Mariani, U. Mazzi. Tc-99m andRe-188 labelling approaches of the new octreotide analogues free from disulphide bridge with high affinity for SSTR expressingtumors. 14th European Symposium on Radiopharmacy and Radiopharmaceuticals ESRR'08. Skopje, Macedonia, April 24-27, 2008E

Metodologie di Marcatura di Dicarba-AnaloghiSstSst analoghi sono stati modificatianaloghi sono stati modificati allall’’NN..amminoammino terminaleterminale

introducendo il set coordinativo PNintroducendo il set coordinativo PN22SS

Marcatura di 99mTcOxo

70 µg peptide (2) in EtOHNa-GluconatoSnCl240 µl 99mTcO4

- in salina (∼37 MBq)pH = 3.530 minuti a 70°C

OO

M

PhPh

PeptideN

P

N

SOPh

Ph

M= 99mTc, 188Re

OO

M

PhPh

PeptideN

P

N

SOPh

Ph

OO

M

PhPh

PeptideN

P

N

SOPh

Ph

M= 99mTc, 188Re

L’Analisi RP-HPLC mostra alte rese di marcaturama non la produzione di un singolo composto

IsolinkTM

Tyco-Healthcare Mallinckrodt

[99mTcO4]- 99mTc

CO

H2O

CO

H2O

C O

+

Na-K-tartrate1 atm CO

30 min, 75°C

0,9%NaClNaBH 4, Na 2CO3

H2O

K2[H3BCO2]

IsolinkTM

Tyco-Healthcare MallinckrodtIsolinkTM

Tyco-Healthcare Mallinckrodt

[99mTcO4]- 99mTc

CO

H2O

CO

H2O

C O

+

Na-K-tartrate1 atm CO

30 min, 75°C

0,9%NaClNaBH 4, Na 2CO3

H2O

[99mTcO4]- 99mTc

CO

H2O

CO

H2O

C O

+

Na-K-tartrate1 atm CO

30 min, 75°C

0,9%NaClNaBH 4, Na 2CO3

H2O

K2[H3BCO2] [2+1][2+1] mixedmixed ligandligand approachapproach

M

CO

DD

D

OC CO

Peptide

M

CO

DD

D

OC CO

Peptide

M

CO

DD

D

OC CO

Peptide

Peptide

P

Ph99mTc

CO

OC

SS

(CH3)2N

CO

Ph

Peptide

P

Ph99mTc

CO

OC

SS

(CH3)2N

CO

Ph

Peptide

P

Ph99mTc

CO

OC

SS

(CH3)2N

CO

Ph

min2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Area:

97.8

803

7.4

45

Area:

7089

.57

9.4

95

Area:

128.

495

11

.10

9

��Il rapporto molareIl rapporto molarePeptidePeptide/MDTC deve/MDTC deve

essere 1/5essere 1/5

��Resa di marcaturaResa di marcatura > 97%> 97%

(SS)(P) complex

Metodologie di Marcatura di Dicarba-Analoghi

•HA polisaccaride lineare (GlcUA e GlcNAc), componentedella matrice extracellulare,si trova nei fluidi sinoviali, enelle giunture e tra i supporti cartillaginei.

•HA affine ai recettori CD44 sovraespressi in molti tumorimaligni umani

•Oligomeri di HA sono dei buoni costrutti per materialibiocompatibili e biodegradabili perchè sono immunoneutri

188Re-HA Acido Ialuronico

60 µL of a 0.1M SnCl2solution

188Re-HA

100 µL 188ReO4-

( 20 MBq)

188Re-HA

+ +

IncubationpH 4 , 65 oC, 90 min

PurificationHi- trap desalting column

R.P. 90%

1 mg of Hyaluronic Acid (HA)

L. Meléndez-Alafort, E. Zangoni, A. Banzato, D. Renier, G. Moschini, A. Antoccia, C. Tanzarella, A. Rosato, U. Mazzi. 188Re-HA: apotential new agent for the radiation therapy of hepatocellular carcinoma. 14th European Symposium on Radiopharmacy andRadiopharmaceuticals ESRR'08. Skopje, Macedonia, April 24-27, 2008

C57BL/6 mice

inoculation20000 cells

M5076

4 days

****

7.4 MBqNegativecontrol

Positivecontrol

12.6 MBq0

1

2

3

4

5

Wei

ght

(g)

***

SpleenLiver

* p < 0.05 vs positive control* p < 0.05 vs negative control

12.6 MBq188Re-HA

Notreatment

7.4 MBq188Re-HA

High dose 188Re-HA effect

Sacrificed 18 days after tumor induction

20,000 M5076 i.v.4 day treatment

Day 18 aftertumor injection

7.4 MBq 12.6 MBq

Untreated

High dose 188Re-HA effect

C57BL/6 mice

inoculation50000 cells

M5076

7 days

4.4 MBq188Re-HA

Notreatment

2.2 MBq188Re-HA

Medium dose 188Re-HA effect

Sacrificed 21 days after tumor induction

2.2 MBq 4.4 MBq

**

* p < 0.05 vs positive control* p < 0.05 vs negative control

Wei

ght

(g)

0

1

2

3

4

5

Negativecontrol

Positivecontrol

**

SpleenLiver

Medium dose 188Re-HA effect

50,000 M5076 i.v.7 day treatment

Day 18 aftertumor injection

Untreated

2.2 MBq4.4 MBq

inoculation300 cellsM5076

15 days

Notreatment

2.2 MBq188Re-HA

2.2 MBq 188Re-HA 2.2 MBq188Re-HA

3.7 MBq188Re-HA

15 days

1 treatment at day 15

p=0.0047

3,70 MBq

2,78 MBq

Positive Control

100

80

60

40

20

025 30 35 40 45 50 55

Time (days)

Surv

ival

prob

abili

ty(%

)

2 treatments at day 15 and 30

Time (days)

p=0.0004

2.78 MBq

Positive Control

p=0.0020

30 32 34 36 38 40 42 44

100

80

60

40

20

0

1 treatment at day 15

p=0.0047

3,70 MBq

2,78 MBq

Positive Control

100

80

60

40

20

025 30 35 40 45 50 55

Time (days)

Surv

ival

prob

abili

ty(%

)

2 treatments at day 15 and 30

Time (days)

p=0.0004

2.78 MBq

Positive Control

p=0.0020

30 32 34 36 38 40 42 44

100

80

60

40

20

0

Survival

RingraziamentiDipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Padova.L. Melendez-Alafort, E. Zangoni, U. Mazzi

Dept. of Organic Chemistry, University of Florence, ItalyD. D’Addona, A. Di Cianni, M. Ginanneschi

Regional Centre of Nuclear medicine, University of Pisa, ItalyP. Erba, C. Manfredi, G. Mariani

Dipartimento di of Scienze Oncologiche e Chirurgiche, Università of Padova.A. Banzato, M. Rondina, A. Rosato

Dipartimento di Fisica, Università di Padova, Laboratori nazionali Legnaro (LNL),INFN, Padova.M. Bello, N. M. Uzunov, P. Boccaccio, G. Moschini

Dipartimento di Biologia, Università di Roma Tre, Roma.A. Antoccia, C. Tanzarella

Dipartimento di Ingegneria Elettronica, Università di Roma Tre, Roma.F. De Notaristefani